畜禽糞肥中抗生素殘留對(duì)土壤微生物及抗性基因的影響分析研究進(jìn)展*

牛明芬 謝田賓 王顏紅 周 強(qiáng) 王鏡然

(1.沈陽(yáng)建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110168;2.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所,遼寧 沈陽(yáng) 110016)

近年來(lái),在綠色有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)種植過(guò)程中,有機(jī)肥的施加是提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)的一項(xiàng)有效措施。研究發(fā)現(xiàn),采用有機(jī)肥替代部分化肥施用,可在滿(mǎn)足作物生長(zhǎng)需求的同時(shí),獲得產(chǎn)量增長(zhǎng)和品質(zhì)提升的效果[1]。王明文等[2-3]研究表明,有機(jī)肥替代40%化肥會(huì)使大蒜增產(chǎn)15.93%,使其維生素C(Vc)、可溶性糖和可溶性蛋白分別提高24.41%、31.77%和72.55%;有機(jī)肥替代20%化肥會(huì)使黃瓜增產(chǎn)59.54%,使其Vc、可溶性糖和粗蛋白分別提高49.46%、16.23%和44.44%。由此看來(lái),有機(jī)肥已成為促進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的重要手段。

我國(guó)使用的有機(jī)肥大多來(lái)自于養(yǎng)殖場(chǎng)的畜禽糞便[4],而隨著現(xiàn)代規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,抗生素的濫用會(huì)導(dǎo)致畜禽糞便中殘留有各種抗生素。已有報(bào)道指出,大部分抗生素不能被動(dòng)物機(jī)體完全吸收,大約有40%～90%的抗生素以原形或代謝物形式隨糞便排出體外[5]。直接施用畜禽糞肥可導(dǎo)致大量抗生素進(jìn)入土壤,隨著抗生素進(jìn)入土壤時(shí)間的增長(zhǎng),土壤中的微生物對(duì)抗生素的耐藥性會(huì)增強(qiáng),進(jìn)而產(chǎn)生大量抗藥菌[6]。土壤中抗藥菌的不斷增多,對(duì)土壤中其他微生物菌群的群落結(jié)構(gòu)或功能造成影響[7],同時(shí)顯著提升土壤微生物菌群中抗生素抗性基因(ARGs)的豐度[8]。施用未腐熟的有機(jī)肥,長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)土壤中環(huán)境的變化會(huì)導(dǎo)致種植出的農(nóng)產(chǎn)品抗性下降,病蟲(chóng)害增多[9]。張明[10]和馬鳴超等[11]均研究表明,未腐熟的有機(jī)肥若不加處理直接施入農(nóng)田會(huì)引起病蟲(chóng)害的產(chǎn)生、提高作物發(fā)病率。因此,對(duì)當(dāng)前農(nóng)田土壤中抗生素殘留現(xiàn)狀進(jìn)行研究分析就顯得尤為重要。

1 農(nóng)田土壤抗生素殘留水平

有機(jī)肥施用是保障我國(guó)糧食生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)之一,但施用處理不當(dāng)?shù)挠袡C(jī)糞肥,長(zhǎng)期累積對(duì)農(nóng)田土壤和農(nóng)產(chǎn)品帶來(lái)的抗生素殘留問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重。通過(guò)對(duì)查閱的文獻(xiàn)進(jìn)行匯總,農(nóng)田土壤抗生素殘留水平如表1所示。

表1 農(nóng)田土壤抗生素的殘留水平1)Table 1 The residual level of antibiotics in farmland soil

