環(huán)境因素和繁殖特性對(duì)真江蘺受精效率的影響*

張贏月, 楊金鑫, 齊 聰, 杜啟睿, 徐 滌

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院, 海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003)

作為廣泛分布在沿海潮間帶的大型海洋紅藻,真江蘺(Gracilariavermiculophylla)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。與近源物種龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)一樣,真江蘺也可作為提取瓊膠的重要原料,其瓊膠含量高達(dá)16%～28%,且藻膠質(zhì)量較高,屬于重要的海洋生物資源[1-2]。此外,真江蘺提取物具有對(duì)黃嘌呤氧化酶和酪氨酸酶進(jìn)行抑制作用藥用價(jià)值[3-4]。真江蘺對(duì)氮磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和重金屬具有較強(qiáng)的吸收能力,可顯著降低海水富營(yíng)養(yǎng)化,改善水質(zhì)環(huán)境,抑制有害赤潮藻的生長(zhǎng)[5-6]。

據(jù)報(bào)道,江蘺已成為栽培規(guī)模超1萬(wàn)hm2的全國(guó)第二大栽培海藻,年產(chǎn)約36萬(wàn)t干品[7]。目前國(guó)際上對(duì)江蘺的養(yǎng)殖,無(wú)論是智利江蘺(G.chilensis)還是龍須菜都是采用依賴營(yíng)養(yǎng)繁殖的夾苗生產(chǎn)方式[8-9],優(yōu)點(diǎn)是增殖速度快,對(duì)養(yǎng)殖戶來(lái)說(shuō)操作簡(jiǎn)單易行。但隨著養(yǎng)殖范圍的擴(kuò)大以及養(yǎng)殖品種栽培時(shí)間和密度的增加,栽培海區(qū)會(huì)出現(xiàn)病害頻現(xiàn)和藻種性狀退化的問(wèn)題。此外,栽培季節(jié)苗種需求量的不斷增加也制約著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而這些問(wèn)題的解決方法之一就是需要建立以有性繁殖為基礎(chǔ)的采孢子育苗體系,這涉及對(duì)江蘺的生活史及發(fā)育調(diào)控的深入研究。

真江蘺擁有真紅藻綱(Florideophyceae)典型的三世代型生活史,包括二倍體的四分孢子體世代(Tetrasporophyte)和果孢子世代(Carposporophyte),以及單倍體的配子體世代(Gametophyte)[10-12]。真江蘺的四分孢子體及雌、雄配子體盡管屬于等世代的分枝狀藻體,但成熟后特征明顯,表觀上很容易區(qū)分,可分別觀察到深紅色的四分孢子囊、突出的果孢子體和開(kāi)口較大的精子囊窩[13],是進(jìn)行江蘺科物種發(fā)育研究的好材料。

要實(shí)現(xiàn)完全人工可控的孢子采苗必須能在實(shí)驗(yàn)室保存優(yōu)良品系并建立起成熟的促進(jìn)孢子形成和釋放的方法和流程。但到目前,對(duì)孢子放散過(guò)程和存活率影響條件的研究較多[14-16],而對(duì)孢子形成過(guò)程的影響因子研究較少。常用于采苗的果孢子是由江蘺雄、雌配子體分別產(chǎn)生的精、卵受精后形成的果孢子體產(chǎn)生和釋放的,因此其產(chǎn)量會(huì)受到?jīng)Q定受精效率的各種因素的影響。本實(shí)驗(yàn)將研究真江蘺的繁殖特征因素(如精子數(shù)量、共培養(yǎng)時(shí)間(雌、雄配子體)、精子放置時(shí)間、配子體脫水時(shí)間)和環(huán)境因素因素(溫度、光照強(qiáng)度、光照周期)對(duì)受精效率的影響,以期為其依賴有性生殖的采孢子育苗以及雜交育種提供數(shù)據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 用于雜交實(shí)驗(yàn)的真江蘺雌、雄配子體

本實(shí)驗(yàn)所用真江蘺雌配子體和雄配子體的成熟藻株于2021年6月采自青島浮山灣潮間帶(36°0′N,120°2′E)。材料采集回實(shí)驗(yàn)室后首先使用毛刷進(jìn)行清理,去除雜藻及其它附生物,然后用消毒海水多次沖洗。下列實(shí)驗(yàn)若無(wú)特殊說(shuō)明則培養(yǎng)條件為:改良的f/2海水培養(yǎng)基、溫度23 ℃、光照35 μmol·m-2·s-1、光照周期12L/12D。實(shí)驗(yàn)前將真江蘺雌、雄藻株在恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)兩周,使藻體適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境,同時(shí)排除采集時(shí)雌配子體上可能已有果胞受精而引起的實(shí)驗(yàn)誤差。

