靶向FOLR1的脫氧核酶提高鼻咽癌移植瘤對紫杉醇的敏感性

張杰，蘇雪萍，楊子飛，吳賢敏，李和清

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，浙江 溫州 325015；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣西 南寧 530023；3.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 長沙 410013

鼻咽癌好發(fā)于我國南方地區(qū)，其中90%以上的病理類型為低分化鱗癌。對于大多數(shù)鼻咽癌患者來說，治療方法首選放療，因?yàn)榈头只[癌對放療十分敏感，但對于中晚期鼻咽癌患者而言，這種以單純放療為主，甚至是化療為主的治療手段，作用十分有限[1-2]。紫杉醇（Taxol/Paclitaxel）是目前最有效的頭頸鱗癌治療藥物之一，也是治療鼻咽癌的常用藥物[3]。然而，隨著紫杉醇的廣泛應(yīng)用，很多患者因產(chǎn)生了抗藥性而出現(xiàn)化療不成功的情況[4]，因此，研究鼻咽癌對紫杉醇耐藥的機(jī)制，并逆轉(zhuǎn)其耐藥性是必須要解決的問題。

已有研究顯示，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞中葉酸受體FOLR1具有更高的表達(dá)水平，并且在耐藥性腫瘤細(xì)胞中具有更高的表達(dá)能力[5]。早期研究發(fā)現(xiàn)，正常的鼻咽部上皮細(xì)胞中并無FOLR1的表達(dá)，但在鼻咽部癌細(xì)胞，以及紫杉醇耐藥細(xì)胞中，F(xiàn)OLR1的表達(dá)明顯增多，且表達(dá)水平與抗藥性指標(biāo)呈正相關(guān)[6]。“10-23”脫氧核酶（DrzE）作為一種RNA剪切酶，在動(dòng)脈粥樣硬化、感染、腫瘤等方面已被廣泛應(yīng)用，在基因治療上發(fā)揮著重要作用[7-8]。本課題組早期研究以FOLR1的mRNA堿基序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成了一種可以剪切FOLR1的DrzE，發(fā)現(xiàn)CNE-1/taxol耐藥細(xì)胞轉(zhuǎn)染DrzE后，F(xiàn)OLR1基因表達(dá)明顯減少，耐藥細(xì)胞對紫杉醇的敏感性明顯增強(qiáng)[6]。筆者進(jìn)一步通過靶向FOLR1的DrzE干擾鼻咽癌動(dòng)物移植瘤體內(nèi)FOLR1的表達(dá)，探討其能否提高鼻咽癌對紫杉醇的敏感性。

1 材料和方法

1.1 主要材料

本研究所需要的人鼻咽癌CNE-1 細(xì)胞株及紫杉醇耐藥CNE-1/taxol細(xì)胞株由湘雅三醫(yī)院譚國林教授課題組贈(zèng)送。RPMI-1640培養(yǎng)基和OPTI-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液（美國Gibco公司），胰蛋白酶消化液（美國Hyclone公司），Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），紫杉醇注射劑（北京四環(huán)醫(yī)藥科技股份有限公司），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（美國Bio-Rad公司），ECL顯色液（美國Abcam公司），F(xiàn)OLR1一抗和二抗（美國Sigma公司），RIPA裂解緩沖液和TRIzol試劑（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（日本Takara公司），THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（日本TOYOBO公司），F(xiàn)OLR1和β-actin引物（上海生工生物工程有限公司），DrzE（上海生工生物工程有限公司）。

