腐爛阿克蘇紅富士蘋果中毒素的檢測方法與遷移規(guī)律的研究

吳思雅，姜 楠，韋迪哲，龐學(xué)群， 朱 璇

（1.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)分院，新疆烏魯木齊 831499；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究中心，北京 100097；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

蘋果被譽為世界四大水果之一，其主要特點是富含多種微量元素，營養(yǎng)價值高，屬薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus）。紅富士蘋果自引入我國以來，在多地得到廣泛種植，目前已經(jīng)成為我國主要栽培和出口品種，其中以新疆阿克蘇紅富士果肉脆而多汁、味道芳香爽口較為著名。阿克蘇位于新疆天山南麓，地處塔里木盆地北緣，土地肥沃、日照時間長、晝夜溫差大，因此新疆阿克蘇紅富士蘋果含糖量高、果品優(yōu)質(zhì)[1]，同時阿克蘇也被譽為“中國紅富士之鄉(xiāng)”。目前，我國蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展已經(jīng)從世界蘋果生產(chǎn)大國轉(zhuǎn)變?yōu)樘O果產(chǎn)業(yè)強(qiáng)國，其中以紅富士種植為代表的阿克蘇地區(qū)蘋果年產(chǎn)量超5 000 萬t，種植面積約13.33 khm2。同時，進(jìn)一步提高產(chǎn)量、穩(wěn)定規(guī)模、提高果品仍是急需解決的現(xiàn)實課題，當(dāng)前還存在技術(shù)落后的問題，一是對蘋果上市時間控制不足、出現(xiàn)供需不一致現(xiàn)象，導(dǎo)致時常出現(xiàn)淡季蘋果供應(yīng)不足、旺季滯銷的現(xiàn)象；二是對病原微生物的防治不力，從蘋果生長、采收到貯藏的各個過程，都容易出現(xiàn)果品受到病原微生物污染的現(xiàn)象，尤其是在貯藏期間，這種現(xiàn)象最為嚴(yán)重。有研究發(fā)現(xiàn)，受到病原菌侵染的果蔬在貯藏過程中腐爛程度最為嚴(yán)重，并且危害人類健康。其中，鏈格孢和青霉是引起蘋果腐爛的主要病原菌，隨著采后貯藏期的延長，二者的代謝產(chǎn)物：鏈格孢霉毒素（Alternaria toxin，AT），展青霉素（Patulin，PAT）[2-3]，會加劇果實腐爛程度，并同時產(chǎn)生毒素[4-5]。

真菌毒素的檢測方法眾多，但各方法側(cè)重不一，傳統(tǒng)方式以薄層色譜法（Thin layer chromatography，TLC）為主，而目前主要以現(xiàn)代色譜法為主，如高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）及免疫分析方法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等，同時還有其他多種技術(shù)并存。根據(jù)阿克蘇紅富士主要感染霉菌類別，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）和高效液相色譜（HPLC）2 種方法，對蘋果中常見的6 種真菌毒素進(jìn)行聯(lián)合檢測，這種方式具有操作簡便、檢測快速、成本較低及精確度高的特點，是未來真菌毒素檢測方法的發(fā)展方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

使用蘋果為2015 年11 月采摘于阿克蘇紅旗坡鄉(xiāng)紅富士；鏈格孢毒素（AOH、AME、TeA、ALT、TEN）標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma 公司提供；展青霉素（PAT），Romer 公司提供；乙腈、甲酸、乙酸銨（色譜純），美國Fisher 公司提供；SPE 型自制柱管，北京市農(nóng)林科學(xué)院提供。

AcquityTM型超高效液相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜儀（TQS）；Water 1260 型高效液相色譜儀；電噴霧電離（ESI）接口，美國Waters 公司產(chǎn)品；通用臺式高速離心機(jī)，德國Sigma 公司產(chǎn)品；氮吹儀，美國Organomation 公司產(chǎn)品；渦旋混合器，德國IKA 公司產(chǎn)品；Mil li-Q A10 型超純水器，美國Millipore 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