實(shí)驗(yàn)時(shí)所用雌、雄配子體藻段都是保留有尖部生長(zhǎng)點(diǎn)且長(zhǎng)度大約為3～4 cm的一、二級(jí)分枝,平均分配到每個(gè)實(shí)驗(yàn)組,以消除分枝間可能出現(xiàn)的個(gè)體差異。

1.2 真江蘺雌、雄配子體的受精實(shí)驗(yàn)設(shè)置

下列實(shí)驗(yàn)如無(wú)特別說(shuō)明都采用雌、雄配子體共培養(yǎng)的方式完成受精過(guò)程,具體設(shè)置如下:將預(yù)培養(yǎng)的真江蘺雄配子體和雌配子體藻段各3段放在一個(gè)三角瓶中共培養(yǎng),每日手動(dòng)搖晃3次,7 d后每3 d更換一次培養(yǎng)基,30 d后對(duì)每條雌配子體上形成的果孢子體進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果取平均值。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣。

1.3 精子數(shù)量對(duì)受精效率的影響

真江蘺雄配子體藻枝表面遍布精子囊窩,為避免藻枝從尖端到基部不同位置精子成熟度不同,本實(shí)驗(yàn)中只取成熟度相似的藻枝中段大約5 cm的部分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將不同長(zhǎng)度的雄配子體與共培養(yǎng)的雌配子體藻枝進(jìn)行受精,其長(zhǎng)度分別為2、6、10、14、16 cm,由1條或多條藻枝組成。

1.4 雌、雄配子體共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)受精效率的影響

在雌、雄配子體共培養(yǎng)的時(shí)間為0.5、1、3、5 h時(shí),分別取出雌配子體,瀝干水分后放入到新的含150 mL f/2海水培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 精子放置時(shí)間對(duì)受精效率的影響

選取總長(zhǎng)度約90 cm的成熟雄配子體藻段置于500 mL錐形瓶中,加入400 mL f/2海水培養(yǎng)基,100 r/min搖床振蕩6 h促進(jìn)精子釋放,然后取出雄配子體,獲得精子懸液。將該精子懸液平均分裝后分別靜置0、2、4、6、12 h,放入雌配子體藻枝進(jìn)行受精,7 d后開(kāi)始每3 d換一次水,30 d后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 雄配子體脫水時(shí)間對(duì)精子放散的影響

用吸水紙吸去成熟雄配子體藻段的表面水分后,平均分為4組,分別干燥脫水0、0.5、1、2 h,然后將各組藻枝分別放入三角瓶中100 r/min搖床振蕩6 h,使精子放散。將振蕩獲得的精子懸液平均分裝到3個(gè)150 mL三角瓶中,每瓶100 mL,分別放入3根成熟雌配子體藻段,于搖床上溫和旋轉(zhuǎn)的情況下,與精子共培養(yǎng)12 h,后進(jìn)行換水和計(jì)數(shù),過(guò)程同上。

1.7 溫度對(duì)受精效率的影響

按溫度15、20、25 ℃將實(shí)驗(yàn)材料分為3組,對(duì)真江蘺雌、雄配子體進(jìn)行共培養(yǎng)。

1.8 光照強(qiáng)度對(duì)受精效率的影響

按光照強(qiáng)度15、25、35、45 μmol·m-2·s-1將實(shí)驗(yàn)材料分為4組,對(duì)真江蘺雌、雄配子體進(jìn)行共培養(yǎng)。

1.9 光照周期對(duì)受精效率的影響

按光照周期8L/16D、12L/12D、14L/10D、16L/8D、24L/0D(全光照)將實(shí)驗(yàn)材料分成5組,對(duì)真江蘺雌、雄配子體進(jìn)行共培養(yǎng)。

1.10 受精效率計(jì)算方法及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

據(jù)報(bào)道和觀察,真江蘺雌配子體果胞頂端的受精絲不延伸出藻體表面,顯微觀察無(wú)法直接判斷受精情況,因此只能間接使用單位長(zhǎng)度藻枝上形成的果孢子體數(shù)量來(lái)表示受精效率。

各實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)30 d后記錄每條雌配子體上形成的果孢子體數(shù)量,然后取平均值。數(shù)據(jù)采用ANOVA分析及t-檢驗(yàn)來(lái)確定各實(shí)驗(yàn)組果孢子體數(shù)的差異,P<0.05為差異顯著,P<0.01為極顯著。各圖數(shù)據(jù)上都標(biāo)明標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)誤差線。