隨著有機(jī)綠色農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展和關(guān)注,有機(jī)糞肥的施用量越來(lái)越大,國(guó)內(nèi)外農(nóng)田土壤中抗生素的殘留水平也不斷升高。農(nóng)田土壤中四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留最為嚴(yán)重。AN等[12]研究表明,沈陽(yáng)地區(qū)某農(nóng)田土壤中土霉素和金霉素分別高達(dá)1 398.47、1 590.16 μg/kg,四環(huán)素也接近1 000.00 μg/kg。尹春艷等[13]研究發(fā)現(xiàn),山東某典型設(shè)施蔬菜基地土壤中四環(huán)素類(lèi)抗生素的檢出率為100%,平均為274.00 μg/kg,喹諾酮類(lèi)抗生素檢出率為85%,平均為73.05 μg/kg。張慧敏等[14]對(duì)浙北地區(qū)某農(nóng)田表層土壤檢測(cè)發(fā)現(xiàn),土霉素、四環(huán)素和金霉素的檢出率分別為93%、88%和93%,平均殘留量分別為350.00、1 071.00、119.00 μg/kg,分別是未施畜禽糞肥農(nóng)田的39、13、12倍,可以看出施畜禽糞肥會(huì)帶來(lái)農(nóng)田土壤抗生素殘留。朱秀輝等[28]在廣州北郊蔬菜基地土壤上四環(huán)素類(lèi)抗生素的檢出率在90%以上,通過(guò)層次分析法表明畜禽糞肥是土壤中四環(huán)素類(lèi)抗生素的主要來(lái)源。由此可見(jiàn),我國(guó)不同地區(qū)的農(nóng)田土壤抗生素殘留水平不同,大多地區(qū)的抗生素含量超出了國(guó)際獸藥協(xié)會(huì)(VICH)提出的土壤抗生素生態(tài)毒害效應(yīng)的觸發(fā)值(100.00 μg/kg)[29],表明土壤中普遍存在抗生素殘留。

不僅我國(guó)農(nóng)田土壤受到抗生素殘留困擾,國(guó)外亦如此。JACOBSEN等[21]發(fā)現(xiàn)丹麥地區(qū)的四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留量高達(dá)14 400.00 μg/kg。HO等[22]在馬來(lái)西亞某農(nóng)田土壤中發(fā)現(xiàn),強(qiáng)力霉素和恩諾沙星最高分別達(dá)728.00、378.00 μg/kg,氟甲喹最高達(dá)到了1 331.00 μg/kg,即使在施肥7個(gè)月后,檢測(cè)到的恩諾沙星也達(dá)到20.00 μg/kg。CARBALLO等[23]在奧地利某施用糞肥1～2個(gè)月后的農(nóng)田土壤中發(fā)現(xiàn),恩諾沙星和環(huán)丙沙星分別達(dá)到370.00、450.00 μg/kg。HAMSCHER等[24]在德國(guó)某施用糞肥后的農(nóng)田表層土(0～10 cm)中發(fā)現(xiàn),四環(huán)素平均為86.20 μg/kg,而在10～20 cm的土層中,增加到198.70 μg/kg。可以看出,隨著畜禽糞肥施用時(shí)間的增長(zhǎng),土壤對(duì)抗生素累積的程度越大,隨著土壤深度的增加,殘留的抗生素含量也會(huì)增加。因此施用畜禽糞肥對(duì)土壤中抗生素的分布具有明顯影響,且國(guó)內(nèi)外的農(nóng)田土壤抗生素殘留情況均不容樂(lè)觀,對(duì)農(nóng)田土壤環(huán)境影響現(xiàn)狀進(jìn)行分析和評(píng)估很有必要。

2 農(nóng)田土壤抗生素殘留檢測(cè)方法

由于施用未經(jīng)處理的有機(jī)肥會(huì)對(duì)農(nóng)田土壤造成抗生素殘留和累積的影響,造成土壤抗生素污染隨之引發(fā)一系列的問(wèn)題[30]。成熟有效的農(nóng)田土壤抗生素檢測(cè)方法是研究土壤抗生素污染問(wèn)題的前提。準(zhǔn)確檢測(cè)出農(nóng)田土壤中抗生素的種類(lèi)和含量,對(duì)于評(píng)估當(dāng)前農(nóng)田土壤抗生素殘留現(xiàn)狀、判斷抗生素對(duì)農(nóng)田土壤和農(nóng)產(chǎn)品的影響、防治抗生素污染具有重要意義。目前土壤中抗生素檢測(cè)的主要方法有傳統(tǒng)的生物法、免疫分析法以及理化分析法,理化分析法主要包括毛細(xì)管電泳法、液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法[31],不同檢測(cè)方法比較見(jiàn)表2。

表2 土壤中抗生素檢測(cè)方法比較Table 2 Comparison of detection methods of antibiotics in soil