本實(shí)驗(yàn)所需BALB/c亞系的裸鼠購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，數(shù)量40只，雄性，年齡6～8周，體質(zhì)量約20 g。動(dòng)物許可證號：SCXK（湘）2009-0004，SPF級飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 取凍存的CNE-1 細(xì)胞及CNE-1/taxol細(xì)胞，37 ℃水浴箱內(nèi)輕搖使其解凍。常溫下在超凈臺(tái)內(nèi)將解凍的細(xì)胞懸液移至離心管，再各加入6 mL含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，并進(jìn)行離心（1 000 r/min，5 min）。棄上清液，各離心管內(nèi)加入5 mL新鮮培養(yǎng)液重懸后移入250 mL培養(yǎng)瓶，并加入10 mL培養(yǎng)液。最后在恒溫培養(yǎng)箱中放入培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)液，并在細(xì)胞覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶壁時(shí)進(jìn)行傳代并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 裸鼠成瘤 當(dāng)細(xì)胞生長處于對數(shù)期時(shí)將其消化，經(jīng)過離心（1 000 r/min，5 min）和漂洗，再次離心（1 000 r/min，5 min）并加入5 mL培養(yǎng)液重懸。用適量Hank’s液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/mL置于冰上。取4只裸鼠用于細(xì)胞懸液成瘤，使用注射器將兩種細(xì)胞懸液注射到同一只裸鼠的皮下，每個(gè)部位注射約0.2 mL。裸鼠按照左為CNE-1細(xì)胞，右為CNE-1/taxol細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)分批次、多部位接種。隔日記錄兩種細(xì)胞接種后成瘤的情況及其大小變化情況。當(dāng)移植瘤體直徑到8 mm左右時(shí)用斷椎法將裸鼠殺死，并浸泡于75%的乙醇溶液中。在無菌超凈臺(tái)上使用無菌手術(shù)剪和無齒鉗，解剖瘤體后將其在適量培養(yǎng)液中浸泡。選擇生長良好且沒有壞死的腫瘤組織，并將其剪碎至直徑約1 mm的小塊，浸泡在培養(yǎng)基中備用。使用1%戊巴比妥注射液腹腔注射麻醉裸鼠，背部移植區(qū)域予絡(luò)合碘多次消毒。選擇相對松弛的皮膚作為移植點(diǎn)，并用手術(shù)剪在兩側(cè)各開一個(gè)直徑約2 mm的小口，使用無齒鑷鈍性分離皮膚和皮下組織。將小塊瘤體放入皮下，輕輕擠壓以排出間隙氣體，最后縫合傷口。根據(jù)上述方法，在36只裸鼠的左側(cè)背部皮下接種CNE-1小瘤塊，右側(cè)背部皮下接種CNE-1/taxol小瘤塊[9]。接種瘤塊后第2天開始記錄裸鼠的瘤情。此外，在標(biāo)本瓶中放入兩種細(xì)胞的瘤塊樣本并置入液氮冷凍，用于后續(xù)檢測FOLR1 mRNA和蛋白在給藥前的表達(dá)量。

1.2.3 分組給藥及數(shù)據(jù)測量 除去3只成瘤效果不佳和1只意外死亡的裸鼠，余32只成瘤的裸鼠隨機(jī)分成4組，每組8只。14 d后當(dāng)腫瘤直徑長至約5 mm時(shí)，開始統(tǒng)一給藥。具體的分組、給藥方式和劑量見表1。在每次隔日給藥之前，測量腫瘤的體積（V），V=0.5ab2（a和b分別代表移植瘤體的長徑和短徑），并繪制腫瘤生長曲線。每組連續(xù)給藥7 d后觀察3 d，最后手術(shù)取出移植瘤體，測量腫瘤體積，并計(jì)算移植瘤體的增長倍數(shù)及其抑制率。移植瘤體的增長倍數(shù)=給藥后第10天瘤體體積/給藥前瘤體體積；移植瘤體抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組瘤體增長倍數(shù)/對照組增長倍數(shù)）×100%。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方式、劑量（1次/d，共7次）

1.2.4 RT-qPCR檢測給藥前后FOLR1 mRNA的表達(dá)變化 取液氮罐中凍存的給藥前及給藥后各組鼻咽癌CNE-1及CNE-1/taxol瘤塊，切成約0.5 cm×0.5 cm大小，放入離心管用勻漿鉆頭制備組織勻漿。小瘤塊的總RNA由TRIzol試劑提取，cDNA合成試劑盒反 轉(zhuǎn)錄得到。Applied Biosystems CFX96實(shí)時(shí)PCR系 統(tǒng)用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix試劑盒進(jìn)行RTqPCR。FOLR1的靶向mRNA的引物（正向：5’GAATGCCTG CTGTTCTACCA3’；反向：5’TGCGACAATCTTCCCACC3’）已反復(fù)驗(yàn)證。qRT-PCR反應(yīng)條件設(shè)置為：預(yù)變性溫度95 ℃，15 s，1個(gè)循環(huán)；變性溫度95 ℃，15 s，退火溫度60 ℃，60 s，延伸溫度72 ℃，20 s，40個(gè)循環(huán)。用β-actin對各mRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化。ΔΔCt法用于計(jì)算結(jié)果。