2 結(jié)果

2.1 精子數(shù)量對(duì)受精效率的影響

如圖1所示,以不同雄配子體長(zhǎng)度代表的精子數(shù)量對(duì)受精效率影響顯著(P<0.05)。前4組的果孢子體數(shù)目隨著雄配子體長(zhǎng)度的增加而顯著增加,在雄配子長(zhǎng)度為14 cm時(shí),果孢子體數(shù)量出現(xiàn)最大值,而當(dāng)雄配子體長(zhǎng)度增加到16 cm時(shí),果孢子體數(shù)沒(méi)有明顯增長(zhǎng)。

圖1 精子數(shù)量對(duì)真江蘺受精效率的影響

2.2 雌、雄配子體共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)受精效率的影響

如圖2所示,雌、雄配子體共培養(yǎng)的時(shí)間對(duì)受精效率有極顯著影響(P<0.01),隨著共培養(yǎng)時(shí)間的逐漸延長(zhǎng),果孢子體數(shù)目呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)在雌、雄配子體的共培養(yǎng)時(shí)間僅有0.5 h時(shí),雌配子體上就可以形成果孢子體,而在5 h時(shí)果孢子體數(shù)目出現(xiàn)最大值。

圖2 真江蘺雌、雄配子體共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)受精效率的影響

2.3 精子放置時(shí)間對(duì)精子活性的影響

如圖3所示,精子放置時(shí)間對(duì)其受精效率有顯著的影響(P<0.05)。精子釋放后隨著放置時(shí)間的增加,雌配子體上產(chǎn)生的果孢子體數(shù)逐漸減少,說(shuō)明精子活力逐漸降低。放置12 h后,共培養(yǎng)的雌配子體上已沒(méi)有果孢子體形成。多重比較結(jié)果可知,在放置2 h時(shí),精子仍能保持較高活性,同對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05);而4、6、12 h處理組均同0 h對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 真江蘺精子懸液放置時(shí)間對(duì)精子活性的影響

2.4 雄配子體脫水時(shí)間對(duì)受精效率的影響

如圖4所示,真江蘺雄配子體的脫水時(shí)間對(duì)受精效率有極顯著影響(P<0.01),說(shuō)明放散的精子量差異顯著。多重比較可知,2 h處理組同0、0.5、1 h處理組果孢子體數(shù)均有顯著性差異,而0、0.5、1 h處理組間沒(méi)有顯著差異。結(jié)果表明脫水處理2 h后可顯著刺激精子的釋放。

圖4 真江蘺雄配子體脫水時(shí)間對(duì)受精效率的影響

2.5 溫度對(duì)真江蘺受精效率的影響

如圖5所示,溫度對(duì)真江蘺受精效率影響極顯著(P<0.01)。20和25 ℃條件下真江蘺能正常受精,而15 ℃組中沒(méi)有果孢子體形成。25 ℃時(shí)雌配子體形成的果孢子體數(shù)量最高,是20 ℃組的2倍左右。因此,本實(shí)驗(yàn)中25 ℃是真江蘺受精的最適溫度。

圖5 溫度對(duì)真江蘺受精效率的影響

2.6 光照強(qiáng)度對(duì)真江蘺受精效率的影響

如圖6所示,光照強(qiáng)度對(duì)真江蘺受精存在顯著影響(P<0.05)。結(jié)果顯示,光照強(qiáng)度為25 μmol·m-2·s-1時(shí),果孢子體數(shù)量出現(xiàn)最大值(P<0.01),為真江蘺受精的最適光照強(qiáng)度,而更低和更高的光強(qiáng)并不適合真江蘺的受精過(guò)程。

圖6 光照強(qiáng)度對(duì)真江蘺受精過(guò)程的影響

2.7 光照周期對(duì)真江蘺受精效率的影響

如圖7所示,光照周期對(duì)真江蘺受精具有顯著影響(P<0.05)。隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng),雌配子體上的果孢子體數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)光照周期為14L/10D時(shí),雌配子體上的果孢子體數(shù)出現(xiàn)最大值,為真江蘺受精的最適光照周期。

