血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平對慢性腎小球腎炎患者預后的預測價值

黃其峰,童薇,劉洋,江小偉,劉萍

慢性腎小球腎炎是雙側腎小球彌漫或局部發生炎性反應的腎小球免疫損傷性疾病[1]。若治療不及時,易發展為腎功能衰竭[2]。因此臨床上急需可靠的慢性腎小球腎炎預后評估指標。以往研究發現,微小RNA(miR)-181a-5p、miR-132-5p均與炎性反應有關,可抑制神經炎性反應,延緩神經功能減退的進展[3-5]。腎小球腎炎早期病變為系膜細胞增殖等,Liang等[6]研究顯示,在高糖處理的腎小球系膜細胞中miR-181a-5p表達顯著下降,miR-181a-5p過表達能抑制腎小球系膜細胞增殖,并降低白介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。孫楓等[7]報道顯示,在高糖處理的腎小球系膜細胞中miR-132-5p表達顯著下調,miR-132-5p過表達可顯著促進高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡,并降低IL-6和TNF-α水平。但目前并無miR-181a-5p和miR-132-5p在慢性腎小球腎炎中的相關報道,因此本研究擬探討慢性腎小球腎炎患者血清miR-181a-5p和miR-132-5p水平以及二者與預后的關系,旨在為減少慢性腎小球腎炎不良預后的發生提供參考,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2020年4月中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇一醫院腎內科收治的慢性腎小球腎炎患者128例作為慢性腎小球腎炎組(腎炎組),男73例,女55例,年齡30～75(55.21±10.11)歲;體質量指數(BMI)18.61～25.04(22.71±3.79)kg/m2;病理類型:IgA系膜增生性腎小球腎炎47例,非IgA系膜增生性腎小球腎炎34例,系膜毛細血管性腎小球腎炎16例,膜性腎病22例,局灶節段性腎小球硬化9例。選取同期醫院體檢健康者130例作為健康對照組(對照組),男67例,女63例,年齡29～72(54.95±10.28)歲;BMI為18.52～24.76(22.45±3.64)kg/m2。2組人員的性別、年齡、BMI比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究通過醫院倫理委員會批準(LCL審第20170069號),受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①患者均符合慢性腎小球腎炎的診斷標準[8],經腎穿刺活檢證實,且為初次確診;②年齡>18歲且肝功能正常;③病例資料完整且配合隨訪。(2)排除標準:①合并腫瘤患者;②合并嚴重肝功能障礙患者;③合并嚴重感染性疾病、泌尿系統感染患者;④近6個月使用腎毒性藥物患者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清miR-181a-5p、miR-132-5p表達檢測:患者入院后翌日清晨、健康者體檢時采集空腹肘靜脈血7 ml,離心留取血清,保存在-70℃冰箱中。使用血清總RNA純化試劑盒(批號WH9042,購自揚州萬禾生物科技公司)提取樣品中總RNA,用10 ng總RNA依照逆轉錄試劑盒(批號WH2730,購自揚州萬禾生物科技公司)反轉錄cDNA。采用實時熒光定量PCR儀(型號Pangaea,購自北京深藍云生物科技公司)對miR-181a-5p、miR-132-5p及內參U6進行擴增反應,miR-181a-5p上游引物:5'-GGAGAACATTCAACGCTGT-3',下游引物:5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3';miR-132-5p上游引物:5'-ACCGTGGCTTTCGATTGTTACT-3',下游引物:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';U6上游引物:5'-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3',下游引物:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。引物由上海生工合成。反應條件:95℃ 5 min、 95℃ 19 s、62℃ 22 s、72℃ 23 s,共計36個循環。對miR-181a-5p、miR-132-5p相對表達量用2-△△CT法計算。

1.3.2 腎功能指標檢測:取血清樣本,全自動生化分析儀(型號BX-3010,購自日本希森美康公司)檢測尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平;并計算腎小球濾過率(eGFR)[9]。酶聯免疫吸附法測定胱抑素C(CysC)水平,試劑盒批號GH-29346,購自南昌和利思生物技術公司。

1.3.3 隨訪:慢性腎小球腎炎患者治療后隨訪3年,起始日期為患者治療后出院當日,隨訪截止日期為出院當日后第3年。根據患者病情進展情況分為:預后不良亞組26例病情進展為終末期腎病,即eGFR<15 ml·min-1·1.73 m-2),預后良好亞組(病情無進展,未發展為終末期腎病)102例。

