丁香油對紅鰭東方鲀幼魚血液生化指標的影響

王舒慧，趙睿虎，曹新宇，李欣陽，姜志強

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)是暖水性海洋底棲魚類，主要分布于北太平洋西部，在中國常見于東海和黃渤海區(qū)域[1]。其肉質(zhì)細膩嫩滑、蘊含豐富的營養(yǎng)成分，目前在國內(nèi)海水魚類養(yǎng)殖方面較為成功[2]。紅鰭東方鲀具有抗炎、降壓、護胃、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等多方面的積極作用。在其內(nèi)臟及血液等部位存在河鲀毒素，這一劇毒物質(zhì)可應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。紅鰭東方鲀對刺激反應(yīng)較強烈，在生產(chǎn)研究和試驗操作過程中易掙扎，導(dǎo)致可操作性差，易使魚體受損，在長途運輸過程中，很容易由于缺氧和應(yīng)激等因素導(dǎo)致死亡。

麻醉劑被廣泛用于魚類形態(tài)學(xué)測量、捕撈、運輸和標記放流等研究工作中，科學(xué)合理使用麻醉劑能夠有效地降低魚類的應(yīng)激變化，減輕對魚體的損傷，使其存活率得以升高。丁香油化學(xué)式為C11H14O2，學(xué)名2-甲氧-4-烯丙基苯油，是一種植物香料，憑借其安全、高效等優(yōu)勢在美國農(nóng)用殺蟲劑以及食品添加劑中被廣泛使用。此外，丁香油以其高效、成本小、低毒等優(yōu)點，近年來在魚類麻醉劑中被較高關(guān)注，已在活體采卵、活魚運輸以及手術(shù)過程中得到廣泛應(yīng)用[3]。在魚類麻醉中，丁香油關(guān)鍵有效成分為丁香酚，方法采取藥液浸泡。澳大利亞、智利、芬蘭、新西蘭等國家普遍認為丁香油是水產(chǎn)麻醉的理想選擇，因為它被認為沒有殘留期[4]。

血液生化指標可充分反映魚體生理狀況、健康狀況以及營養(yǎng)水平等方面。因此，本研究檢測了麻醉過程中及復(fù)蘇后紅鰭東方鲀幼魚的各項血液生化指標，并對麻醉劑造成的試驗魚應(yīng)激以及器官功能(肝、腎)影響進行了重點研究，旨在為探討丁香油麻醉紅鰭東方鲀幼魚的安全性以及揭示其麻醉機理提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

紅鰭東方鲀幼魚購自大連富谷水產(chǎn)有限公司，體重為40～55 g，狀態(tài)健康無任何疾病。在進行試驗之前，對這些魚進行了24 h的禁食處理。

1.2 試驗用水

試驗所使用的海水來自于大連黑石礁海區(qū)，經(jīng)過過濾處理。海水的溫度為18～20 ℃，鹽度為31‰～33‰，同時，總氨氮濃度低于0.05 mg·L-1，溶解氧濃度高于7 mg·L-1，亞硝酸鹽濃度小于0.01 mg·L-1。

1.3 試驗器材

采用溶菌酶(LZM)試劑盒(比濁法)進行試驗，供應(yīng)商為南京建成生物科技公司。麻醉試驗設(shè)備包括：移液槍(5 mL和1 mL)、200 L塑料圓桶、電子秤、冰盤、1 mL無菌注射器、水浴鍋、計時器、1.5 mL離心管、722型紫外分光光度計、比色皿(0.5和1.0 cm)。

1.4 試驗方法

1.4.1 丁香油溶液的配制

丁香油溶液的配置：由于丁香油不易溶于水，首先將其用無水乙醇配制成0.1 g·mL-1的丁香油待用液[5]，配好的待用液4 ℃冷藏保存，可多次使用。試驗時可用移液槍取所用量的待用液加入120 L藍色塑料箱，箱內(nèi)應(yīng)提前倒入相應(yīng)體積水。充分攪拌使其溶解，以分別配成8、16、24 mg·L-1的丁香油溶液，放置5 min后待用。