圖7 光照周期對(duì)真江蘺受精效率的影響

3 討論

江蘺孢子育苗的研究主要集中在孢子放散和培育后期的條件優(yōu)化。例如有研究顯示,溫度、光照強(qiáng)度和鹽度對(duì)真江蘺四分孢子放散和發(fā)育具有顯著影響(P<0.05),溫度20～25 ℃、光照強(qiáng)度15～60 μmol·m-2·s-1、鹽度28～36等環(huán)境條件有利于真江蘺四分孢子的放散和成活[17]。另有研究表明,同真江蘺情況相似,溫度、光照強(qiáng)度和鹽度對(duì)龍須菜果孢子的釋放也具有顯著的影響(P<0.05)[15]。但孢子的形成過(guò)程也會(huì)受到各種條件的影響,例如四分孢子的形成同減數(shù)分裂這一有性繁殖中心事件相關(guān),而果孢子的形成會(huì)受到?jīng)Q定受精效率的各種因素的影響。本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)江蘺受精過(guò)程的影響以及在該過(guò)程中的一些繁殖特征進(jìn)行了系列研究。

本研究結(jié)果證明,在真江蘺的受精過(guò)程中,溫度、光照強(qiáng)度和周期這3個(gè)外界條件因素都會(huì)產(chǎn)生顯著影響。但是根據(jù)單因素方差分析結(jié)果顯示,溫度的影響極顯著,對(duì)真江蘺受精過(guò)程的影響大于光照強(qiáng)度和周期,該結(jié)果同在龍須菜中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[18]。溫度是影響大型藻類生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的重要因素之一,可能通過(guò)改變光合作用相關(guān)的酶活性,導(dǎo)致藻體不同的生理狀態(tài)[19]。本單因素影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,25 ℃、25 μmol·m-2·s-1、14L/10D是最適合真江蘺受精的條件。

以往對(duì)龍須菜的研究發(fā)現(xiàn),雌配子體的不同分枝間生殖力有差異,一級(jí)分枝最高且最尖端也可以形成大量果孢子體[18],這同龍須菜四分孢子體的生殖力非常相似,有研究發(fā)現(xiàn)80%以上的龍須菜四分孢子囊生長(zhǎng)在其一級(jí)分枝上[20]。然而針對(duì)江蘺受精特征的研究較少,故本文對(duì)于真江蘺自身受精過(guò)程進(jìn)行探究,進(jìn)而揭示了3條規(guī)律:(1)精子放散出來(lái)后活性會(huì)不斷降低,本實(shí)驗(yàn)使用的精子懸液在放置了12 h后同雌配子體雜交就再?zèng)]有果孢子體產(chǎn)生,4個(gè)實(shí)驗(yàn)組均同對(duì)照組有顯著差異,說(shuō)明精子釋放后活性大約可保持6 h;(2)精子同受精絲的識(shí)別和融合所需的時(shí)間可以很短,例如在一種絲狀紅藻麗絲藻(Aglaothamnionoosumiense)中的研究顯示,30 min內(nèi)即可完成精子同受精絲的細(xì)胞膜融合[21],在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)的0.5 h組也觀察到已有果孢子體生成。不過(guò)隨著受精時(shí)間的延長(zhǎng),果孢子體數(shù)目也極顯著地增加,說(shuō)明多數(shù)精子完成受精的過(guò)程可能需要幾個(gè)小時(shí)。(3)在實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的受精小體系中,采用增加雄配子體的長(zhǎng)度來(lái)增加產(chǎn)生精子的量,當(dāng)長(zhǎng)度達(dá)到14 cm時(shí),在設(shè)置的200 mL體系中受精產(chǎn)生的果孢子體數(shù)量已達(dá)到最高,而2 cm組產(chǎn)生的果孢子體數(shù)量遠(yuǎn)大于14 cm組的1/7,說(shuō)明精子放散數(shù)量超過(guò)了雌配子體接受的上限值,不再成為受精過(guò)程的限制因素。以上幾點(diǎn)可能共同表示真江蘺存在著快速受精的現(xiàn)象,以保證大量活性精子可參與受精作用,提高受精效率[22]。此外有研究結(jié)果還顯示,對(duì)雄配子體進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿撍碳び欣诰拥尼尫?這同經(jīng)過(guò)干燥刺激可以促進(jìn)孢子放散的結(jié)果相似[23-24]。有研究證明,果孢子的放散機(jī)制是果孢子囊內(nèi)水動(dòng)力環(huán)境的改變,產(chǎn)生黏液,黏液推動(dòng)了孢子放散[25-26],由此推測(cè),雄配子體脫水后重新浸入水中,生殖窩中精子的附屬物可能發(fā)生了水合作用,從而推動(dòng)了精子的放散。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)真江蘺受精過(guò)程內(nèi)在繁殖特性與外界環(huán)境因素影響的探究,加深了對(duì)江蘺受精的了解,以期提高受精效率。同時(shí),這也為建立全程可控的雌、雄配子體雜交受精體系提供了理論依據(jù)與技術(shù)支持,使大規(guī)模栽培產(chǎn)業(yè)所需同步成熟孢子的數(shù)量得以滿足。