挑選表面無機(jī)械損傷、無蟲害、大小均勻的蘋果果實，先用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液噴施蘋果表面后，無菌水擦拭，采用針刺法給已處理好的蘋果接種鏈格孢霉和擴(kuò)展青霉（孢子濃度為10-6mol/L），將接種后的蘋果果實置于常溫和低溫（溫度4 ℃，相對濕度95%）讓其發(fā)病，分別取病斑大小為0.5，1，2，3，4，5，6 cm 的果實組織和距離病斑1，2，3 cm 處的果實組織，液氮速凍成塊狀后分裝存放于-40 ℃超低溫冰箱中保存，測前取出研磨至粉末狀。

1.2.2 毒素樣品提取[6]

稱取蘋果樣品凍干粉5 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入檸檬酸2.5 mL，水2.5 mL，渦旋混勻，加入乙腈20 mL，以轉(zhuǎn)速150 r/min 常溫振蕩提取30 min 后，取出加入NaCl 2 g，渦旋混勻，隨后低溫離心（-10 ℃下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心10 min），取上清液1.5 mL 潤洗SPE 柱，取4 mL（2 次）自然通過SPE 柱到10 mL 離心管中，流出液于60 ℃條件下氮吹至近干，殘渣用乙腈300 μL，水700 μL 進(jìn)行溶解，混勻后過0.22 μm 微孔濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）測定。

1.2.3 儀器條件

（1）AT 色譜條件。色譜柱：Acquity CORTECS UPLC C18（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積為5 μL，流動相A 為水，流動相B 為乙腈；梯度洗脫條件為A 在99%保持1 min 后，3 min內(nèi)降至10%，保持0.5 min 后在0.1 min 內(nèi)升至99%，保持1.4 min，流速0.3 mL/min，總運行時間6 min。

（2）質(zhì)譜條件。離子源模式為正負(fù)離子模式（ESI+和ESI-），毛細(xì)管電壓2.5 kV（ESI+）和-1.5 kV（ESI-），氣化溫度400 ℃，去溶劑氣流速700 L/h，其余參數(shù)通過儀器自動調(diào)諧至最優(yōu)。

（3）PAT 色譜條件。色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫40 ℃，二極管陣列檢測器（PDA）檢測波長280 nm，進(jìn)樣量20 μL，流動相A 為水，流動相C 為乙腈；流動相洗脫條件為A 保持90%，C 保持10%，流速1 mL/min，總運行時間12 min。

1.2.4 毒素含量的測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)貯備液。用乙腈準(zhǔn)確定容鏈格孢霉毒素1 mg 和展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶，配成質(zhì)量濃度100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，密封冷凍儲存于-20 ℃冰箱中。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別配制50，100，200，500，1 000，5 000，10 000 μg/L 的AT（5 種）和PAT 標(biāo)準(zhǔn)液，密封保存于-20 ℃冰箱中。

（3）基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以不含真菌毒素的蘋果果實為材料，利用試驗前處理方法制備蘋果的基質(zhì)空白溶液。用基質(zhì)空白溶液將標(biāo)準(zhǔn)工作液按相同比例稀釋至1，2，5，10，50，100，200 μg/L，分別得到蘋果基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

用乙腈準(zhǔn)確定容1 mg 鏈格孢毒素和展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶，配成質(zhì)量濃度100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別稀釋為50，100，200，500，1 000，5 000，10 000 μg/L 的AT（5 種）和PAT 標(biāo)準(zhǔn)液，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Excel 統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)，計算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖；利用DPS 多重比較對差異顯著性進(jìn)行分析，p＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法

2.1.1 色譜條件

比較了水-甲醇、水-乙腈、乙酸銨溶液-甲醇、乙酸銨溶液-乙腈4 種流動相體系。結(jié)果表明，以水-乙腈作為流動相體系時6 種真菌毒素的離子信號值增強(qiáng)，且峰形得到明顯改善。