1.2.5 Western blot檢測給藥前后FOLR1蛋白的表達(dá)變化 制備各組瘤體的組織勻漿，加入到RIPA裂解緩沖液中裂解，蛋白質(zhì)濃度用BCA法進(jìn)行測量。將蛋白樣本用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離，后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用含5%脫脂奶粉和0.1% Tween 20的TBS封閉緩沖液進(jìn)行封閉1 h，在4 ℃冰箱內(nèi)于TBST中與一抗孵育約20 h。TBST洗膜3次，置于HRP偶聯(lián)的二抗溶液（1:5 000）中孵育1 h，用TBST洗膜3次，最后用ECL顯色液對樣品進(jìn)行顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 結(jié)果

2.1 兩種方法裸鼠移植瘤生長情況

裸鼠接種0.2 mL的CNE-1和CNE-1/taxol細(xì)胞懸液后，其生命力和生活習(xí)性基本同前。裸鼠在接種后7 d內(nèi)，接種的地方會(huì)形成略呈粉色、質(zhì)地稍軟的粟粒大小結(jié)節(jié)，見圖1A。后期結(jié)節(jié)逐漸消退，并進(jìn)入潛伏期，其時(shí)間在28～36 d不等。一般情況下，接種后30 d左右，會(huì)再次出現(xiàn)粟粒大小的結(jié)節(jié)，其顏色同周圍膚色，質(zhì)地堅(jiān)韌，見圖1B，后結(jié)節(jié)迅速增大。移植瘤體的生長時(shí)間約為45 d，其平均長徑可長到約8 mm，其形狀可呈橢圓形或呈分葉狀。此外，CNE-1細(xì)胞的成瘤率為62.5%（16個(gè)成瘤點(diǎn)中成功成瘤10個(gè)），CNE-1/taxol細(xì)胞的成瘤率為50%（16個(gè)成瘤點(diǎn)中成功成瘤8 個(gè)）。新鮮小瘤塊移植成功 后，36只裸鼠全部出現(xiàn)腫瘤生成，且無明顯潛伏期，見圖1C。瘤體逐天增大，約14 d見圓球形或橢球形腫瘤，直徑約5 mm，見圖1D。

圖1 裸鼠成瘤情況

2.2 給藥前后裸鼠移植瘤生長狀況

給藥前32只裸鼠CNE-1和CNE-1/taxol移植瘤體都表現(xiàn)為局灶結(jié)節(jié)狀，且速度相似。瘤塊移植14 d測量瘤體體積，其中CNE-1為（80.13±24.50）mm3，CNE-1/taxol為（59.10±18.72）mm3，CNE-1瘤體體積顯著大于CNE-1/taxol瘤體（t=3.82，P=0.004）。給藥后，各組的移植瘤體生長速度有所差異，其中CNE-1瘤體中紫-脫組及紫杉醇組的生長速度較對照組及脫氧核酶組減慢，而CNE-1/taxol瘤體中紫-脫組的生長速度較其他組速度明顯減慢，見圖2。

圖2 各組移植瘤體的生長曲線

在CNE-1移植瘤體中，3組實(shí)驗(yàn)組分別與對照組相比，瘤體體積增長倍數(shù)都有明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），可以認(rèn)為單獨(dú)或聯(lián)用紫杉醇和脫氧核酶都可有效抑制鼻咽癌CNE-1細(xì)胞增長。對比CNE-1/taxol移植瘤體中的3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對照組，發(fā)現(xiàn)脫氧核酶組和紫-脫組的瘤體體積增長倍數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05或P＜0.01），表明脫氧核酶單用或與紫杉醇聯(lián)用可以抑制CNE-1/taxol瘤體的生長。然而，紫杉醇組單用后，瘤體體積增長倍數(shù)與對照組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這表明鼻咽癌耐藥細(xì)胞CNE-1/taxol對紫杉醇具有耐藥特性。見表2。

表2 各組裸鼠皮下移植瘤體增長倍數(shù)比較（每組n=8，±s）

表2 各組裸鼠皮下移植瘤體增長倍數(shù)比較（每組n=8，±s）

與對照組比：aP ＜0.05，bP ＜0.01。

?