土壤中抗生素的殘留檢測(cè)分析起源于1981年,WARMAN等[32]采用生物法發(fā)現(xiàn)了用雞糞施肥的土壤中存在金霉素,當(dāng)時(shí)該方法的回收率較低,僅為22%～28%。后來(lái)隨著技術(shù)的進(jìn)步,研發(fā)出基于碳納米管的免疫分析新方法,韋薇[33]建立可用于土壤中慶大霉素檢測(cè)的抑制曲線(xiàn),測(cè)得土壤中慶大霉素在0.198～0.380 ng/g,其檢測(cè)限和線(xiàn)性范圍良好。再后來(lái),出現(xiàn)了毛細(xì)管電泳法。左艷麗[34]研究發(fā)現(xiàn),該方法可檢測(cè)土壤中磺胺間二甲氧基嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺嘧啶分別在≥0.070、≥0.063、≥0.056 mg/kg水平上的殘留。李興華等[35]采用固相萃取前處理,高效毛細(xì)管電泳法檢出養(yǎng)殖場(chǎng)附近土壤中磺胺嘧啶和磺胺噻唑分別為0.044 3、0.043 5 mg/kg。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn),農(nóng)田土壤中殘留的抗生素不僅僅以單一的形式存在,而大多是以復(fù)合的形式存在[36]。傳統(tǒng)的一些方法存在單檢測(cè)、不全面或無(wú)法對(duì)大量數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確分析等問(wèn)題,近年來(lái)發(fā)展出的一種高效、全面且靈活的手段可以解決這一瓶頸——高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)。通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化不同的提取方法,結(jié)果均有良好的回收率和低的檢測(cè)限[37],[42-43]。胡鈺等[38]基于固相萃取—超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)6個(gè)不同地區(qū)的農(nóng)田土壤中7類(lèi)共30種抗生素殘留進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,檢出的17種抗生素中有12種檢出率達(dá)100%,總量為73.4～184.0 μg/kg,說(shuō)明該方法具有高效靈敏等特點(diǎn)。

傳統(tǒng)的土壤抗生素生物檢測(cè)法在過(guò)去的一段時(shí)間內(nèi)占主導(dǎo)地位[44],由于其回收率和靈敏度較低等原因逐漸被淘汰。免疫分析法雖然具有良好的檢測(cè)限和線(xiàn)性范圍,但是其準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性較差[45]。毛細(xì)管電泳法具有低檢出限、高回收率的特點(diǎn),但是后來(lái)隨著高效液相色譜法(HPLC)的出現(xiàn),也慢慢替代了毛細(xì)管電泳法。HPLC可以簡(jiǎn)單快速地檢測(cè)出土壤樣品中殘留的抗生素,具有很強(qiáng)的分離能力,而后發(fā)展起來(lái)的HPLC-MS可以檢測(cè)更多種類(lèi)、更多數(shù)量的抗生素,比HPLC具備準(zhǔn)確度更高、檢測(cè)限更低等優(yōu)點(diǎn)[46],該方法儀器設(shè)備成熟,測(cè)試結(jié)果接受度高,并且還形成了通用的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些方法的比較結(jié)果顯示,無(wú)論是靈敏度、還是檢測(cè)范圍,HPLC-MS都具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)。

但是由于土壤環(huán)境相對(duì)較復(fù)雜,分析方法的局限性將會(huì)是限制土壤中抗生素殘留研究的一個(gè)重要原因[39]53。而組學(xué)技術(shù)是對(duì)一類(lèi)個(gè)體系統(tǒng)集合的全景分析技術(shù),它依托高通量的現(xiàn)代化分析儀器,基于色譜、質(zhì)譜等獲取的大量數(shù)據(jù)或峰圖[39]54,通過(guò)分析其中的特征抗生素來(lái)定性。YANG等[47]使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(HPLC-MS/MS)對(duì)非洲肯尼亞不同地區(qū)的農(nóng)田土壤中抗生素進(jìn)行檢測(cè),采用SPSS軟件組學(xué)分析出12種抗生素的濃度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,采用單因素方差法分析出不同采樣點(diǎn)的抗生素存在組間差異,并且表明肯尼亞農(nóng)田土壤中主要是四環(huán)素和喹諾酮類(lèi)抗生素污染。