采用流動注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，分別在ESI+模式和ESI-模式下進(jìn)行全掃描，確定鏈格孢酚甲醚（AME）和展青霉素（PAT）在負(fù)離子模式下的響應(yīng)值高，鏈格孢烯（ALT）、細(xì)交鏈格孢酮酸（TEA）、騰毒素（TEN）和鏈格孢酚（AOH）在正離子模式下的響應(yīng)值顯著高于負(fù)離子模式。

2.1.2 方法回收率及精密度

試驗樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗，分別取一定量的蘋果凍干粉樣品，添加10，50 μg/L 水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液。樣品經(jīng)預(yù)處理后上機(jī)，每個加標(biāo)水平進(jìn)行6 次平行測定。

蘋果中6 種真菌毒素的添加回收率和精密度（n=5）見表1。

表1 蘋果中6 種真菌毒素的添加回收率和精密度（n=5）

由表1 可知，AT 和PAT 的平均加標(biāo)回收率范圍為90%～105%，RSD 為1.0%～5.0%，該方法的準(zhǔn)確度和精密度都較為可行。

2.2 毒素含量的測定

按照優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行測定，由1.2.4 的方法所得回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)分別為：AT（5 種）在50～10 000 μg/L 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，Y=0.099 78X+16.221（R2=0.999 8）；PAT 在50～10 000 μg/L 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，Y=0.121 9X-0.805（R2=1）。由結(jié)果可知，方法的精密度良好、檢出限低，能滿足蘋果中AT（5 種）和PAT 毒素檢測的需要。

6 種真菌毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/L）定量離子質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 6 種真菌毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/L）定量離子質(zhì)譜圖

2.2.1 鏈格孢霉毒素

（1）常溫條件毒素變化。損傷接種鏈格孢霉后置于常溫下，待其發(fā)病分別取病斑1～6 cm 及距離病斑1，2，3 cm 處果實組織分別測定AME、ALT、AOH、TEN、TEA 產(chǎn)毒含量。

低溫0.5～6.0 cm 鏈格孢霉毒素的產(chǎn)毒含量見圖2。

圖2 低溫0.5～6.0 cm 鏈格孢霉毒素的產(chǎn)毒含量

由圖2 可知，整個過程中TEN 均不產(chǎn)毒，而TEA 在整個發(fā)病過程中，不僅病斑本身產(chǎn)毒，距離病斑1，2，3 cm 也均產(chǎn)毒，且離病斑的距離越遠(yuǎn)毒素含量越低；在病斑1 cm 時達(dá)到病斑產(chǎn)毒量的最大值33.056 9 mg/kg；當(dāng)病斑為0.5 cm 時，AME 只有病斑本身產(chǎn)毒，為120.636 4 μg/kg，ALT 和AOH 也只有病斑本身產(chǎn)毒，毒素含量分別為26.579 47，41.161 6 μg/kg ；當(dāng)病斑為4 cm 時，AME 和AOH除病斑本身產(chǎn)毒外距離病斑1 cm 處也開始產(chǎn)毒，但毒素含量相對較低；當(dāng)病斑為5 cm 時，ALT 除病斑本身產(chǎn)毒外距離病斑1 cm 處也開始產(chǎn)毒，但毒素含量相對較低為18.361 4 μg/kg。

（2）低溫條件毒素變化。損傷接種鏈格孢霉后置于低溫下，待其發(fā)病分別取病斑1～3 cm 及距離病斑1，2，3 cm 處果實組織分別測定AME、ALT、AOH、TEN、TEA 產(chǎn)毒含量。

