改進QuEChERS-液質聯用法測定黃精中23種農藥殘留

何華軍，張輝，夏麗敏，王遠遠

(1.景寧畬族自治縣食品藥品檢驗檢測中心，浙江 麗水 323500；2.景寧畬族自治縣生態林業發展中心，浙江 麗水 323500；3.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310051)

黃精，習稱雞頭參、老虎姜、九蒸姜、野山姜、千年運等，為百合科黃精屬的多年生草本植物，以根莖入藥，是我國傳統的“藥食同源”滋補中藥材之一，具有悠久的藥用歷史和確切的臨床療效[1]。浙江省作為黃精主產區之一，擁有優越的林業生態資源，尤其是林下自然環境[2]。近幾年黃精的人工種植規模不斷擴大，種植過程中也出現了各種病蟲害問題，并有愈發嚴重的趨勢[3]。在黃精種植過程中化肥農藥不規范、超量使用現象仍然較多，存在較大的環境污染和農藥殘留風險[4-5]。因此，《中華人民共和國藥典》(2020年版)四部通則農藥殘留量測定法(2341)[6]新增了第五法“藥材及飲片(植物類)中禁用農藥多殘留測定法”，進一步規范和限制中藥材種植過程的農藥使用，推動中醫藥市場健康發展。

液相色譜-質譜聯用法(LC-MS/MS)作為農藥多殘留檢測方法之一，適用于分析受熱易分解、分子量較大、不適用于氣相色譜分析的農藥[7-8]，該檢測方法靈敏度高，定性定量檢測可以同時進行，檢測結果準確。QuEChERS方法作為一種操作快速、高效、簡單的樣品萃取與基質凈化技術，最初由美國農業部Anastassiades等[9]開發，該方法因其簡單和高通量而被廣泛接受，而且大多數農藥的回收率較高[10]。但中藥材的基質復雜、雜質多、干擾多，傳統的QuEChERS方法并不能適用于各種不同基質的藥材，因此，需要針對部分藥材基質對該方法進行優化，以獲得最佳的檢測條件[11-13]。

本文以麗水市黃精種植企業生產的黃精為研究對象，以《中華人民共和國藥典》 (2020年版)四部通則為指導，利用改進QuEChERS方法對黃精樣品進行提取凈化，采用UPLC-MS/MS法同時對23種農藥殘留進行了測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo TQS 三重四級桿串聯質譜儀：美國Waters公司；ST-16R 高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技(中國)有限公司；XH-B 漩渦混合器：江蘇天翎儀器有限公司；PP020XXM1 超純水器：英國ELGA公司；GM 200刀式研磨儀：弗爾德(上海)儀器設備有限公司；ME 104電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司。

23種農藥標準品(濃度為1 000 mg·L-1)：氧樂果、多菌靈、噻蟲嗪、吡蟲啉、樂果、啶蟲脒、嘧霉胺、烯酰嗎啉、腈菌唑、嘧菌酯、氟環唑、聯苯肼酯、馬拉硫磷、三唑磷、咪鮮胺、倍硫磷、二嗪農、辛硫磷、茚蟲威、丙溴磷、增效醚、毒死蜱、噠螨靈，均由壇墨質檢科技股份有限公司提供。

乙腈(色譜級)：德國默克公司；甲酸(色譜級)、QuEChERS提取鹽包(6 g無水硫酸鎂，1.5 g無水乙酸鈉)：賽默飛世爾科技(中國)有限公司；乙酸銨(分析純)：上海展云化工有限公司；冰醋酸(分析純)：江蘇強盛功能化學股份有限公司；無水硫酸鎂(MgSO4，分析純)：南京化學試劑股份有限公司；N-丙基乙二胺(PSA，40～63 μm)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18，40～63 μm)、石墨化碳黑(GCB，120～400目)、硅膠(48～74 μm)：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 標準溶液的配制