1.4.2 選定試驗濃度并進行分組

對照組不對幼魚進行麻醉，用K來表示。丁香油麻醉試驗組用D表示，其后數(shù)字表示麻醉劑的濃度，分別為1、2、3，對應(yīng)的濃度分別為8、16、24 mg·L-1。在不同的時間點，包括麻醉1/4、4、8、24 h及復(fù)蘇后24 h時，取樣并測量各組幼魚的生化指標和血清中的溶菌酶含量。值得注意的是，由于16 mg·L-1濃度時麻醉時間超過4 h會導(dǎo)致幼魚死亡，因此在該濃度下，只測1/4、4、8和復(fù)蘇后24 h，24 mg·L-1組只測麻醉1/4 h和復(fù)蘇后24 h。每個麻醉試驗組中包括30尾幼魚，在每個時間段，隨機選擇5尾進行采血并進行后續(xù)的測量。

1.4.3 采血與后續(xù)測定

選擇特定的麻醉時間段的試驗魚，將它們置于冰盤中，冰盤內(nèi)需提前鋪好紗布。使用濕紗布蓋住試驗魚的頭部，再使用一次性無菌注射器在試驗魚的尾部進行采血。采集的血液分裝到4～5個離心管中，隨后在4 ℃的冷凍離心機中以12 000 r·min-1的速度離心10 min，以獲得大于300 μL的上清液樣品。取3份送至大連市體檢中心測量相關(guān)血清生化指標，包括：血糖、總蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素以及尿素氮。剩余的血清用于后續(xù)測定溶菌酶(LZM)活性。溶菌酶用南京建成有限公司的試劑盒進行測定，測定方法為比濁法中的自身對照法，操作按照試劑盒說明書進行，溶菌酶1 g=80 U。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS statistics17.0對試驗結(jié)果進行單因素方差分析，并選擇Duncan(鄧肯)多重比較分析方法對數(shù)據(jù)進行進一步處理。試驗結(jié)果表示形式為平均值±標準差，當P<0.05時，差異被視為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 麻醉劑影響下紅鰭東方鲀幼魚血糖(GLU)變化

根據(jù)表1數(shù)據(jù)可知，部分麻醉組與對照組在GLU水平上存在顯著差異。對照組的GLU水平在24 h內(nèi)保持相對穩(wěn)定，但在麻醉復(fù)蘇24 h后，所有組的GLU水平與麻醉開始后的1/4 h相比均下降。在麻醉過程中，各麻醉組在1/4 h時都顯示為GLU升高。其中，D1、D2組在4、8 h時的GLU水平顯著高于對照組，而D2組在麻醉后4 h時GLU水平急劇上升。值得注意的是，復(fù)蘇24 h后，D1、D2、D3組的GLU水平與對照組之間的差異不顯著。

表1 紅鰭東方鲀幼魚血糖(GLU)受不同濃度麻醉劑的影響Table 1 Effect of different concentrations of anesthetics on GLU of juvenile T. rubripes

2.2 麻醉劑影響下紅鰭東方鲀幼魚血清總蛋白(TP)變化

根據(jù)表2數(shù)據(jù)可知，在麻醉開始后1/4 h時，各個麻醉組的血清TP水平與對照組相比沒有顯著差異。然而，當麻醉進行到4 h和8 h時，D2組的血清TP水平顯著低于對照組，而其他麻醉組在麻醉時間內(nèi)與對照組之間的血清TP水平差異不顯著。在復(fù)蘇24 h后，只有D2組的血清TP水平顯著低于對照組，而其他麻醉組與對照組之間的血清TP水平差異并不顯著。

表2 紅鰭東方鲀幼魚血清總蛋白(TP)受不同濃度麻醉劑的影響Table 2 Effect of different concentrations of anesthetics on TP of juvenile T. rubripes

2.3 麻醉劑影響下紅鰭東方鲀幼魚血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)變化

根據(jù)表3數(shù)據(jù)可知，在麻醉開始后1/4 h時，麻醉組的試驗魚與對照組相比，其血清中的ALT活性沒有顯著差異。但是，D1組在麻醉24 h時，血清中的ALT水平較對照組差異顯著，盡管復(fù)蘇24 h后差異不顯著。而D2組從麻醉后的4 h開始，血清中ALT水平較對照組顯著升高，且該組還出現(xiàn)了魚死亡的情況。值得關(guān)注的是，即使在復(fù)蘇24 h后，D2組的血清ALT水平仍遠高于對照組。

