右美托咪定經海馬CA1區PPARγ磷酸化在大鼠體外循環腦保護中的作用*

黎杏梅，陳燕樺，鐘妤，盧伊芝，何芳，張璐

（廣西醫科大學第一附屬醫院 麻醉手術中心，廣西 南寧 530021）

體外循環（cardiopulmonary bypass, CPB）即心臟和肺功能由心肺機代替，常用于心臟手術期間支持患者的血液循環和氧合作用。然而在CPB過程中，因人工管道與血液大面積接觸，補體系統、白細胞及內皮細胞的激活，以及器官缺血再灌注損傷等刺激，導致各種促炎細胞因子釋放，誘發全身包括大腦的炎癥反應[1]。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR）是在配體激活后調節基因表達的轉錄因子，由α、β/δ和γ 3種亞型組成，PPARγ的激活可參與脂質和糖代謝、單核細胞和巨噬細胞活化、炎癥反應、細胞分化和凋亡等生理、病理過程[2]。右美托咪定是一種新型的α2腎上腺素受體激動劑，是臨床應用最廣的一種麻醉輔助用藥[3]。研究報道，圍手術期使用右美托咪定可降低接受心臟手術患者術后譫妄的發生率[4]。右美托咪定對神經炎癥具有調節作用，其通過抑制炎癥細胞因子的表達與釋放對腦缺血再灌注損傷發揮神經保護作用[5]。右美托咪定對CPB相關腦損傷的保護作用的具體分子機制尚不夠明確，仍有待闡明。因此本研究通過復制大鼠體外循環模型探討右美托咪定對大鼠體外循環所致腦損傷的保護作用及可能機制，并研究PPARγ在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及用藥

SPF級成年健康雄性SD大鼠36只，體重350～450 g。實驗動物生產許可證號：SCXK桂2020-0003；實驗動物使用許可證號：SYXK桂2020-0004。按照隨機數字表法將實驗大鼠分為假手術組（S組）、體外循環組（C組）、右美托咪定組（D組），每組12只。S組行右頸內靜脈及雙側股動脈穿刺置管，持續2 h，不進行體外循環。C組和D組均行右頸內靜脈及雙側股動脈穿刺置管，采用右頸內靜脈引流、右股動脈灌注的方式復制大鼠體外循環模型，轉流2 h，D組在體外循環前15 min至體外循環2 h期間經右頸內靜脈以5 μg/（kg·h）的速度泵注右美托咪定注射液，C組在此期間恒速泵注等容積的生理鹽水，S組恒速泵注等容積的生理鹽水2 h。

1.2 主要試劑、材料及儀器

1.2.1 試劑 右美托咪定注射液（江蘇恒瑞制藥有限公司），兔抗大鼠GAPDH抗體、兔抗大鼠Cleaved Caspase-3抗體（武漢三鷹生物技術有限公司），兔抗大鼠PPARγ抗體、兔抗大鼠Bax抗體、兔抗大鼠Bcl-2抗體（英國Abcam公司），兔抗大鼠p-PPARγ抗體（美國Gene Tex公司），山羊抗兔Dy Light 800熒光二抗（美國Invitrogen公司），大鼠白細胞介素-6（Interleukin, IL-6）、大鼠中樞神經特異蛋白（central nervous system specific protein, S100β）酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。

1.2.2 材料及儀器 16 G氣管導管（香港友誠生物科技有限公司），小動物呼吸機（ALC-V8S，上海奧爾科特生物科技有限公司），病理顯微鏡（CX21，日本奧林巴斯公司），單通道微量注射泵（浙江史密斯醫學儀器有限公司），酶標儀（美國BioTek儀器公司），Odyssey掃膜儀（美國LI-COR公司），低溫勻漿機（武漢塞維爾生物科技有限公司）。