常溫0.5～3.0 cm 鏈格孢霉毒素的產(chǎn)毒含量見圖3。

圖3 常溫0.5～3.0 cm 鏈格孢毒素的產(chǎn)毒含量

由圖3 可知，整個過程中，TEN 不產(chǎn)毒，ALT 只有病斑本身產(chǎn)毒，且毒素含量最大為26.679 7 μg/kg；而TEA 在整個發(fā)病過程中，不僅病斑本身產(chǎn)毒，距離病斑1，2，3 cm 也均產(chǎn)毒，且隨離病斑的距離越遠(yuǎn)毒素含量越低；在病斑1 cm 時達(dá)到病斑產(chǎn)毒量的最大值264.763 5 μg/kg；當(dāng)病斑為0.5 cm 時，AME除病斑本身產(chǎn)毒外，距離病斑1 cm 處也產(chǎn)毒，為16.160 92 μg/kg；當(dāng)病斑為1 cm 時，AME、AOH 除病斑本身產(chǎn)毒外距離病斑1 cm 處也產(chǎn)毒；當(dāng)病斑為2 cm 時，AME 除病斑本身產(chǎn)毒外距離病斑1，2，3 cm處也開始產(chǎn)毒，但毒素含量相對較低；AOH 除病斑產(chǎn)毒外，距離病斑1，2 cm 處也開始產(chǎn)毒，毒素含量較低，當(dāng)病斑為3 cm 時，AME、AOH 除病斑本身產(chǎn)毒外距離病斑1，2，3 cm 處也產(chǎn)毒。

（3）鏈格孢霉毒素。無論是低溫還是常溫條件，交鏈孢霉毒素廣泛存在于霉變的蘋果中，大多數(shù)鏈格孢霉毒素的急性毒性較低，TEA 在整個過程中都產(chǎn)毒，與TEA 作為最重要的鏈格孢霉毒素被美國國家職業(yè)安全及健康組織列入有毒化學(xué)物質(zhì)登記冊中[7]相符合，盡管TEA 檢出率及檢出值都較高，但其單獨存在時健康風(fēng)險較低，Melo F T 等人[8]發(fā)現(xiàn)霉變蘋果中的AOH 的最高含量可達(dá)160 μg/kg，Pfeiffer E等人[9]在研究高粱中鏈格孢霉屬代謝產(chǎn)物的毒性時發(fā)現(xiàn)，只產(chǎn)AOH、AME 和ALT 的培養(yǎng)物對大鼠和雛雞均無毒性作用，而加入29 mg/kg 的TEA 后，對其卻是致命的。而產(chǎn)生同等水平的急性毒性，單獨添加TEA 的劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過29 mg/kg；這表明TEA 能與其他鏈格孢霉毒素協(xié)同作用，產(chǎn)生急性毒性。AME和AOH 已被證明具有強(qiáng)致癌性，蘋果在低溫貯存時也可產(chǎn)生AME 和AOH，與吳春生等人[10]研究了鏈格孢霉污染的蘋果在不同溫度條件下產(chǎn)生AME 和AOH 的能力，隨著貯藏時間的延長，毒素逐漸累積，AME 和AOH 已被證明具有強(qiáng)致癌性，且存在協(xié)同效應(yīng)[11]相符合。

2.2.2 展青霉毒素

（1）常溫條件毒素變化。損傷接種展青霉素（PAT）后至于常溫下，待其發(fā)病后分別取病斑及距離病斑1，2，3 cm 處果實組織測定PAT 產(chǎn)毒含量。

常溫0.5～6.0 cm 展青霉素的產(chǎn)毒含量見圖4。

圖4 常溫0.5～6.0 cm 展青霉素的產(chǎn)毒含量

由圖4 可知，當(dāng)病斑為0.5 cm 時開始產(chǎn)毒，含量為0.512 4 μg/kg，距離病斑1，2，3 cm 處均不產(chǎn)毒；病斑為1 cm 時產(chǎn)毒，病斑本身毒素含量較大為2.919 9 μg/kg，但距離病斑1 cm 處毒素含量較小為0.059 9 μg/kg，距離病斑2，3 cm均不產(chǎn)毒；病斑2 cm產(chǎn)毒量為6.802 0 μg/kg，距離病斑1，2 cm 處毒素含量分別為0.198 9，0.023 8 μg/kg，距離病斑3 cm處不產(chǎn)毒；當(dāng)病斑達(dá)到3 cm 后除病斑本身產(chǎn)毒外，距離病斑1，2，3 cm 處均產(chǎn)毒，當(dāng)病斑6 cm 時產(chǎn)毒量高達(dá)16.590 2 μg/kg，并且距離病斑1，2，3 cm處毒素含量分別為0.695 6，0.491 3，0.326 1 μg/kg。