2.4 麻醉劑影響下紅鰭東方鲀幼魚血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)變化

根據(jù)表4數(shù)據(jù)可知，在麻醉開始后1/4 h時，麻醉組的試驗魚與對照組相比，其血清AST活性沒有顯著差異。但是D2組在麻醉后的4 h和 8 h時，該組的血清AST活性明顯高于對照組，而在復(fù)蘇24 h后，只有D2組的血清AST水平仍遠超對照組。

表4 紅鰭東方鲀幼魚血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)受不同濃度麻醉劑的影響Table 4 Effect of different concentrations of anesthetics on AST of juvenile T. rubripes

2.5 麻醉劑影響下紅鰭東方鲀幼魚血清總膽紅素(T-BIL)變化

根據(jù)表5數(shù)據(jù)可知，在麻醉過程中，各個麻醉組的T-BIL水平都顯著高于對照組。然而，在復(fù)蘇24 h后，D1和D2組的T-BIL水平仍然顯著高于對照組，而D3組與對照組之間的T-BIL水平差異不顯著。

表5 紅鰭東方鲀幼魚血清總膽紅素(T-BIL)受不同濃度麻醉劑的影響Table 5 Effect of different concentrations of anesthetics on T-BIL of juvenile T. rubripes

2.6 麻醉劑影響下紅鰭東方鲀幼魚血清尿素氮(BUN)變化

根據(jù)表6數(shù)據(jù)可知，在麻醉開始后1/4 h時，D3組的試驗魚血清中的BUN水平顯著高于對照組；而在麻醉4、8 h時，D2組的試驗魚血清BUN水平明顯高于對照組，而D1組的差異不顯著。然而，在復(fù)蘇24 h后，D2組的試驗魚血清BUN水平明顯低于對照組。

表6 紅鰭東方鲀幼魚血清尿素氮(BUN)受不同濃度麻醉劑的影響Table 6 Effect of different concentrations of anesthetics on BUN of juvenile T. rubripes

2.7 麻醉劑影響下紅鰭東方鲀幼魚血清溶菌酶(LZM)變化

根據(jù)表7數(shù)據(jù)可知，在整個麻醉過程中，D1組試驗魚血清中的LZM活性始終與對照組無顯著差異，與D1組不同，D2、D3組血清中LZM活性與對照組相比顯著降低。而在復(fù)蘇24 h后，除D2組外，D1和D3組的LZM活性均顯著高于對照組。

表7 紅鰭東方鲀幼魚血清溶菌酶(LZM)受不同濃度麻醉劑的影響Table 7 Effect of different concentrations of anesthetics on LZM of juvenile T. rubripes

3 討論

3.1 麻醉劑影響下紅鰭東方鲀幼魚相關(guān)血液生化指標

血糖水平是應(yīng)激指標之一，會受到環(huán)境和攝食情況等多種因素的影響。為了減少這些影響，在試驗開始之前，對所有的試驗魚進行停止投喂24 h處理，以使魚體在開始試驗時能夠達到消化吸收后狀態(tài)[6]。根據(jù)表1數(shù)據(jù)，可以看到在24 h內(nèi)，對照組試驗魚血糖水平一直保持相對穩(wěn)定，而在復(fù)蘇后24 h血糖水平有所下降。這表明，未受到外部因素如麻醉等的干擾時，試驗魚的血糖在24 h內(nèi)保持相對穩(wěn)定，而在復(fù)蘇24 h后時略有下降。而麻醉組在麻醉1/4 h時各組血糖水平較對照組均顯著升高，這種情況的產(chǎn)生可能是由于外界環(huán)境突然發(fā)生較大變化導(dǎo)致魚體發(fā)生應(yīng)激，試驗魚需要消耗能量以使機體保持穩(wěn)定，從而加快肝糖原與肌糖原的降解。此外，由于被麻醉，試驗魚活動受到限制，耗能降低。D1、D2組在4、8 h時的血糖水平較對照組相比顯著升高，原因可能為魚體發(fā)生應(yīng)激糖原降解加快，遠超代謝所消耗。該組結(jié)果與梁政遠等[7]對羅非魚麻醉效果不同，原因可能與濃度的選擇和試驗魚對麻醉劑敏感度的差異有關(guān)。

