激素和糖分對暗紫貝母生根培養的影響

字胡潤，趙艷娟，管世超，蘇娟，文鳳，張玉蓉，王曉，李靖瑞，岳健，*

(1.云南青谷生物科技有限公司，云南 昆明 650506；2.云南山里紅生物科技有限公司，云南 昆明 650229)

貝母屬(FritillariaL.)屬于百合科(Liliaceae)，為多年生草本植物。據記載，該屬約有130種，廣泛分布于北半球的歐、亞及北美洲的溫帶地區，尤以地中海北岸、伊朗、土耳其等地區分布的種類最為豐富。我國貝母屬植物約有近50個種類、19個變種，主要分布于四川、新疆、甘肅、湖北、安徽、浙江等地[1-2]。2020版《中國藥典》中收載的藥材貝母就有5大類，分別為川貝母(FritillariacirrhosaD.Don)、平貝母(FritillariaussuriensisMaxim.)、浙貝母(FritillariathunbergiiMiq.)、伊貝母(FritillariapallidifloraSchrenk)和湖北貝母(FritillariahupehensisHsiaoet K. C. Hsia)，主要以干燥鱗莖入藥，味辛、性平，具有清熱潤肺、化痰止咳等功效，用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞嗽，痰中帶血，瘵病，乳癰，肺癰等癥狀[3]。貝母屬植物始載于春秋時期的《詩經》[4]，而其應用歷史悠久[5]，臨床最早記載于東漢張仲景的《傷寒雜病論》，是傳統的止咳良藥。研究[6-8]表明，貝母主要藥用成分為生物堿類、皂苷類萜類、甾體和多糖成分等，具有鎮咳、祛痰、降血壓、抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗潰瘍、抗氧化、抗菌、提高免疫力、防治阿爾茨海默病等神經病變等功效；其應用廣泛，既可用于中醫臨床止咳祛痰，也可作為清咽潤喉保健食品的原料藥之一[9]，具有優良的藥用價值及營養價值，在未來市場上具有廣闊的開發前景。

傳統貝母藥材以川貝母的藥用價值最高，被譽為“止咳圣藥”[10]，是國家衛生健康委員會公布的可用于保健食品的中藥，具有廣闊的開發價值。目前，市場上已經有超過350種川貝母中成藥[11]，但主要依賴野生資源，隨著需求量的增多，人為過度采挖，加上川貝母在野外狀態下種子成熟率和發芽率較低，導致川貝母野生資源越來越少[12]。李西文[13]研究發現，川貝母野生分布面積持續減少。方清茂等[14]研究表明，2020年川貝母市場年需求量在600 t以上，而野生川貝母的年產量不到100 t。川貝母的發展趨勢將走向人工撫育與栽培，且隨著其栽培技術的日益成熟，栽培品已逐漸走向市場，川貝母的主要貨源也逐漸由野生轉為栽培[15]?！吨袊幍洹?010年版中，川貝母性狀分類新增“栽培品”，也說明川貝母的野生資源枯竭，需要使用栽培品來作為新的替代品或補充品，緩解持續增加的市場需求[16-17]。利用植物組織培養技術可在短期內獲得大量性狀一致的優良川貝母種苗，有望解決人工種植貝母生長周期長、繁殖系數低的問題[18]。近年來，關于川貝母的研究進展迅速，在生理生態習性、藥用有效成分、藥理活性及其作用、分子生物學研究等方面取得了較大突破[17-19]。但是，目前對川貝母以及基原植物暗紫貝母的組培繁育仍然處于小規模研究階段。本文通過研究激素和糖分對暗紫貝母生根培養的影響，為以后暗紫貝母建立組培快繁體系，大規模標準化生產優良暗紫貝母種苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取云南青谷生物科技有限公司種苗培養室苗齡為90 d的暗紫貝母芽繁苗，苗的長勢正常，鱗片為白色，不長根。

1.2 研究方法

1.2.1 培養基制備

每個配方配制1 L培養基，每瓶灌裝50 mL，每個配方灌裝20瓶，培養基的pH值為5.8，灌裝好后放入滅菌鍋內，溫度保持在122 ℃，滅菌30 min后取出培養基放入預培養室5～7 d，選取穩定無污染的合格培養基備用。

1.2.2 接種前材料準備

用干凈的報紙包好已洗干凈的接種盤，每包5～7個接種盤，放入高壓蒸汽滅菌鍋內，溫度保持在122 ℃，滅菌30 min后取出接種盤放入預培養室，備用。

1.2.3 接種方法

在超凈工作臺內，將提前選取好的健康無污染的暗紫貝母芽繁瓶苗用噴過酒精的干凈毛巾仔細擦拭一遍，然后打開蓋子，用已滅菌的鑷子取出暗紫貝母芽繁苗放入準備好的滅菌接種盤內，左手拿已滅菌的鑷子夾住接種盤內的暗紫貝母，右手拿已滅菌的手術刀去除暗紫貝母苗基部壞死或發黑的部分，確保新鮮健康的植株直接接觸培養基，有葉片的用手術刀切去葉片后，用無菌鑷子將處理好的暗紫貝母芽繁苗接種到提前配制好的生根培養基中，每瓶培養基轉接10棵苗。

1.2.4 不同激素處理對暗紫貝母生根的影響

以全量基本培養基(MS)和添加9.4 g·L-1卡拉膠(car)為基礎培養基，添加不同濃度的萘乙酸(NAA)(0.3、0.5、1 mL·L-1)，以及在添加0.5 mL·L-1NAA的基礎上加入不同濃度吲哚丁酸(IBA)(0.5、1 mL·L-1)設計實驗處理(表1)。每個處理組各6瓶，將轉接好的瓶苗蓋好蓋子，打上標簽，放入培養條件為光照2 500 lx、濕度30%、溫度(20±1)℃的培養室進行培養，培養90 d后觀察暗紫貝母苗生根情況，并統計暗紫貝母苗生根率、生根數量及污染率。