2 結 果

2.1 2組血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平比較 與對照組比較,腎炎組血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 對照組和腎炎組血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平比較Tab.1 Comparison of serum miR-181a-5p and miR-132-5p levels between the control group and the nephritis group

2.2 2組腎功能指標比較 與對照組比較,腎炎組患者血清UA、BUN、SCr、CysC水平顯著升高(P<0.01),eGFR水平顯著降低(P<0.01),見表2。

表2 對照組和腎炎組腎功能指標比較Tab.2 Comparison of renal function indicators between the control group and the nephritis group

2.3 血清miR-181a-5p、miR-132-5p與腎功能指標的相關性分析 慢性腎小球腎炎患者血清miR-181a-5p與miR-132-5p水平呈正相關(P<0.01);血清miR-181a-5p和miR-132-5p均與UA、BUN、SCr、CysC水平呈負相關(P<0.01),與eGFR水平呈正相關(P<0.01),見表3。

表3 慢性腎小球腎炎患者血清miR-181a-5p、miR-132-5p與腎功能指標的相關性分析Tab.3 Correlation analysis between serum miR-181a-5p, miR-132-5p and renal function indicators in patients with chronic glomerulonephritis

2.4 2亞組患者臨床資料、腎功能指標及血清miR-181a-5p、miR-132-5p比較 與預后良好亞組比較,預后不良亞組患者性別、年齡、BMI、病理類型比較差異無統計學意義(P>0.05),血清UA、BUN、SCr、CysC水平顯著升高(P<0.01),eGFR及血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平顯著降低(P<0.01),見表4。

表4 預后良好亞組和預后不良亞組患者臨床資料、腎功能指標及血清miR-181a-5p、miR-132-5p比較Tab.4 Comparison of clinical data, renal function indicators, and serum miR-181a-5p and miR-132-5p between patients with good and poor prognosis subgroups

2.5 影響慢性腎小球腎炎患者3年內預后不良的多因素Logistic回歸分析 以慢性腎小球腎炎患者3年內是否發生預后不良為因變量(0=未發生,1=發生),以UA、BUN、SCr、CysC、eGFR、miR-181a-5p、miR-132-5p水平(均是連續變量)為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結果發現:高水平UA、高水平BUN、高水平SCr、高水平CysC、低水平eGFR、低水平miR-181a-5p、低水平miR-132-5p是影響慢性腎小球腎炎患者3年內預后不良的危險因素(P<0.05),見表5。

表5 影響慢性腎小球腎炎患者3年內預后不良的多因素Logistic回歸分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis of poor prognosis within 3 years in patients with chronic glomerulonephritis

2.6 血清miR-181a-5p、miR-132-5p預測慢性腎小球腎炎患者3年內預后不良的價值 繪制血清miR-181a-5p、miR-132-5p及二者聯合預測慢性腎小球腎炎患者3年內預后不良的ROC曲線,結果顯示,血清miR-181a-5p、miR-132-5p二者聯合預測慢性腎小球腎炎患者3年內預后不良的AUC分別為0.832、0.801、0.904,二者聯合預測的AUC顯著高于血清miR-181a-5p、miR-132-5p各自單獨預測AUC(Z=1.714、2.050,P=0.043、0.020),見圖1、表6。

圖1 血清miR-181a-5p、miR-132-5p及二者聯合預測慢性腎小球腎炎患者3年內預后不良的ROC曲線Fig.1 ROC curve of serum miR-181a-5p, miR-132-5p, and their combination predicting poor prognosis within 3 years in patients with chronic glomerulonephritis

表6 血清miR-181a-5p、miR-132-5p預測慢性腎小球腎炎患者3年內預后不良的價值Tab.6 Value of serum miR-181a-5p and miR-132-5p in predicting poor prognosis within 3 years in patients with chronic glomerulonephritis

3 討 論

慢性腎小球腎炎若治療不及時,病情容易發展為慢性腎衰竭[10-11]。盡管腎活檢在診斷各種腎臟疾病方面有極大作用,但這種侵入性操作有時會導致出血,尤其在老年患者中出血可能是致命的[12-13]。因此,臨床上尋求預測慢性腎小球腎炎預后的生物標志物對于改善患者生存期方面是必要的。