組學(xué)分析方法的出現(xiàn)使得對(duì)土壤中多種類(lèi)抗生素的鑒別更加靈敏,大幅度提高了分析效率,為農(nóng)田土壤中抗生素的檢測(cè)和殘留分析提供方法學(xué)基礎(chǔ)。抗生素檢測(cè)方法的研究,對(duì)加強(qiáng)農(nóng)田土壤抗生素污染監(jiān)控與防治,有著極為重要的意義。對(duì)查閱的農(nóng)田土壤抗生素檢測(cè)方法文獻(xiàn)進(jìn)行匯總,其應(yīng)用占比如圖1所示。

圖1 抗生素檢測(cè)方法應(yīng)用占比Fig.1 Application ratio of antibiotic detection methods

3 抗生素對(duì)土壤微生物菌群與ARGs的影響

3.1 抗生素殘留對(duì)土壤中微生物菌群的影響

土壤微生物菌群是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,是衡量土壤肥力的重要指標(biāo),大多數(shù)土壤過(guò)程都離不開(kāi)土壤微生物的參與[48]。大量未經(jīng)處理的畜禽糞便作為肥料直接施用于農(nóng)田,某些殘留的抗生素會(huì)被農(nóng)田土壤吸附并積累[49]1435。土壤中累積的抗生素會(huì)抑制其靶標(biāo)微生物的生長(zhǎng)繁殖和代謝活動(dòng),選擇性地誘殺土著微生物或誘導(dǎo)耐藥菌的產(chǎn)生,影響了土壤中微生物菌群多樣性;其他未受到抑制的微生物能夠獲得大量資源而快速繁殖,改變了微生物群落結(jié)構(gòu)和功能[50]21,破壞土壤微生態(tài)平衡。

3.1.1 影響土壤微生物的活性

殘留的抗生素進(jìn)入土壤后,由于抗生素本身的作用,能對(duì)土壤中微生物產(chǎn)生各種毒性效應(yīng),可以直接殺死土壤環(huán)境中某些微生物菌群或抑制其活性[51]。有研究表明,當(dāng)有機(jī)肥輸入達(dá)到閾值水平(9 000 kg/hm2)時(shí),可以改變土壤抵抗力,過(guò)度施用肥料會(huì)抑制土壤微生物活性[52]。還有研究表明,抑制微生物活性的有效抗生素劑量為0.003～7.350 μg/g,這取決于抗生素種類(lèi)及其土壤吸附,并且根據(jù)分配系數(shù)計(jì)算,0.200～160.000 ng/g的抗生素顯著減少了土壤細(xì)菌的數(shù)量[53]。

據(jù)研究,土壤中抗生素的殘留對(duì)土壤微生物的呼吸、氨化、硝化以及磷轉(zhuǎn)化作用等均有抑制作用[54]。土壤呼吸作用是衡量土壤微生物總體活性的指標(biāo)。劉鋒等[55]實(shí)驗(yàn)表明,磺胺類(lèi)和甲氧芐啶抗生素對(duì)土壤呼吸作用影響較大,而四環(huán)素類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素對(duì)土壤呼吸作用影響不大。袁德梽[56]實(shí)驗(yàn)表明,不同濃度的抗生素殘留對(duì)土壤呼吸作用表現(xiàn)出的抑制水平不同,抗生素殘留濃度越大,抑制水平相對(duì)越高。楊基峰等[57]研究發(fā)現(xiàn),磺胺嘧啶、氧四環(huán)素和諾氟沙星3種抗生素對(duì)土壤呼吸的最大抑制率分別為76.8%、20.7%和21.9%,并且高濃度的抗生素對(duì)土壤微生物的硝化作用表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。