取23種標準農藥物質各1.0 mL分別加入到10 mL容量瓶中，用乙腈定容至10 mL，配制成質量濃度均為100 μg·mL-1的標準儲備液，-18 ℃避光冷藏保存。取空白黃精基質，梯度稀釋至不同質量濃度(0.5、1、5、10、20、50 ng·mL-1)的溶液，即得。

1.3 檢測條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters HSS T3 C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫：40 ℃；流速：0.45 mL·min-1；流動相A：乙腈-0.1%甲酸溶液；流動相B：0.1%甲酸溶液(含5 mmol·L-1甲酸銨)；洗脫：0～0.25 min，2%A；0.25～7.75 min，2%～99%A；7.75～8.5 min，2%A；8.50～10.00 min，2%A。

1.3.2 質譜條件

以Waters Xevo TQS LC-MS-MS聯用儀檢測，電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)；正離子掃描模式；多反應監測(multi reaction monitoring，MRM)；毛細管電壓：3.0 kV；脫溶劑(氮氣)流速：1 000 L·h-1；溫度：450 ℃。

1.4 試驗方法

1.4.1 供試品溶液的制備

取供試品粉末(過孔徑0.25 mm篩)3 g，置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，靜置30 min，精密加入乙腈15 mL，渦旋混勻，置恒溫振蕩器中振蕩5 min，加入QuEChERS提取鹽包，立即搖散，再置恒溫振蕩器于5 ℃下振蕩5 min，離心(5 ℃，5 000 r·min-1)5 min，取上清液9 mL于預先裝有C18(300 mg)、PSA(300 mg)、硅膠(100 mg)的15 mL凈化管中，渦旋混勻，置恒溫振蕩器振蕩5 min，離心(5 000 r·min-1)5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，即得。

1.4.2 空白基質液的制備

取空白基質樣品，同供試品溶液的制備方法(1.4.1節)處理成空白基質溶液。

2 結果與分析

2.1 LC-MS/MS條件的選擇

用適宜濃度的標準溶液，通過LC-MS/MS 的Intellistart調諧程序，優化錐孔電壓和碰撞能量，選擇相對豐度較高、出峰穩定的離子碎片，獲得了23種農藥最優質譜檢測參數，如表1所示。23種農藥目標物的總離子流圖如圖1所示。

圖1 23種農藥MRM總離子流圖Fig.1 MRM total ion flow diagram of 23 pesticides

表1 23種農藥的質譜參數及液相保留時間Table 1 Mass spectrometry parameters and liquid phase retention time of 23 pesticides

2.2 QuEChERS法的優化

2.2.1 GCB對23種農藥吸附的影響

GCB作為常用的QuEChERS凈化吸附劑有去除色素的作用，如類胡蘿卜素和葉綠素，但它們二者對含苯官能團的化合物有較強吸附作用，會降低其回收率[14]。因此，本試驗對空白黃精樣品進行加標，比較其加標回收率，加標量為50 μg·kg-1，在含有900 mg無水硫酸鎂、300 mg PSA、300 mg C18、300 mg硅膠凈化條件下分別考察了不同GCB使用量下(0、30、60和90 mg)23種農藥回收率的影響，結果見圖2。如圖2所示，多菌靈、嘧霉胺、聯苯肼酯、咪鮮胺、毒死蜱的回收率隨著GCB用量的增加明顯下降，可能與其較強的吸附作用有關。當GCB用量為0時，剩余農藥的回收率相比其他3組差別不大，因此，本試驗不使用GCB作為凈化材料。

圖2 不同GCB使用量下23種農藥回收率Fig.2 Recovery rates of 23 pesticides under different GCB usage levels

2.2.2 硅膠對23種農藥吸附的影響

由于在單獨使用PSA或者C18作為凈化劑時，樂果、馬拉硫磷、辛硫磷、咪鮮胺等多種農藥的回收率明顯受到凈化條件的影響，不符合檢測要求，為進一步探尋成本更低，更加綠色的檢測方法，本試驗在含有900 mg無水硫酸鎂、300 mgPSA、300 mgC18凈化條件下分別考察了不同硅膠使用量下(0、100、200和300 mg)23種農藥回收率的影響，結果見圖3。如圖3所示，當硅膠使用量為0時，辛硫磷回收率較低，其他3組各農藥回收率相差較小，且都能滿足檢測要求，考慮到試驗成本，選擇硅膠用量100 mg為最佳條件。