慢性腎小球腎炎發病機制尚不明確，有研究顯示其發病機制可能由免疫相關的細胞因子介導,各種細胞因子相互調節,共同參與炎性反應[14]。miRNAs是短的非編碼RNA(17～22個核苷酸),可以轉錄后調控相關基因的表達,阻止信使RNA(mRNA)翻譯或促使mRNA降解[15]。Zhang等[16]研究表明,脂多糖(LPS)誘導的人腎小管上皮細胞系(HK-2)細胞IL-1β和TNF-α等炎性因子均升高,進一步研究發現,miR-181a-5p高表達可抑制LPS誘導的HK-2細胞焦亡,從而抑制細胞炎性反應。Cao等[17]報道,人HK-2細胞用轉化生長因子-β1處理可在體外模擬腎纖維化,而提高miR-181a-5p活性可抑制HK-2細胞腎纖維化的進展。Xu等[18]發現,高糖誘導的HK-2細胞中miR-181a-5p表達下降,并通過增強纖連蛋白和膠原蛋白I的表達,以促進HK-2細胞腎纖維化。miR-132-3p已成為慢性炎性疾病的介質,Fang等[19]報道,miR-132-3p的表達增強會減輕巨噬細胞的炎性應激反應和M1極化。陳剛等[20]發現,血管平滑肌細胞經氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)誘導后miR-132-5p表達水平顯著下降,增強miR-132-5p活性可使得oxLDL誘導的血管平滑肌細胞中炎性因子水平下降。高繼英等[21]研究表明,miR-132-5p過表達可抑制炎性反應和細胞凋亡,從而減輕帕金森細胞模型損傷。本研究發現,慢性腎小球腎炎患者血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平顯著低于健康人,與上述研究的結果相似[16-20],提示miR-181a-5p、miR-132-5p可能參與慢性腎小球腎炎疾病的發生。本研究進一步發現預后不良慢性腎功能衰竭患者血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平明顯低于預后良好患者,提示miR-181a-5p、miR-132-5p可能影響慢性腎小球腎炎患者預后情況,推測miR-181a-5p、miR-132-5p可能通過調控腎血管內皮細胞平滑肌細胞活力和炎性反應從而影響患者預后。本研究還發現,低水平miR-181a-5p、miR-132-5p是影響慢性腎小球腎炎患者3年內預后不良的危險因素,且血清miR-181a-5p、miR-132-5p預測慢性腎小球腎炎患者3年內預后不良的AUC分別為0.832、0.801,提示其對于預估慢性腎小球腎炎患者3年內預后不良有一定幫助,臨床上要監控miR-181a-5p和miR-132-5p低水平患者,及時給予治療,以改善預后。

臨床上評價腎功能損害常通過檢測腎小管重吸收和排泄功能及腎小球濾過率,常用指標有UA、BUN、Scr、CysC及eGFR等[22]。本研究發現慢性腎小球腎炎患者血清UA、BUN、SCr、CysC水平顯著高于健康人,eGFR顯著低于健康人;3年內預后不良患者血清UA、BUN、SCr、CysC水平較預后良好患者更高,eGFR水平較預后良好患者更低;提示慢性腎小球腎炎患者腎功能存在損害,且患者腎功能越差其預后不良的可能性越高。慢性腎小球腎炎患者血清miR-181a-5p與miR-132-5p水平呈正相關,血清miR-181a-5p和miR-132-5p均與UA、BUN、SCr、CysC水平呈負相關,與eGFR水平呈正相關,表明miR-181a-5p和miR-132-5p可能存在相互作用,共同影響患者腎功能,從而影響患者預后。ROC曲線分析還顯示,血清miR-181a-5p和miR-132-5p聯合預測慢性腎小球腎炎患者3年內預后不良的AUC為0.904,優于二者各自單獨預測,提示二者聯合預估患者3年內預后效果可能更好。

綜上所述,慢性腎小球腎炎患者血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平較低,二者與腎功能關系密切,miR-181a-5p、miR-132-5p低水平可能會導致患者3年內預后不良,二者聯合有助于評估患者3年內預后情況。本研究的不足之處在于未探究血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平對慢性腎小球腎炎患者長期預后的影響,后期將擴大樣本量,采用多中心研究的方式,進一步探究二者對患者長期預后的作用。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

黃其峰:設計研究方案,課題設計,實施研究過程,論文撰寫;童薇:提出研究思路,分析試驗數據,論文審核;劉洋、江小偉:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;劉萍:進行統計學分析