3.1.2 影響土壤微生物菌群多樣性

抗生素進(jìn)入土壤后會(huì)擾亂土壤中微生物菌群的正常秩序[58],長(zhǎng)時(shí)間以來(lái),土壤中的微生物對(duì)抗生素的耐藥性增強(qiáng),進(jìn)而產(chǎn)生耐藥菌[59]。SENGELOV等[60]在長(zhǎng)期施用豬糞的農(nóng)田中發(fā)現(xiàn)了大量的耐藥菌株：四環(huán)素耐藥菌每毫升高達(dá)8.75×107個(gè),鏈霉素耐藥菌每毫升高達(dá)2.3×107～4.6×107個(gè),且豬糞使用量越大,耐藥菌株的耐藥性越強(qiáng)。隨著耐藥菌的不斷增多,土壤中其他微生物菌群的多樣性將下降,從而導(dǎo)致土壤環(huán)境受影響。曾悅等[61]的研究表明,氟喹諾酮類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)抗生素在>10 mg/kg時(shí),對(duì)土壤中微生物多樣性會(huì)表現(xiàn)出抑制作用,磺胺類(lèi)抗生素在≥100 mg/kg后,其抑制作用更加顯著。UDDIN等[62]研究表明,水稻土受獸用抗生素污染后可引起細(xì)菌多樣性降低。張海豐等[63]通過(guò)模擬實(shí)驗(yàn)論證了土壤受不同濃度磺胺甲惡唑污染后,土壤細(xì)菌的多樣性顯著降低(P<0.05)。抗生素藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與細(xì)菌生長(zhǎng)所需的氨基苯甲酸很相似,可與氨苯甲酸競(jìng)爭(zhēng)二氫葉酸合成酶,妨礙二氫葉酸的形成,最終影響細(xì)菌核蛋白的合成,從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖[64]。

Chao1和Shannon多樣性指數(shù)是評(píng)價(jià)微生物菌群多樣性的重要指標(biāo),多樣性指數(shù)越高表明微生物菌群的豐富度和多樣性越高。馬驛等[65]實(shí)驗(yàn)表明,恩諾沙星影響下土壤微生物菌群的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)顯著低于空白對(duì)照組,且抗生素濃度越高,豐富度和多樣性越小。于曉雯等[66]實(shí)驗(yàn)表明,四環(huán)素類(lèi)抗生素隨畜禽糞肥進(jìn)入土壤中改變了土壤微生物菌群的相對(duì)豐度,對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素適應(yīng)能力較強(qiáng)的菌群相對(duì)豐度升高,對(duì)其較敏感的其他菌群相對(duì)豐度下降。由此可見(jiàn),抗生素的殘留會(huì)使土壤中微生物的數(shù)量下降,土壤微生物菌群的多樣性降低。

3.1.3 影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能

土壤微生物對(duì)土壤環(huán)境的變化非常敏感,通常情況下,土壤中微生物群落組成處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。殘留抗生素的加入改變了土壤的理化性質(zhì),使得土壤中微生物群落組成和功能發(fā)生相應(yīng)的動(dòng)態(tài)改變[67]。張躍華等[68]和湯瑋婧等[69]曾在早期的實(shí)驗(yàn)中表明,在向土壤中施入抗生素后,細(xì)菌和真菌數(shù)目隨抗生素濃度的增加整體呈減少趨勢(shì),放線(xiàn)菌數(shù)目整體呈上升趨勢(shì)。HEUER等[70]實(shí)驗(yàn)表明,通過(guò)向土壤中施加含不同質(zhì)量濃度(0、10、100 mg/kg)磺胺嘧啶的豬糞,可導(dǎo)致土壤中細(xì)菌群落受到影響,甚至能持續(xù)兩個(gè)月以上。汪勇等[71]在長(zhǎng)期施用新鮮雞糞、新鮮豬糞的土壤中檢測(cè)到四環(huán)素抗性細(xì)菌數(shù)量比普通土壤高出3～4個(gè)數(shù)量級(jí),四環(huán)素抗性細(xì)菌占可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的比例比表施化肥高出37～500倍,抗性細(xì)菌豐度的改變使得糞肥處理的土壤和其他處理有顯著不同的群落結(jié)構(gòu);并且他們還發(fā)現(xiàn)深層土(10～20 cm)中抗性細(xì)菌數(shù)量比表層土(0～10 cm)高出2%～6%。

由于抗生素在土壤中有假持久性,土壤中微生物群落的功能也會(huì)發(fā)生改變。早在2001年,WESTERGAARD等[72]在土培條件下研究了泰樂(lè)素對(duì)土壤微生物群落功能的影響,結(jié)果表明泰樂(lè)素抑制了土壤中某些細(xì)菌類(lèi)群的生長(zhǎng)功能。王加龍等[73]研究表明,較低濃度的恩諾沙星殘留不影響土壤微生物群落功能多樣性,而相對(duì)較高濃度的恩諾沙星殘留則能夠降低土壤微生物群落功能多樣性。KONG等[74]將從土壤中提取的微生物群落暴露于含有土霉素的生理鹽水溶液,發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落功能多樣性隨土霉素濃度升高顯著降低。