由于不同的瘤體體積和生長速度都不一樣，為了減少這種差異，采用比較瘤體生長抑制率的方法對不同細(xì)胞間及不同藥物間的差異做進(jìn)一步比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用紫杉醇時(shí)，CNE-1/taxol組的瘤體抑制率低于CNE-1組（P＜0.01）；單獨(dú)使用DrzE時(shí)，CNE-1/taxol組的瘤體抑制率高于CNE-1組（P＜0.05）；當(dāng)紫杉醇和脫氧核酶聯(lián)合使用時(shí)，兩種瘤體均呈現(xiàn)出明顯的抑制作用，但兩組的抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在同一類型的瘤體內(nèi)比較，CNE-1和CNE-1/taxol移植瘤體中，聯(lián)合使用紫杉醇和脫氧核酶的瘤體抑制率均顯著高于單藥組（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表3 各組裸鼠皮下移植瘤體的生長抑制率比較（每組n=8，±s，%）

表3 各組裸鼠皮下移植瘤體的生長抑制率比較（每組n=8，±s，%）

與紫-脫組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與CNE-1移植瘤體比：cP＜0.05，dP＜0.01。

?

2.3 RT-qPCR檢測藥物處理前后FOLR1 mRNA表達(dá)的變化

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，給藥前CNE-1/taxol移植瘤中FOLR1的mRNA表達(dá)量為12.47±0.49，高于CNE-1移植瘤的1.00±0.02（t=65.72，P＜0.001）。給藥后紫杉醇組的FOLR1 mRNA在CNE-1和CNE-1/taxol瘤體中的表達(dá)量與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但紫-脫組、脫氧核酶組的FOLR1 mRNA表達(dá)量較對照組均顯著下降（P＜0.05），見圖3。

圖3 兩種移植瘤FOLR1 mRNA相對表達(dá)量的比較

2.4 Western blot檢測藥物處理前后FOLR1蛋白表達(dá)的變化

Western blot檢測結(jié)果顯示，給藥前CNE-1/taxol移植瘤細(xì)胞中FOLR1的蛋白表達(dá)量較CNE-1明顯增加（P＜0.01），見圖4A、圖4B。給藥后紫杉醇組的FOLR1在CNE-1和CNE-1/taxol瘤體中的蛋白表達(dá)與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而單用脫氧核酶組和紫-脫組兩種瘤體的FOLR1表達(dá)量較對照組有顯著下降（P＜0.05），見圖4C-4F。

圖4 給藥前后兩種移植瘤FOLR1蛋白相對表達(dá)量的比較

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌耐藥性與FOLR1[6]、tau[12]、txr1[13]、peg10[14]、dlc1[14]、chfr[14]等基因存在相關(guān)性。雖然細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示FOLR1靶向的DrzE可以提高CNE-1/Taxol對紫杉醇的敏感性，但尚未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。因此，本研究的目標(biāo)是通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立鼻咽癌CNE-1及CNE-1/taxol的裸鼠移植瘤模型，并進(jìn)一步探究靶向FOLR1的DrzE是否能夠下調(diào)FOLR1的表達(dá)來增加CNE-1/taxol對紫杉醇的敏感性。