1.3 大鼠CPB模型的復制

大鼠稱重后用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（5 mL/kg），仰臥位固定于小動物實驗臺上。經口明視下插入小動物專用16 G氣管導管，行機械通氣，調整呼吸機參數，潮氣量10 mL/kg，頻率60次/min，呼吸比1∶2。頸前區、左右腹股溝處備皮消毒后切開皮膚暴露右頸內靜脈、雙側股動脈，大鼠右頸內靜脈置入18 G導管，并將套管尖置于右心房將靜脈血引流至貯血槽；右側股動脈穿刺置管（22 G靜脈穿刺針）作為灌注端；左側股動脈穿刺置管（22 G靜脈穿刺針）接血壓表監測實時動態血壓并進行血氣分析。預先配置18 mL無血預充液填充CPB管路：乳酸鈉林格液8 mL、6%羥乙基淀粉溶液8 mL、5%碳酸氫鈉1 mL、20%甘露醇1 mL、肝素150 IU/ kg。CPB轉流開始前，經右頸內靜脈給予肝素鈉500 IU/kg，當激活全血凝固時間（ACT）≥ 480 s時，開始進行CPB轉流，逐漸增加灌注流量，最終維持在100～120 mL/（kg·min）。CPB轉流期間動脈血氣分析維持在正常值之間，血紅蛋白（Hemoglobin, Hb）保持在7.0～9.0 g/dL，紅細胞壓積在20%～25%。小動物膜式氧合器的氣體入口端氧氣流量為300～400 mL/（kg·min），用直腸溫度計監測體內中心溫度，維持體溫保持在36.5～38.3 ℃。CPB轉流2 h后實驗結束。

1.4 組織標本采集

置管或轉流2 h后，拆除連接管道，各組隨機取6只大鼠剪開肋緣暴露肝臟，剪開胸骨充分暴露心臟，于心尖部剪一小口，插入灌胃針至主動脈根部并固定，剪開右心耳，從灌胃針灌注生理鹽水直至右心耳流出的液體變清澈且肝臟變白，接著灌注4 ℃、4%多聚甲醛溶液150 mL進行固定，斷頭取出完整腦組織，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，行連續冠狀面切片（5 μm厚），用于蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin, HE）染色和免疫組織化學染色。各組取剩余6只大鼠CPB轉流2 h結束后，立即斷頭取出完整腦組織，冰上分離海馬組織，用預冷生理鹽水沖洗干凈，置于-80 ℃冰箱冷凍保存，用于Western blotting檢測。

1.5 HE染色觀察海馬組織病理變化

將1.4制備的各組大鼠腦組織石蠟切片置入60 ℃烤箱烘烤2 h，經二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇脫水，依次蘇木精、伊紅各染色5 min，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，在病理顯微鏡下觀察海馬組織并拍照。

1.6 酶聯免疫吸附試驗測定血漿TNF-α、IL-6、S100β水平

3組大鼠CPB轉流2 h結束后從右頸外靜脈收集靜脈血，4 ℃、1 000 r /min離心15 min，取上清液，分裝并于-80 ℃冰箱冷凍保存。嚴格按照酶聯免疫吸附試驗試劑盒說明書步驟檢測血漿腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、IL-6及S100β水平。

1.7 Western blotting檢測Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、p-PPAR γ/ PPAR γ蛋白表達

取各組大鼠海馬組織加入裂解液和蛋白酶抑制劑進行勻漿完全裂解，孵育離心取上清液，BCA測定蛋白總量。加入上樣緩沖液，沸水浴變性后進行電泳、轉膜。用5%脫脂牛奶封閉2 h，洗膜3次，分別加入一抗Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Cleaved Caspase-3（1∶1 000）、PPARγ（1∶1 000）、p-PPARγ（1∶1 000）及內參GAPDH（1∶5 000），4 ℃孵育過夜。洗膜3次后加入山羊抗兔熒光二抗（1∶10 000），室溫避光孵育2 h。Odyssey雙色熒光成像系統掃膜成像，Image J軟件測定灰度值，以目的蛋白與內參蛋白灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.8 免疫組織化學染色

將1.4中制備的各組大鼠腦組織石蠟切片脫蠟至水，浸入檸檬酸鈉抗原修復液，于高壓鍋中高壓修復6 min，內源性過氧化物酶阻斷劑阻斷，正常山羊工作血清封閉15 min，依次加一抗、酶標二抗、顯色劑，蘇木精復染后脫水、晾干，中性樹脂封片，于光學顯微鏡下觀察海馬CA1區并拍照。棕黃色顆粒即為陽性表達。采用Image-Pro Plus 6.0軟件統計海馬CA1區的總面積（area sum）和p-PPARγ陽性表達的積分光密度（integral optical density, IOD）。陽性產物的平均光密度（average optical density, MOD）=（IOD sum）/（area sum）。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 26.0和Graph Pad Prism 8.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠海馬組織病理變化

光學顯微鏡下顯示S組海馬CA1區細胞形態完整，神經細胞數量未見減少，細胞排列整齊、致密，核仁明顯，包膜完整，細胞與周圍組織聯系緊密。與S組相比，C、D組海馬CA1區形態出現損傷改變，神經細胞數量減少，細胞排列紊亂、疏松，核固縮、深染，細胞與周圍組織聯系疏松，可見細胞死亡。與C組相比，D組海馬CA1區形態損傷較輕，神經細胞數量輕度減少，細胞排列較整齊，可見細胞層次。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織CA1區病理變化 （HE染色×400）