應(yīng)用宏基因組技術(shù)能夠解析復(fù)雜環(huán)境中微生物群落物種組成[75],但是目前該技術(shù)主要應(yīng)用于研究抗生素對(duì)水環(huán)境微生物群落的影響[76],而對(duì)于抗生素脅迫下土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)變化鮮有報(bào)道。

3.2 抗生素殘留對(duì)土壤ARGs的影響

3.2.1 畜禽糞肥施用土壤中的ARGs

含有抗生素的畜禽糞肥進(jìn)入土壤長(zhǎng)時(shí)間以來(lái),土壤微生物群落構(gòu)成了選擇壓力,會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)生ARGs[49]1436。雖然EDDTE[77]的研究表明,在未受影響的土壤中,微生物自身?yè)碛胸S富多樣的抗藥性及ARGs(比如MARC等[78]就曾在17個(gè)南極土壤樣品中發(fā)現(xiàn)了177種自然存在的ARGs),但是ARGs被認(rèn)定為一種新型的環(huán)境面源污染物,可以通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移作用在微生物之間傳播或自我擴(kuò)增[79],具有難被生物降解的特性。土壤中抗生素殘留被認(rèn)為是加劇ARGs形成與傳播的主要因素[80]。土壤微生物群落中ARGs豐度的提高使農(nóng)田土壤成為了ARGs的一個(gè)儲(chǔ)存庫(kù)[81]。研究表明,土壤微生物通過(guò)產(chǎn)生抗性基因來(lái)適應(yīng)含抗生素的土壤,即使最后土壤環(huán)境中的抗生素污染可以消除,已經(jīng)形成抗性的微生物和抗性基因仍然會(huì)在土壤環(huán)境中持續(xù)存在,從而會(huì)對(duì)整個(gè)土壤系統(tǒng)造成危害[82]。

抗生素的不規(guī)范使用也會(huì)誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生ARGs,隨畜禽糞便排放后對(duì)土壤環(huán)境將造成一定的影響[83]。近年來(lái),有許多學(xué)者從畜禽糞便中檢測(cè)出ARGs,如四環(huán)素類(lèi)ARGs：tetA、tetC、tetE、tetG、tetM、tetO、tetQ和tetT;磺胺類(lèi)ARGs：sul1、sul2和sul3;喹諾酮類(lèi)ARGs：oqxB、qnrS和qnrD;鏈霉素類(lèi)ARGs：strA、strB;氨基糖苷類(lèi)ARGs：aadA;大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)ARGs：ermB、ermF等[84]3435,[85]6938,[86-87]。這表明畜禽糞便中存在豐富多樣的抗性基因,多種抗性機(jī)制并存已成為一種普遍現(xiàn)象。不同類(lèi)ARGs在不同糞便中賦存不同,總濃度為雞糞>豬糞>牛糞,且喹諾酮類(lèi)和磺胺類(lèi)ARGs的分布最為普遍豐富[85]6939。而土壤中ARGs的相對(duì)豐度按類(lèi)別依次為四環(huán)素類(lèi)>磺胺類(lèi)>氯霉素類(lèi)>氨基糖苷類(lèi)[88]。

3.2.2 對(duì)ARGs種類(lèi)和豐度的影響

畜禽糞肥的長(zhǎng)期施用,抗生素的加入引起土壤理化環(huán)境波動(dòng),會(huì)通過(guò)富集或抑制土壤中的相關(guān)菌屬直接影響ARGs豐度,并改變移動(dòng)元件(MGEs)的豐度來(lái)對(duì)ARGs產(chǎn)生間接作用[50]14,從而影響土壤原有ARGs的組成和豐度。HAN等[89]認(rèn)為施用豬糞和雞糞通過(guò)影響土壤的理化性質(zhì),增加土壤中細(xì)菌的豐度,進(jìn)而影響土壤中ARGs和MGEs的豐度;研究表明,46.3%的ARGs變異可以由細(xì)菌群落(27.6%)、MGEs(8.9%)、土壤理化性質(zhì)(4.2%)、細(xì)菌群落+ MGEs(1.5%)、細(xì)菌群落+土壤理化性質(zhì)(1.9%)、MGEs+土壤理化性質(zhì)(1.4%)和細(xì)菌群落+土壤理化性質(zhì)+MGEs(0.8%)解釋。