圖3 不同硅膠使用量下23種農藥回收率Fig.3 Recovery rates of 23 pesticides under different silicone usage levels

綜上所述，當無水硫酸鎂(900 mg)、PSA(300 mg)、C18(300 mg)、硅膠(100 mg)組合作為凈化劑時，23種農藥的回收率在77.49%～107.11%，滿足農殘檢測的要求，檢測成本也更低。因此，本實驗選擇該組合作為凈化劑。

2.3 基質效應

基質效應是由于不同化合物在LC-MS/MS分析中對電噴霧界面的電離效率會有不同的影響，這種影響表現為離子增強或抑制，容易導致檢測結果有不同程度的誤差。本試驗的基質效應(ME)根據公式“ME等于基質匹配標準曲線的斜率除以溶劑標準曲線的斜率減去1再乘以100%”進行評估，當ME>0時，表現為基質增強效應；當ME<0時，為基質抑制效應。此外，若|ME|≤20%，表示弱基質效應；若|ME|在20%～50%，則表示中等基質效應；若|ME|>50%，表示強基質效應[15-16]。結果見表2，在黃精基質中嘧霉胺具有強基質效應，吡蟲啉和聯苯肼酯具有中等基質效應，其余農藥具有弱基質效應。本試驗采用黃精基質匹配標準溶液繪制的標準校正曲線對黃精中23種農藥定量，降低基質效應的影響，提高檢測結果準確性。

表2 23種農藥的線性方程、 相關系數、 基質效應、 檢出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，matrix effects，detection limits，and quantification limits of 23 pesticides

2.4 方法學驗證

本試驗采用基質匹配外標法定量，將一定量的混合標準工作溶液用空白基質液梯度稀釋成6個濃度的標準工作溶液，根據色譜條件測定混合標準工作溶液，繪制23種農藥的基質匹配標準曲線。以信噪比S/N=3時確定檢測限(LOD)，以信噪比S/N=10時確定定量限(LOQ)。

23種農藥的線性范圍、相關系數、定量限、檢出限見表2。

23種農藥化合物的標準曲線濃度范圍為0.5～50.0 ng·mL-1，線性相關系數(R2)均大于0.995 5，23種農藥化合物的LOQs和LODs分別為0.04～3.29 μg·kg-1和0.01～0.99 μg·kg-1，檢出限均低于《中華人民共和國藥典》(2020年版)四部通則農藥殘留量測定法(2341)第五法，可以滿足檢測要求。

在黃精空白基質中加入低(10 μg·kg-1)、中(25 μg·kg-1)、高(100 μg·kg-1)3個不同濃度水平的混合標準品，按照1.4.1節進行樣品前處理，測定回收率，計算相對標準偏差(RSDs)，結果見表3。3個不同濃度水平下的加標回收率分別為83.36%～114.52%、75.61%～101.38%、82.29%～103.15%，RSDs 分別為1.26%～9.99%、0.61%～7.08%、0.64%～4.43%，方法回收率和精密度均滿足農藥殘留檢測要求。

表3 黃精基質中23種農藥的加標回收率及相對標準偏差Table 3 Recovery rates and relative standard deviations of 23 pesticides in Polygonatum sibiricum matrix

3 結論與討論

本文通過對凈化條件、質譜條件等優化，確定黃精中23種農藥多殘留的 QuEChERS前處理方法，方法學考察結果顯示，23種農藥的 LOD為0.01～0.99 μg·kg-1，LOQ為 0.04～3.29 μg·kg-1，標準曲線R2在0.995 5～0.999 9，加標回收率在75.61%～114.52%，RSD在0.61%～9.99%。本文所建立的檢測方法操作簡便、高效靈敏、準確可靠，可為黃精中相關農藥的殘留監測提供技術支撐。