紫杉醇與微管蛋白結(jié)合后微管蛋白發(fā)生聚合而解聚受阻，導(dǎo)致細(xì)胞在有絲分裂過程中紡錘體形成受阻，細(xì)胞停滯于G2/M期，增殖速度減慢并最終死亡[15]。前期研究用紫杉醇大劑量沖擊并逐漸加量的方法誘導(dǎo)并逐步篩選出耐紫杉醇細(xì)胞—CNE-1/taxol細(xì)胞[16]。耐藥機(jī)制考慮與細(xì)胞中微管蛋白表達(dá)異常并進(jìn)一步引起微管蛋白結(jié)構(gòu)異常有關(guān)[17]。微管蛋白的突變和相關(guān)蛋白比例的異常，可能會(huì)使紡錘體在細(xì)胞復(fù)制過程中形成障礙，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞G2/M期延長，從而減緩耐藥性細(xì)胞的增殖速度[18-19]。 有研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌耐藥細(xì)胞株相對于親本細(xì)胞，細(xì)胞倍增時(shí)間略有延長，其G0/G1期顯著下降，而G2/M期則相對上升[20]。此外，瘤體生長依賴瘤內(nèi)血管增生，其中VEGF發(fā)揮了重要的作用[21]。早期研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌CNE-1移植瘤與CNE-1/Taxol移植瘤相比，VEGF表達(dá)量明顯增加，導(dǎo)致其血管生成增多，腫瘤生長更快[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌CNE-1瘤體的生長速度比CNE-1/taxol瘤體更快，成瘤率也更高，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了鼻咽癌耐藥細(xì)胞增生緩慢的特點(diǎn)。

葉酸參與許多生物過程，如基因合成和修復(fù)、細(xì)胞分裂和蛋白質(zhì)代謝等。腫瘤細(xì)胞的增殖需要大量的葉酸，而葉酸受體FOLR1在這一過程中扮演著重要的角色，所以大多數(shù)腫瘤組織中FOLR1都會(huì)顯著增加[5]，并且研究發(fā)現(xiàn)在紫杉醇抗藥細(xì)胞中，F(xiàn)OLR1的表達(dá)更多[22]。本研究通過靶向FOLR1的DrzE的特異性催化作用，對FOLR1的mRNA進(jìn)行剪切，使FOLR1的表達(dá)受到進(jìn)一步干擾。細(xì)胞吸收葉酸的能力在FOLR1數(shù)量減少的情況下減弱，造成細(xì)胞攝入葉酸的數(shù)量減少，使細(xì)胞內(nèi)的RNA、DNA和蛋白質(zhì)合成進(jìn)一步受阻。細(xì)胞層面的變化包括細(xì)胞增殖速度的減緩，以及細(xì)胞死亡的增加，而體現(xiàn)在組織層面就會(huì)出現(xiàn)裸鼠移植瘤的生長變慢。

有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax的表達(dá)受FOLR1所調(diào)控，上調(diào)FOLR1會(huì)增加Bcl-2的表達(dá)，而降低Bax的表達(dá)，最終通過抑制Caspase信號通路來減弱化療藥物的促凋亡作用[23]。而紫杉醇等化療藥可以介導(dǎo)多種信號通路讓Bcl-2 發(fā)生磷酸化而失去活性，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞微管損傷，最終引起細(xì)胞死亡[3]。但在FOLR1的作用下，因紫杉醇引起的Bcl-2 發(fā)生磷酸化明顯減弱，導(dǎo)致紫杉醇的微管聚合作用減弱，進(jìn)而引起紫杉醇耐藥細(xì)胞的生成。此外，前期研究發(fā)現(xiàn)Tau蛋白的高表達(dá)與鼻咽癌紫杉醇耐藥相關(guān)[12]，且有研究發(fā)現(xiàn)Tau和FOLR1的表達(dá)互為促進(jìn)[24]。我們通過實(shí)驗(yàn)比較CNE-1及紫杉醇耐藥的CNE-1/taxol移植瘤的瘤體抑制率，發(fā)現(xiàn)相較于單用紫杉醇和DrzE，兩藥聯(lián)用時(shí)其瘤體抑制率明顯提高，且兩藥聯(lián)合時(shí)，CNE-1/taxol的瘤體抑制率與CNE-1相比無顯著差異，可能也預(yù)示靶向FOLR1的DrzE可以使耐藥細(xì)胞CNE-1/taxol對紫杉醇的敏感性提高，逆轉(zhuǎn)其耐藥性，使其與親本細(xì)胞CNE-1對紫杉醇的敏感性相當(dāng)。但是，分子機(jī)制上否通過降低Tau、Bcl-2的表達(dá)或是否存在其他可能途徑仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，本研究顯示靶向FOLR1的DrzE可以成功轉(zhuǎn)染裸鼠移植瘤體，使得移植瘤體生長減慢，并且增加鼻咽癌紫杉醇耐藥移植瘤對紫杉醇的敏感性，為鼻咽癌紫杉醇耐藥提供了一種可能的解決方案。