目前已有多項(xiàng)研究顯示,施用集約化養(yǎng)殖的畜禽糞肥會(huì)引起農(nóng)田土壤中的ARGs種類(lèi)增加,豐度和檢出率提高[90]。ARGs從糞便到土壤的水平轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致土壤中長(zhǎng)期存在ARGs[91],CHEN等[92]在長(zhǎng)期施用雞糞的農(nóng)田土壤中發(fā)現(xiàn),130個(gè)不同亞型的ARGs豐度(102～103)均顯著高于無(wú)雞糞添加對(duì)照組(10-2～10),通過(guò)Shannon和Simpson指數(shù)計(jì)算出雞糞處理顯著增加了ARGs的多樣性。TANG等[93]在長(zhǎng)期施用糞肥的水稻土中發(fā)現(xiàn),土壤中抗生素殘留質(zhì)量濃度達(dá)8 750 μg/kg,不同地區(qū)的ARGs豐度均上升1～2個(gè)數(shù)量級(jí)不等(見(jiàn)圖2),可以看出ARGs的豐度與施用畜禽糞肥的關(guān)系呈顯著正相關(guān)。FANG等[94]在對(duì)施用雞糞的蔬菜大棚土壤中ARGs和人類(lèi)病原菌(HPB)的研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期施用糞肥的溫室土壤中抗生素、ARGs、HPB種類(lèi)和HPB中ARGs含量更高,分別為22類(lèi)、32種、46種和156.2～5 001.4 μg/kg。一旦這些具有抗生素耐藥性的人類(lèi)致病菌(如假單胞菌屬)進(jìn)入食物鏈,可能會(huì)造成感染風(fēng)險(xiǎn)。并且還有研究表明,施肥3年的土壤中的ARGs豐度最高,比對(duì)照土壤高出近3×105倍;施肥年限大于10年的土壤中磺胺類(lèi)ARGs豐度最高,約為對(duì)照土壤的105倍;施肥土壤中耐藥菌率是對(duì)照土壤的5倍[95]。

注：數(shù)據(jù)來(lái)自文獻(xiàn)[93]。圖2 4個(gè)地區(qū)不施肥與施肥土壤中ARGs豐度對(duì)比Fig.2 ARGs abundance in fertilized and unfertilized soils in four regions

隨著科技的發(fā)展,高通量測(cè)序、生物信息學(xué)和組學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展為多尺度、多層次研究ARGs的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散途徑及機(jī)制提供了科學(xué)手段。例如,ZHU等[84]3438采用高通量熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法對(duì)我國(guó)3個(gè)商業(yè)養(yǎng)豬場(chǎng)的糞便及施加糞肥的土壤進(jìn)行檢測(cè),共發(fā)現(xiàn)5大類(lèi)共149種ARGs,其中有63種ARGs的豐度顯著高于對(duì)照組192～28 000倍。FORSBERG等[96]對(duì)18個(gè)農(nóng)田土壤中18種抗生素進(jìn)行了功能宏基因組選擇,發(fā)現(xiàn)了2 895個(gè)新的ARGs。SU等[97]利用功能基因組學(xué)的方法從土壤樣品中篩選出多種ARGs,同已知ARGs相比,發(fā)現(xiàn)氨基酸水平上只有2%的ARGs相似性在90%以上,而67%以上的ARGs相似性低于60%。這表明環(huán)境中還有很多尚未被認(rèn)識(shí)的ARGs,可能會(huì)有更多的ARGs在土壤微生物間傳播轉(zhuǎn)移,致使更多土壤微生物獲得抗性,從而引起更多抗藥細(xì)菌的出現(xiàn),對(duì)土壤環(huán)境造成一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