在機體代謝中，肝臟起著尤為關(guān)鍵的作用，血清蛋白主要在其中合成，肝臟健康與否可通過血清總蛋白水平間接反映。在4～24 h期間，D2組血清總蛋白水平較對照組顯著降低，說明丁香油麻醉劑在濃度為16 mg·L-1時對試驗魚肝臟具有顯著影響。

丁香油對ALT水平影響結(jié)果顯示，在24 h時，D1組ALT明顯高于對照組，而在復(fù)蘇24 h后，這種差異不再顯著，這說明濃度為8 mg·L-1的丁香油在麻醉24 h后會對試驗魚產(chǎn)生影響，但該影響在復(fù)蘇24 h后是可恢復(fù)的。D2組從4 h開始，ALT水平較對照組顯著升高且伴有魚死亡情況發(fā)生，這說明濃度為16 mg·L-1的丁香油在麻醉時不可麻醉超過4 h。D3組丁香油濃度24 mg·L-1時麻醉不超過15 min試驗魚復(fù)蘇24 h后可以恢復(fù)。丁香油濃度16 mg·L-1麻醉8 h時，麻醉過程中細胞受損，復(fù)蘇24 h后試驗魚仍不能恢復(fù)，說明復(fù)蘇24 h后試驗魚仍不能恢復(fù)到正常狀態(tài)，但是ALT較麻醉時期明顯降低，說明此過程是可逆的，與徐啟明等[8]研究結(jié)果一致。血清AST在試驗過程中的變化與ALT相同，這表明，較高濃度的麻醉劑麻醉時間較長(長于4 h)會導(dǎo)致試驗魚心臟及肝臟中某些組織受到損傷，此結(jié)果與齊紅莉等[9]研究結(jié)果相同。

血清中膽紅素的來源主要是紅細胞在老化后被瓦解產(chǎn)生的血紅蛋白所生成，丁香油對幼魚血液總膽紅素影響結(jié)果顯示，麻醉劑使試驗魚血液內(nèi)總膽紅素明顯上升，說明麻醉劑會破壞血液中的衰老紅細胞。

在蛋白質(zhì)代謝過程中，尿素氮是主要的終極產(chǎn)物，是能反映腎功能情況的一種指標[10]。魚體血清中的尿素氮在正常生理水平下處于動態(tài)的平衡。本試驗結(jié)果顯示，D2組在4和8 h時尿素氮含量顯著高于對照組，說明丁香油溶液在16 mg·L-1時4 h內(nèi)可以抑制試驗魚的腎功能，在這段時間內(nèi)，此濃度下丁香油溶液使試驗魚對尿素氮的濾過率降低，導(dǎo)致尿素氮在體內(nèi)蓄積。D3組在麻醉1/4 h時血清中尿素氮含量顯著增加，說明24 mg·L-1丁香油溶液1/4 h即可顯著抑制試驗魚腎功能。復(fù)蘇24 h后D2組血清中尿素氮仍顯著低于對照組，說明該組試驗魚機體蛋白質(zhì)分解仍受抑制。

3.2 麻醉劑影響下紅鰭東方鲀幼魚血清中溶菌酶變化

溶菌酶是一種堿性酶，對細菌細胞壁能起到水解作用，從而使細菌發(fā)生溶解。溶菌酶還可與病毒蛋白結(jié)合，使病毒失去活性，從而在機體內(nèi)起到防御作用[11]。根據(jù)試驗結(jié)果，在麻醉時間內(nèi)，D1組魚體血清中的溶菌酶活性較對照組始終無明顯差異，說明麻醉劑在較低濃度下對血清中溶菌酶活性沒有明顯影響。與低濃度處理組結(jié)果不同，在D2和D3組中，血清中溶菌酶活性顯著降低，此結(jié)果說明丁香油濃度為16 mg·L-1時已超過試驗魚魚體的生理調(diào)節(jié)范圍。在復(fù)蘇24 h后，除D2組以外，其他各組的溶菌酶活性較對照組相比均顯著提高，說明丁香油麻醉后試驗魚魚體抗菌和抗病毒能力得到顯著提高。