2.2 各組大鼠血漿TNF-α、IL-6、S100β水平比較

ELISA檢測結果顯示，S組、C組和D組大鼠血漿中TNF-α、IL-6、S100β水平比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與S組比較，C組和D組血漿中TNF-α、IL-6、S100β水平升高（P＜0.05）；與C組比較，D組血漿中TNF-α、IL-6、S100β水平降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血漿TNF-α、IL-6、S100β水平比較（n =6，pg/mL，±s）

表1 各組大鼠血漿TNF-α、IL-6、S100β水平比較（n =6，pg/mL，±s）

注：①與S組比較，P＜0.05；②與C組比較，P＜0.05。

組別S組C組D組F 值P 值S100β 22.62±1.83 76.23±4.24①45.24±3.58①②381.916 0.000 TNF-α 1.91±0.17 6.14±0.85①3.75±0.40①②88.838 0.000 IL-6 7.66±0.30 32.82±0.88①26.53±1.00①②153 9.548 0.000

2.3 各組大鼠Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、p-PPAR γ/ PPAR γ蛋白相對表達量的比較

Western blotting檢測結果顯示，S組、C組和D組大鼠Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、p-PPARγ/PPARγ蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與S組比較，C組和D組海馬組織中Bcl-2蛋白相對表達量降低（P＜0.05），Bax、Cleaved Caspase-3、p-PPARγ/PPARγ蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與C組比較，D組海馬組織中Bcl-2蛋白相對表達量升高（P＜0.05），Bax、Cleaved Caspase-3、p-PPARγ/PPARγ蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。見表2和圖2。

表2 各組海馬組織中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、p-PPAR γ/PPAR γ蛋白相對表達量 （n =6，±s）

表2 各組海馬組織中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、p-PPAR γ/PPAR γ蛋白相對表達量 （n =6，±s）

注：①與S組比較，P＜0.05；②與C組比較，P＜0.05。

組別S組C組D組F 值P 值p-PPAR γ / PPAR γ 0.348±0.097 0.858±0.139①0.515±0.125①②27.402 0.000 Bcl-2 0.815±0.103 0.378±0.074①0.632±0.064①②42.962 0.000 Bax 0.403±0.071 0.770±0.088①0.510±0.066①②37.428 0.000 Cleaved Caspase-3 0.288±0.068 0.728±0.072①0.457±0.083①②53.000 0.000

圖2 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、p-PPAR γ/PPAR γ蛋白的表達

2.4 各組海馬p-PPAR γ蛋白表達

p-PPARγ陽性產物呈現棕黃色，主要定位在細胞核。S組、C組及D組海馬CA1區p-PPAR γ陽性產物MOD值分別為（0.19±0.02）、（0.56±0.03）和（0.26±0.03），經方差分析，差異有統計學意義（F=316.224，P=0.000）。與S組比較，C組和D組海馬區p-PPAR γ陽性產物MOD值升高（P＜0.05），與C組比較，D組海馬區p-PPAR γ陽性產物MOD值降低（P＜0.05）。見圖3和圖4。

圖3 各組海馬CA1區p-PPAR γ蛋白表達（免疫組織化學染色×400）

圖4 各組海馬CA1區p-PPARγ陽性產物的MOD值比較（±s）

3 討論

CPB是大多數心臟外科手術的必備手段，但是CPB是一種非生理狀態，可導致腦損傷，CPB后腦損傷是心臟手術的常見并發癥之一。在CPB期間，通過激活補體系統、凝血途徑、白細胞及釋放炎癥細胞因子激活全身炎癥通路，這一過程會導致大腦的局部炎癥加劇、局部缺血和再灌注，以及炎癥細胞的激活加劇等現象[6]。有研究表明，術后早期抑制神經系統炎癥反應可以減少CPB后行為和神經源性結果的長期缺陷[7]。本研究旨在探究右美托咪定如何減輕CPB相關的腦損傷。

本研究參照文獻[8]中的方法復制無血預充大鼠體外循環模型，采用右頸內靜脈引流、右股動脈灌注的方式進行轉流2 h，左股動脈則用來監測血壓與血氣分析。各組模型監測項目均穩定成功。根據本課題組以往的研究，在CPB期間經靜脈以5 μg/（kg·h）的速度泵注右美托咪定具有較好的腦保護作用[9]，故本研究采用5 μg/（kg·h）的速度泵注右美托咪定。

