Hsa_circ_0016600通過調(diào)控miR-149/PTK7軸促進甲狀腺癌細胞遷移的機制

張毅，李飛蕾，董劍達，朱少俊，孫藝晗

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 頸部外科，浙江 溫州 325027

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升[1-2]。盡管甲狀腺癌的診斷和治療已經(jīng)取得了一些進展，但仍然存在著患者易于復(fù)發(fā)和遠程轉(zhuǎn)移的問題，因此總體生存率并不理想[3]。甲狀腺癌的發(fā)病機制受多種因素的影響，包括遺傳和環(huán)境等因素，癌基因和腫瘤抑制因子的失調(diào)是其中的重要原因之一[4]。環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）和微小RNA（microRNA, miRNA）同屬于非編碼RNA。circRNA可以通過與miRNA相互作用，從而調(diào)節(jié)互補信使RNA的表達，進而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[5]。先前的研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0016600可以通過與miR-298相互作用，促進肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展[6]。此外，hsa_circ_0016600還表現(xiàn)出競爭性內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）的功能，能夠吸附miR-495-3p，并導(dǎo)致miR-495-3p在肝癌腫瘤組織中的表達水平下調(diào)，從而提高E2F轉(zhuǎn)錄因子3（E2F transcription factor 3, E2F3）的表達水平[7]。miR-149在各種類型的癌癥發(fā)展過程中被證實既可以充當(dāng)腫瘤抑制因子，也可以作為癌癥相關(guān)微小RNA（oncogenic microRNA, onco-miR）[8]。在肺腺癌中，miR-149通過調(diào)節(jié)ETS17的表達，促進腫瘤細胞的遷移、侵襲和增殖[9]。miR-149還可以通過PI3K/AKT信號通路來調(diào)控RNA結(jié)合蛋白Musashi 2 （MSl2），發(fā)揮抗卵巢癌的作用[10]。同時，PTK7在許多人類惡性腫瘤中高表達，被認為是癌癥治療的一個新靶點，且已有研究發(fā)現(xiàn)PTK7 參與了甲狀腺癌的發(fā)展[11]。基于此，本研究主要探究hsa_circ_ 0016600 對甲狀腺癌細胞遷移的影響及miR-149/PTK7在這一過程中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 從溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院接受手術(shù)治療的甲狀腺癌患者中收集了15例腫瘤組織及鄰近的正常組織樣本。所有組織樣本均由3位病理學(xué)專家進行鑒定和確認，在液氮中冷凍并儲存在-80 ℃以備進行后續(xù)實驗。患者及患者家屬知情同意，本研究已獲得我院倫理委員會的批準(zhǔn)（2021-K-331-01）。

1.1.2 實驗動物 由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供SPF級BALB/C雄性裸鼠15只，5周齡，體質(zhì)量12～18 g，實驗動物許可證：SCXK（京）2019-0010。在恒溫環(huán)境下，進行12 h循環(huán)照明，進行為期7 d的自適應(yīng)飼養(yǎng)，期間提供自由飲食。本研究所有實驗操作均符合中國實驗動物管理規(guī)定，研究方案經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：xmsq2022-0942）。

1.1.3 主要材料與試劑 人甲狀腺癌細胞BCPAP、TPC-1、IHH-4和HTH83以及人正常甲狀腺細胞Nthy- ori 3.1 均購自于上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline,PBS）購自于武漢塞維爾生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和培養(yǎng)基購自于美國Gibco公司；TRIzol試劑盒和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Invitrogen公司；PCR試劑盒購自于上海生工生物公司；CCK-8試劑盒和Fluorescence in Situ Hybridization Kit for RNA試劑盒購自于上海碧云天生物技術(shù)公司；引物序列、亂序無意義陰性序列（sh-NC）、hsa_circ_ 001660小干擾RNA（sh-circ_001600）、miR-149模擬物（mimic）、hsa_circ_0016600野生型質(zhì)粒（hsa_circ_0016600-WT）和突變型質(zhì)粒（hsa_circ_ 0016600-MUT）、PTK7野生型質(zhì)粒（PTK7-3’UTR-WT）和突變型質(zhì)粒（PTK7-3’UTR-MUT）均購自于上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自于上海Yeasen Biotechnology公司；FISH試劑盒購自于廣州銳博生物科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購自于美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 37 ℃水浴復(fù)蘇人正常甲狀腺細胞系Nthy-ori 3.1和人甲狀腺癌細胞系BCPAP、TPC-1、IHH-4和HTH83。Nthy-ori 3.1、BCPAP、TPC-1和HTH83細胞系使用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，IHH-4細胞系使用含10% FBS的DMEM-H培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長密度至80%時，進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期的BCPAP細胞接種于6孔板中（5×105個/孔），使用Lipofectamine 2000試劑盒，分別轉(zhuǎn)染sh-NC（sh-NC組）、sh-circ_0016600 （sh-hsa_circ_0016600組）、miR-149 mimic（miR-149 mimic組）和共轉(zhuǎn)染sh-hsa_circ_0016600與miR-149 mimic（sh-circ_0016600+miR-149 mimic組）。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細胞，進行后續(xù)BCPAP細胞增殖、遷移等指標(biāo)的檢測。