（2）低溫條件毒素變化。損傷接種展青霉后置于低溫（4 ℃）下，待其發(fā)病后分別取病斑及距離病斑1，2，3 cm 處果實組織測定PAT 產(chǎn)毒含量。

低溫0.5～6.0 cm 展青霉素的產(chǎn)毒含量見圖5。

圖5 低溫0.5～6.0 cm 展青霉素的產(chǎn)毒含量

由圖5 可知，當(dāng)病斑為0.5 cm 和1.0 cm 時只有病斑本身產(chǎn)毒，分別為0.029 6，0.315 412 μg/kg，距離病斑1，2，3 cm 處均不產(chǎn)毒；當(dāng)病斑為2，3，4，5 cm 時，不僅病斑本身產(chǎn)毒，產(chǎn)毒量分別為0.371 2，1.503 1，2.307 7，3.109 5 μg/kg，距離病斑1 cm 處也產(chǎn)毒，但毒素含量較低；病斑6 cm 時，病斑本身產(chǎn)毒量高達(dá)4.464 034 μg/kg，并且距離病斑1，2，3 cm處均產(chǎn)毒，毒素含量分別為0.036 95，0.016 855，0.014 805 μg/kg。

（3）展青霉素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)展青霉產(chǎn)生展青霉素的最適溫度為20～25 ℃，且隨著培養(yǎng)時間的延長，產(chǎn)毒量呈現(xiàn)增加的單峰性變化趨勢；同時高濕條件有利于展青霉素的產(chǎn)生[10]。此外，有研究表明不同環(huán)境pH 值對擴(kuò)展青霉菌體生物量和展青霉素產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，酸性環(huán)境比堿性環(huán)境更利于展青霉素合成，pH 值4～5 是展青霉素合成的最適pH值[11]。劉華峰等人[12]在富士、小國光、黃香蕉蘋果中均檢測到展青霉素的存在，且隨著霉心病病斑直徑的增大，展青霉素含量在增加。

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS/MS）和超高效液相色譜（HPLC），測定蘋果樣品中6 種真菌毒素（Alternaria toxin；PAT）的含量。方法的加標(biāo)回收率為90%～105%，RSD 為1.0%～5.0%，能滿足蘋果樣品中真菌毒素痕量分析的要求。

果蔬的腐爛、霉變主要是由真菌毒素引起的，常見的真菌毒素以交鏈孢毒素（Alternaria toxin，AT）、展青霉素（Patlin，PAT）[15]為主，尤其針對深加工產(chǎn)品中的剔除腐爛部分后繼續(xù)使用果蔬的剩余組織。研究結(jié)果表明，交鏈孢毒素（Alternaria toxin，AT）在常溫和低溫均可產(chǎn)生毒素，其中TEA 產(chǎn)毒量的最大值33.056 9 mg/kg；AME 產(chǎn)毒量最大為120.636 4 μg/kg，ALT 和AOH 毒素含量分別為26.579 47，41.161 6 μg/kg；TEA 與其他毒素產(chǎn)生協(xié)同作用后產(chǎn)生較大的毒素，TEA 在整個過程均產(chǎn)毒，使得與其他毒素的協(xié)同作用幾率會大大提高，因此隨膳食攝入的鏈格孢毒素對公眾健康存在潛在風(fēng)險[16-20]。展青霉素（Patlin，PAT）不僅腐爛組織本身會產(chǎn)生毒素外，距離病斑較近的未腐爛的果實組織也含有一定量的毒素，隨著腐爛面積的增大未腐爛果實中的毒素含量也在增加。研究結(jié)果表明，產(chǎn)毒量最高達(dá)16.590 2 μg/kg，較國家的規(guī)定相對安全，但PAT 具有急性毒性[16]，對動物的肺、腦、肝臟、脾臟、腎的損害和免疫系統(tǒng)的毒害作用[17]；具有慢性毒性，表現(xiàn)在對動物的細(xì)胞毒性、基因毒性和免疫毒性[18]。