一項Meta分析顯示，右美托咪定在臨床研究和基礎研究中具有減輕應激和炎癥反應的作用[10]。右美托咪定可以通過抑制前額葉皮層和海馬DG區域的炎癥、凋亡及小膠質細胞活化發揮神經保護作用[11]。右美托咪定還可以通過中樞α2腎上腺素受體減輕膿毒癥相關的全身炎癥、神經炎癥、血腦屏障損傷及認知功能障礙[12]。因此，本研究筆者首先探討右美托咪定與CPB引起的炎癥之間的關系。

以往研究表明，CPB期間幾種細胞因子顯著表達，如TNF-α、TGF-β、IL-1β和IL-6[6]。CPB在誘發全身炎癥反應時，腦組織也發生明顯的炎癥反應。CPB心臟手術中，CPB誘發產生的大量炎癥細胞因子隨循環進入腦內，同時因腦組織缺血再灌注、降溫與復溫、微血栓等，腦內也產生了TNF-α、IL-6等炎癥細胞因子，這些細胞因子引起腦組織缺血、缺氧和血腦屏障破壞，其中，腦組織炎癥反應在CPB所致的腦損傷中起重要作用[13]。本研究通過檢測血漿TNF-α和IL-6水平評估CPB期間的炎癥反應狀況，結果顯示，CPB后的C組和D組血漿中TNF-α和IL-6水平較S組均明顯升高，CPB后的D組血漿中TNF-α和IL-6水平較C組明顯降低。本研究結果提示，CPB可引起血漿中TNF-α和IL-6等炎癥細胞因子顯著表達，而右美托咪定可降低血漿中TNF-α和IL-6等炎癥細胞因子的表達、減輕CPB誘發的炎癥反應。

S100β蛋白是一種酸性鈣結合蛋白，可從受損神經元滲漏出來，通過血腦屏障進入外周血，是腦損傷特異且靈敏的生化標志物，升高程度與腦損傷程度密切相關[14]。本研究結果顯示，CPB轉流2 h后，C組和D組血漿中的S100β水平均高于S組，提示CPB過程引發的炎癥反應會對腦組織造成一定的損傷。而與C組比較，D組血漿S100β水平降低，提示CPB給予右美托咪定泵注可以顯著降低血漿中S100β水平。

本研究對大鼠腦組織進行HE染色，并檢測海馬組織中Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3表達來評估右美托咪定對組織病理學變化和神經細胞凋亡的影響。Caspase-3是Caspase家族的核心成員，活化的Caspase-3（Cleaved Caspase-3）是細胞凋亡的關鍵執行因子，可降解DNA復制相關蛋白、凋亡抑制蛋白和細胞骨架蛋白等，從而促進細胞凋亡[15]。本研究結果顯示，右美托咪定能減輕CPB大鼠海馬CA1區神經細胞的損傷程度，同時有效提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調促細胞凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3的表達，減輕神經細胞凋亡，具有腦保護作用。

PPAR γ是核激素受體家族中的配體激活受體，PPAR γ與配體結合后可同時調節炎癥反應和脂質代謝，在多種炎癥基因的RNA聚合酶結合位點與其他核轉錄因子發生交聯反應，進而調節炎癥反應[16]。已知的PPARγ轉錄后修飾有磷酸化、乙酰化、泛素化、糖基化等[17]。轉錄后修飾不僅可以改變蛋白構象，調控蛋白之間的相互作用，而且可以改變受體與配體間的親和力，從而調控下游基因的轉錄。在多種刺激和細胞應激下，PPAR γ發生磷酸化位點各不相同，產生的生物學效應也不同[18]。PPAR γ的激活可以通過已知的絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase, MAPK）的3種途徑來實現磷酸化過程，分別是細胞外信號調節激酶、p38、c-Jun氨基端激酶[19-20]。在激活功能-1功能結構域上PPAR γ在Ser112位點由MAPK介導的磷酸化可調節配體與配體結合域的結合抑制PPAR γ的活性[21]。增加PPAR γ在Ser273位點磷酸化，降低胰島素降解酶表達，增加淀粉樣蛋白裂解酶-1和淀粉樣蛋白前體表達，提高β-淀粉樣蛋白水平，誘導神經元凋亡[22]。本研究結果顯示，右美托咪定降低了CPB大鼠海馬CA1區p-PPARγ/PPARγ比值，說明右美托咪定通過抑制PPARγ磷酸化發揮腦保護作用，對CPB引發的腦損傷產生積極影響。

綜上所述，右美托咪定能夠有效抑制體外循環海馬組織中的PPAR γ磷酸化，減少炎癥因子釋放及降低S100β蛋白表達，這可能是右美托咪定對CPB引發的腦損傷產生保護作用的原因之一。