1.2.3 RT-qPCR檢測 利用TRIzol試劑提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒與RT-qPCR試劑盒說明書進行操作，GAPDH作為hsa_circ_0016600、PTK7內(nèi)參，U6作為miR-149內(nèi)參。使用相對定量法2-ΔΔCT法計算細胞中hsa_circ_0016600、miR-149和PTK7的相對表達量，實驗重復(fù)3次。hsa_circ_0016600引物序列為：F 5’-CATATGATCTTCAGGTAGTA-3’，R 5’-TCTTTCTGATAGCCATTCCA-3’；miR-149引物序列為：5’-UCUGCUCCGUGUCUUCACUCCC-3’；PTK7引物序列為：F 5’-CAGTTCCTGAGGATTTCCAAGAG-3’，R 5’-TGCATAGGGCC ACCTTC-3’；GAPDH引物序列為：F 5’-GGAGCGAGATCC CTCCAAAAT-3’，R 5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；U6引物序列為：F 5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，R 5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。

1.2.4 CCK-8實驗檢測細胞增殖 將轉(zhuǎn)染后的細胞接種于96孔板中，每孔滴加10 μL CCK-8試劑，并于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光培養(yǎng)1 h后，酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度值，每孔重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲 使用無血清培養(yǎng)基將處理后BCPAP細胞制成濃度為3×105/mL的細胞懸液，接種于transwell小室的上室中，每孔300 μL（細胞侵襲檢測時上室中預(yù)涂有Matrigel基質(zhì)膠），下室加入含10% FBS的培養(yǎng)液700 μL/孔。置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出小室。使用1 mL 4%多聚甲醛固定細胞10 min后，加入1 mL 0.5%結(jié)晶紫染色30 min，洗去染色液，室溫晾干，于顯微鏡下觀察細胞侵襲數(shù)并拍照。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移 將轉(zhuǎn)染成功后的BCPAP細胞接種于6孔板中（5×105/孔），待細胞生長密度為90%～100%時，使用200 μL移液槍槍頭在每個孔內(nèi)劃痕，PBS洗滌3次，除去漂浮的細胞，加入無血清培養(yǎng)基，置于倒置顯微鏡下進行拍照后，將細胞放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24 h后再次置于倒置顯微鏡下進行拍照。

1.2.7 小鼠異種移植皮下瘤模型 取對數(shù)生長期的BCPAP細胞制成密度為1×107mL-1的細胞懸浮液。將BALB/C裸鼠隨機分成Control組、sh-NC組和shcirc_0016600組，每組5只。Control組的小鼠于右側(cè)背部皮下注射100 μL的BCAPA細胞懸浮液，sh-NC組和sh-circ_0016600組分別在相同位置皮下注射100 μL已轉(zhuǎn)染sh-NC和sh-circ_0016600的BCPAP細胞懸浮液。連續(xù)飼養(yǎng)30 d，從第7天開始每3 d檢測腫瘤體積，按照公式V（mm3）=0.5×腫瘤最大直徑× 腫瘤最長直徑的垂直直徑2，計算腫瘤體積，并繪制生長曲線。30 d后處死小鼠，剝離腫瘤組織塊，拍照標(biāo)記后，將腫瘤組織樣本制成常規(guī)石蠟切片，留后續(xù)進行實驗。

1.2.8 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）實驗 使用FISH試劑盒進行FISH實驗。將人甲狀腺癌組織石蠟切片脫臘后，放入不同濃度乙醇中分別浸泡10 mim，PBS清洗2次，每次清洗2 min。切片浸入已預(yù)熱好蛋白酶工作液，37 ℃消化20 mim，枸櫞酸鈉緩沖液浸洗2次，每次1 mim，切片依次浸入不同濃度的乙醇溶液（70%的乙醇、85%的乙醇、100%的乙醇）中各2 mim，脫水風(fēng)干。滴加變性后的探針混合物于切片上，置于濕盒中，37 ℃過夜孵化。棄蓋玻片和探針液，滴水洗液于組織上，避光洗滌15 mim。棄水洗液，37 ℃枸櫞酸鈉緩沖液避光室溫洗滌2次，每次10 mim，PBS清洗10 mim，滴加DAPI工作液，避光孵育20 mim，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.9 RNA FISH實驗 將BCPAP細胞在4%多聚甲醛中固定10 min后，將BCPAP細胞與circRNA-_0016600探針在37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育過夜。使用DAPI對BCPAP細胞避光染色5 min，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.10 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-149分別與hsa_circ_0016600、PTK7 的靶向調(diào)控關(guān)系。構(gòu)建野生型載體（hsa_circ_0016600-WT、PTK7-3’UTR-WT）和突變型載體（hsa_circ_0016600-MUT、PTK7-3’UTR-MUT）。采用Lipofectamine 2000試劑盒將所構(gòu)建的野生型載體和突變型載體分別與NC mimic或miR-149a-5p mimic 共轉(zhuǎn)染至BCPAP細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測檢查熒光素酶活性。