3.2.3 ARGs的消減

為了有效扼制ARGs傳播到土壤,眾所周知,高溫堆肥處理是減少畜禽糞便中ARGs的一種有效手段。利用堆肥過(guò)程產(chǎn)生的高溫,可有效去除耐藥微生物和耐藥質(zhì)粒,并降解糞便中殘留的抗生素,減少ARGs的水平轉(zhuǎn)移[98]。研究表明,堆肥10 d后,ARGs總量下降了4～6個(gè)數(shù)量級(jí),ARGs的絕對(duì)豐度隨著堆肥過(guò)程的進(jìn)行而逐漸降低,抗性基因aadA、sul2、mcr-1、oqxB的消減率分別為89.39%、97.99%、99.89%、99.81%,多重耐藥大腸桿菌16S rRNA基因消減速率為0.128 d-1,半消減期為5.41 d,耐藥基因消減規(guī)律符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程[99]。也有研究表明,在堆肥中加入化學(xué)抑制劑(如吲哚、胺類(lèi)、石灰氮等)可增強(qiáng)ARGs的去除效果,從而降低ARGs的豐度[100]。但是,目前采用的仍是傳統(tǒng)的堆肥法,處理過(guò)程中存在多種調(diào)控因素,如堆肥的溫度、高溫持續(xù)時(shí)間、pH、含水量、生物量以及供氧量等,因此還需要進(jìn)一步探討新型ARGs消減技術(shù)。

未經(jīng)處理的畜禽糞肥被認(rèn)為是土壤ARGs的主要來(lái)源,施用集約化養(yǎng)殖的畜禽糞肥導(dǎo)致土壤中抗生素殘留擾亂了土壤微生物菌群,造成土壤生態(tài)環(huán)境紊亂,致使土壤產(chǎn)生更多ARGs。相比抗生素帶來(lái)的危害,ARGs的出現(xiàn)對(duì)農(nóng)業(yè)產(chǎn)地環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品的影響更加嚴(yán)峻,所以對(duì)ARGs源頭的控制和削減就尤為重要。

綜上所述,土壤中微生物菌群對(duì)土壤中ARGs的賦存具有一定的影響,而ARGs功能的行使需要以微生物為載體,二者之間的變化可以直觀地表明土壤中抗生素殘留的狀況,可以作為評(píng)估農(nóng)田土壤抗生素殘留狀況的一種手段。

4 結(jié)論與展望

施用未經(jīng)處理的有機(jī)糞肥可導(dǎo)致農(nóng)田土壤中抗生素殘留風(fēng)險(xiǎn),現(xiàn)代的檢測(cè)技術(shù)和組學(xué)理念能更高效、科學(xué)地發(fā)現(xiàn)和解釋土壤抗生素影響水平。抗生素殘留可導(dǎo)致土壤微生物菌群中抗性細(xì)菌數(shù)量增加,土壤中ARGs豐度增加。

目前畜禽糞肥中抗生素殘留對(duì)土壤微生物影響的研究已經(jīng)有很多,大多是基于對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能變化的現(xiàn)象描述,缺乏更為深入的機(jī)理及影響因素研究。而且抗生素長(zhǎng)期存在于土壤環(huán)境中必然誘導(dǎo)抗性基因的產(chǎn)生,目前對(duì)抗性基因的傳播擴(kuò)散以及其可能造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)尚缺乏系統(tǒng)研究。希望未來(lái)可以對(duì)以下幾個(gè)方面加強(qiáng)研究：

(1) 鑒于抗生素濫用帶來(lái)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn),亟待加強(qiáng)獸藥抗生素的使用規(guī)范、監(jiān)管,同時(shí)加強(qiáng)集約化養(yǎng)殖場(chǎng)糞尿的無(wú)害化處理技術(shù)研究,保障有機(jī)糞肥安全施用。

(2) 畜禽糞肥是土壤環(huán)境中抗生素的重要來(lái)源之一,未來(lái)還需進(jìn)一步探索其復(fù)雜組分對(duì)抗生素影響土壤微生物作用的機(jī)理,以充分了解和掌握殘留抗生素的畜禽糞肥在土地利用時(shí)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

(3) 深入了解土壤微生物菌群和ARGs之間具體的作用機(jī)理及關(guān)系,利用微生物變化達(dá)到管理控制ARGs的傳播擴(kuò)散,從而為管控抗生素的負(fù)面環(huán)境影響提供科技支撐。