表1 不同處理的培養基配方Table 1 Media formulations for different treatments

1.2.5 不同濃度糖分對暗紫貝母生根的影響

以全量MS培養基和添加9.4 g·L-1car、0.5 mL·L-1NAA以及0.5 mL·L-1IBA為生根培養基，添加不同濃度的糖分(20、30、30 g·L-1)設計實驗處理組(表1)。每個處理組各6瓶，將轉接好的瓶苗蓋好蓋子，打上標簽，放入培養條件為光照2 500 lx、濕度30%、溫度(20±1)℃的培養室進行培養，培養90 d后觀察暗紫貝母苗生根情況，并統計暗紫貝母苗生根率、生根數量及污染率。

2 結果與分析

2.1 不同激素及濃度對暗紫貝母生根的影響

在培養90 d后，不同激素及濃度對暗紫貝母生根的影響見表2。不同激素種類和濃度配比對暗紫貝母的誘導生根有顯著影響，在MS培養基中，隨著NAA質量濃度升高，暗紫貝母無菌苗的生根率也上升，NAA濃度為1.0 mL·L-1時生根率高達76.3%，根生長良好，相對粗壯，平均有效根數有2.8條。但NAA濃度為0.5和1.0 mL·L-1時，暗紫貝母生根率差異不大，與NAA濃度為0.3 mL·L-1時差異明顯，說明NAA在較高濃度時有益于生根。在添加0.5 mL·L-1NAA的基礎上加入不同濃度的IBA，暗紫貝母的生根率也有提高，生根率在81%以上，平均有效根數在3.2條以上，并且沒有出現污染，但是高濃度的IBA導致暗紫貝母根系膨大易脫落，不利于暗紫貝母植株生長。因此，以MS培養基和添加9.4 g·L-1car為基礎培養基時，添加0.5 mL·L-1NAA和0.5 mL·L-1IBA時最適合暗紫貝母生根培養，生根率高達81.3%，平均有效根在3.4條，根系生長良好粗壯。

表2 不同處理對暗紫貝母幼苗生根的影響Table 2 Effects of different treatments on the rooting of Fritilaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia seedlings

2.2 不同糖分含量對暗紫貝母生根的影響

在培養90 d后，不同糖分含量對暗紫貝母生根的影響見表3。糖分含量對暗紫貝母生根影響不顯著，其生根率均在60%以上，暗紫貝母芽繁苗在蔗糖添加量為30 g·L-1時生根率最好，在80%以上，根系生長情況也好。但是暗紫貝母芽繁苗在添加高糖分含量的培養基中污染率高，在添加了40 g·L-1糖分時污染率高達10%，生根率僅為60.8%，根系生長也細弱。添加高蔗糖含量的培養瓶中暗紫貝母幼苗有增殖的跡象，表明糖分可能也是影響暗紫貝母增殖的關鍵因素之一，但具體情況還需要進一步驗證。

表3 蔗糖對暗紫貝母幼苗生根的影響Table 3 Effect of sucrose on rooting of Fritilaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia seedlings

3 結論與討論

外源激素的種類、含量以及不同配比在植物組織培養中起著非常重要的作用[20]。生長素類激素主要促進細胞伸長、誘導愈傷組織產生，以及試管苗的生根[21]。進行暗紫貝母無菌苗的生根培養是其組織培養過程中的重要環節，是快速繁殖暗紫貝母種苗的有力保證。本研究表明，在培養基中添加不同激素時，暗紫貝母芽繁苗均能誘導生根，但是不同的激素種類和濃度配比對暗紫貝母的誘導生根有顯著影響，當添加0.5 mL·L-1NAA和0.5 mL·L-1IBA時暗紫貝母生根情況最好，生根率高達81.3%，根系粗壯，且有效根數最多，平均每株暗紫貝母有3.4條根系。這是因為激素NAA和IBA對暗紫貝母生根有促進作用。張振霞等[22]的研究結果表明，暗紫貝母鱗莖在1/2 MS生根培養基中，NAA和IBA的存在有利于生根，特別是在含0.5 mg·L-1NAA的培養基中，鱗莖生根密集，長勢好。王躍華等[20]將分化出的川貝母無根苗接入生根培養基中誘導生根，發現NAA誘導生根率高達83.20%，而IBA誘導生根率為64.22%。江明殊等[23]的研究結果表明，NAA與IBA相結合有利于根的生長，而不同濃度的NAA與IBA組合對川貝母鱗莖芽生根的誘導影響不同。同時眾多研究表明，暗紫貝母無根苗的生根階段不僅要誘導其生根，還要促進其結鱗莖，馬吉義[24]的研究表明，糖明顯促進暗紫貝母無根苗生根結鱗莖，糖濃度越高所結的鱗莖越大。但是本研究表明，糖分濃度對暗紫貝母生根影響不顯著，生根率都在60%以上，暗紫貝母幼苗在高糖分含量的培養基中誘導生根時污染率較高，根系生長情況相對較差。綜上所述，本研究發現暗紫貝母的最適生根培養基為MS+9.4 g·L-1car+0.5 mL·L-1NAA+0.5 mL·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖。

目前，暗紫貝母已經成為了國家重點保護野生藥材，其野生資源逐年遞減，人工種植暗紫貝母能產生巨大的社會價值和經濟效益，然而暗紫貝母優良種苗的繁育是暗紫貝母規范化栽培的“源頭工程”[25]。該研究有利于后期建立暗紫貝母建立組培快繁體系，助力暗紫貝母的種苗繁育產業化發展。