1.2.11 血管生成實驗 將預(yù)冷的24孔板鋪上加入250 μL低生長因子的基底膜提取物，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱放置30 min，待其固化基底膜提取物，加入細胞懸液（2×104/孔）每組設(shè)3個復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)箱孵育6 h后，于倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0016600在甲狀腺癌組織和細胞系中的表達

與癌旁正常組織相比，甲狀腺癌組織中hsa_circ_0016600 的表達水平顯著升高（P＜0.05）。 hsa_circ_001660在甲狀腺癌細胞系BCPAP、TPC-1、IHH-4和HTH83中的表達水平也顯著高于人正常甲狀腺細胞Nthy-ori 3.1（P＜0.01），見圖1。

圖1 hsa_circ_0016600在甲狀腺癌組織和細胞中的表達

2.2 敲低hsa_circ_0016600對甲狀腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

hsa_circ_0016600被敲低后，BCPAP細胞的增殖能力、侵襲細胞數(shù)、劃痕愈合率均顯著降低（P＜0.01），說明敲低hsa_circ_0016600能夠抑制甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，見圖2。

圖2 敲低hsa_circ_0016600對甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移的影響

2.3 敲低hsa_circ_0016600對小鼠異種移植皮下瘤生長的影響

與Control組相比，sh-circ_0016600 組裸鼠的腫瘤體積顯著減小（P＜0.01），見圖3A、圖3B。FISH實驗結(jié)果顯示，與Control組相比，sh_circ-0016600組裸鼠腫瘤組織中hsa_circ_0016600的表達下調(diào)，見圖3C。這些結(jié)果表明，敲低hsa_circ_0016600可在體內(nèi)抑制甲狀腺癌細胞的生長。

圖3 敲低hsa_circ_0016600對小鼠異種移植皮下瘤生長的影響

2.4 hsa_circ_001660與miR-149的靶向關(guān)系

雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，hsa_circ_ 0016600與miR-149存在結(jié)合位點，與NC mimic組相比，轉(zhuǎn)染miR-149a-5p mimic可顯著降低轉(zhuǎn)染hsa_circ_0016600-WT的細胞相對熒光素酶活性（P＜0.01），而對hsa_circ_0016600-MUT的細胞相對熒光素酶活性無顯著影響（P＞0.05），見圖4A。RNA FISH實驗結(jié)果顯示，hsa_circ_0016600定位于細胞核和細胞質(zhì)中，miR-149主要定位于細胞質(zhì)中，見圖4B。RT-qPCR實驗結(jié)果表明，與癌旁正常組織相比，甲狀腺癌組織中的miR-149表達水平顯著下降（P＜0.05），見圖4C。在甲狀腺癌細胞中miR-149表達也顯著低于人正常甲狀腺細胞Nthy-ori 3.1，見圖4D，這些實驗結(jié)果說明hsa_circ_0016600能夠靶向調(diào)控miR-149。

圖4 hsa_circ_0016600與miR-149的靶向關(guān)系

2.5 hsa_circ_001660靶向miR-149對甲狀腺癌細胞增殖、遷移及血管形成的影響

與Control組相比，miR-149-mimic組甲狀腺癌細胞的增殖能力（P＜0.01）、劃痕愈合能力（P＜0.01）及血管生成能力（P＜0.01）均顯著降低。此 外，與miR-149-mimic組相比，sh-circ_0016600+ miR-149 mimic組甲狀腺癌細胞的增殖能力（P＜0.01）、劃痕愈合能力（P＜0.01）及血管生成能力均降低，見圖5。

圖5 hsa_circ_001660靶向miR-149對甲狀腺癌細胞增殖、遷移和血管形成的影響

2.6 hsa_circ_0016600靶向miR-149對PTK7表達的影響

雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，miR-149 與 PTK7存在連續(xù)結(jié)合位點（圖6A）。與NC mimic組相比，轉(zhuǎn)染miR-149a-5p mimic可顯著降低轉(zhuǎn)染PTK7-3’UTR-WT的細胞相對熒光素酶活性（P＜0.05），而對PTK7-3’UTR-MUT的細胞相對熒光素酶活性無顯著影響（P＞0.05，圖6A），說明miR-149能夠與PTK7靶向結(jié)合。RT-qPCR實驗結(jié)果顯示，與正常組織相比，甲狀腺癌組織中PTK7的表達水平顯著升高（P＜0.01，圖6B）；在甲狀腺癌細胞中PTK7表達也顯著高于人正常甲狀腺細胞Nthy-ori 3.1（P＜0.01，圖6C）。與Control組相比，miR-149 mimic組甲狀腺癌細胞的PTK7表達顯著降低（P＜0.01）。此外，與miR-149-mimic組相比，sh-circ_0016600+miR-149 mimic組甲狀腺癌細胞中的PTK7表達顯著下降（P＜0.01，圖6D）。

圖6 hsa_circ_0016600靶向miR-149對PTK7表達的影響

3 討論

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌相關(guān)性惡性腫瘤，病理類型包括甲狀腺乳頭狀癌，濾泡狀癌、惡性甲狀腺癌和間變性甲狀腺癌[12]。細針穿刺活檢是鑒別良惡性相關(guān)甲狀腺結(jié)節(jié)的金標(biāo)準(zhǔn)，但受到其侵襲性的限制[13-14]。盡管目前的常規(guī)治療療效顯著，但10年內(nèi)致命的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是不可避免的問題[12]，因此尋找新的分子生物標(biāo)志物作為診斷和治療靶點勢在必行。

circRNA是一類具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)的長非編碼RNA，在控制甲狀腺癌發(fā)生的復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用[14]。hsa_circ_0016600是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新circRNA。有研究[6-7，15]表明，在肺腺癌和肝癌組織中，hsa_circ_0016600的表達水平上調(diào)，同時敲低后能夠有效抑制肺腺癌和肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移作用。本研究結(jié)果顯示，在甲狀腺癌組織和細胞系中，hsa_circ_0016600 表達顯著升高。敲低hsa_circ_0016600后能夠顯著抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，且能夠抑制甲狀腺癌細胞的異種移植瘤的生長，故推測hsa_circ_0016600可能參與了甲狀腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移過程。

miRNA在癌癥中被發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)異常，具有刺激細胞增殖和分化的致癌特征[16]。miR-149已被證明能夠在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用，如非小細胞癌[17]、乳腺癌[18]和胃癌[19]等。已有研究證明，在乳頭狀甲狀腺癌組織中，miR-149表達顯著降低，且miR-149能顯著抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[20]。在本研究中，miR-149在甲狀腺癌組織和細胞系中表達下降，且過表達miR-149能抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和血管生成能力，這表明miR-149可能參與了甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展。同時，circRNA也在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究[21-22]表明，一些circRNA可以通過與miR-149結(jié)合，影響癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果中，hsa_circ_0016600可以通過靶向結(jié)合miR-149并負向調(diào)控其表達。同時，敲低hsa_circ_0016600可增強過表達miR-149對甲狀腺癌細胞增殖、遷移和血管形成能力的抑制作用。因此， hsa_circ_0016600 可能是通過調(diào)控miR-149促進甲狀腺癌細胞的增殖和遷移。

PTK7 是酪氨酸激酶家族的成員之一，在食管鱗癌[23]、宮頸癌[24]、胃癌[25]等多種腫瘤中高度過表達，并能夠促進腫瘤細胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移。此外，在人甲狀腺癌組織中也發(fā)現(xiàn)了PTK7的異常高表 達[11]。本研究結(jié)果顯示，PTK7在甲狀腺癌組織和細胞系中表達水平升高，與現(xiàn)有研究一致。PTK7是一種催化缺陷的受體蛋白酪氨酸激酶，抑制PTK7的功能可有效抑制血管生成[26]。在本研究中，過表達miR-149后，甲狀腺癌細胞的血管生成能力下降，這可能與miR-149通過靶向結(jié)合PTK7并負調(diào)控PTK7的表達有關(guān)。此外，敲低hsa_circ_0016600能夠進一步增強由miR-149過表達導(dǎo)致的PTK7表達降低，提示hsa_circ_0016600可能通過靶向調(diào)控miR-149/PTK7軸來促進甲狀腺癌細胞的增殖和遷移。

綜上所述，hsa_circ_0016600 在甲狀腺癌組織和細胞系中高表達，其可能通過靶向調(diào)控miR-149/PTK7軸促進TC細胞的增殖和遷移。hsa_circ_ 0016600有望成為甲狀腺癌未來的診斷與治療的潛在靶點。