不同培養條件下灰黃青霉分生孢子的核數分析

摘要：分生孢子是青霉菌的無性繁殖細胞，其核型特征對青霉菌的生長繁殖、遺傳育種等具有重要影響，用水瓊脂和察氏培養基在不同的培養天數中尋找單核分生孢子比例最高的條件。采用DAPI核染色法，熒光顯微觀察灰黃青霉Penicillium griseofulvum分生孢子在水瓊脂和察氏培養條件及不同天數的核型特征。結果表明：灰黃青霉生長發育過程分生孢子同時出現單核、雙核及多核現象，其核型具有多樣性。在不同培養基中的分生孢子各種核型的比例呈現顯著差異（P＜0.001）；而在相同培養基，不同培養時間的特定核型的分生孢子占比相對穩定，未呈現顯著差異（P＞0.05）。研究結果為更好地開展灰黃青霉的遺傳操作提供理論參考。

關鍵詞：灰黃青霉；分生孢子核型；DAPI核染色法；核數

中圖分類號：Q939.96文獻標志碼：A文章編號：0253?2301（2024）12?0070?05

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.12.011

Analysis on Conidial Nuclear Number of Penicillium griseofulvum Under Different Culture Conditions

CAI Ya-ting1，ZHANG Jun-hang1，LI Jia-qi1，SHI Bi-hong1，2*

（1.College of Life Sciences，Fujian Normal University，Fuzhou，Fujian 350117，China;2.National EngineeringResearch Center of Industrial Microbiology and Fermentation Technology，Fujian Normal University，Fuzhou，Fujian350117，China）

Abstract：Conidia are asexual reproduction cells ofPenicillium，and their karyotype characteristics have an important influence on the growth，reproduction，genetic breeding of Penicillium.The conditions for achieving the highest proportion of haploconidium were found by using water agar and Czapek-Dox medium over different cultivated days.The karyotype characteristics of conidiospores of Penicillium griseofulvum were observed under fluorescence microscopy by using DAPI staining，with the observations being conducted under water agar and Czapek-Dox medium conditions over different time periods.The results showed that during the growth and development of Penicillium griseofulvumconidia，mononuclear，binucleate，and multinucleate phenomena were concurrently observed，with diverse karyotypes.The proportions of various karyotypes among conidia in different media exhibited significant differences（P＜0.001）.However，in the same medium，the proportion of conidia with specific karyotypes at different culture times remained relatively stable，showing no significant difference（P＞0.05）.These results provided a theoretical reference for better genetic manipulation of Penicillium griseofulvum.

Key words：Penicilliumgriseofulvum；Conidial karyotype；DAPI staining；Nuclear number

青霉菌是一類具有重要用途的絲狀真菌，在工業和生物制藥領域，尤其是抗生素等次級代謝產物的生產方面發揮著重要作用。與其他絲狀真菌一樣，青霉菌的基本結構由菌絲和孢子組成，菌絲通常由孢子萌發形成芽管，再通過芽管不斷生長成絲狀或管狀的菌體，并通過延伸和分枝形成復雜的菌絲體。青霉菌主要依靠無性繁殖，分生孢子是其無性繁殖的主要細胞類型。近期研究顯示，一些青霉菌的分生孢子具有多核性，例如，俞沁如等[1]通過DAPI染色發現擴展青霉的分生孢子多為雙核或多核。分生孢子的核型特征對青霉菌的生長發育及遺傳育種具有重要意義，多核分生孢子具有較強的生存和抗逆能力，但也可能影響基因操作和遺傳育種的穩定性。然而，同源重組研究多集中于單核細胞，因為單核細胞的核型單一，便于基因操作，而多核分生孢子可能影響遺傳體系操作的結果，如同源重組后產生的異核真菌增加實驗復雜性。因此，明確特定青霉菌分生孢子的核型特征對于更好地開發和利用該物種資源具有理論和實踐雙重意義。

灰黃青霉是青霉屬常見物種，以其大帚狀枝、多分枝點和短瓶梗為特征，易于分離且是灰黃霉素的主要生產菌。灰黃青霉因其抗真菌和抗增殖活性在醫藥和農業領域備受關注[2]。早期研究普遍認為青霉菌的分生孢子為單核，例如，Fletcher[3]最初描述灰黃青霉的分生孢子細胞核為單核。而Sekiguchi等[4]通過掃描電子顯微鏡研究發現，蕁麻青霉的分生孢子在出芽時有雙核特征，其中一個核位于胚管發育部位，并在發芽過程中遷移到新的芽管中。此前關于灰黃青霉的研究主要集中在其萌發過程中核行為的變化，缺乏關于不同培養時間下核型分析的報道。

真菌細胞核染色的方法多種多樣，較早的海登漢氏蘇木精法[5]（Hayden-Hamilton hematoxylin method）是一種用于生物學和醫學領域的染色技術，主要用于細胞核的染色。康振生等[6]提出改進式海登漢氏蘇木精法。Giemsa染色法則包括：制定涂片、固定細胞、染色、洗滌、干燥和觀察[7]。但這些方法在染色程序方面相對煩瑣。目前細胞核染色常用的熒光染料有：DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）、雙苯丙咪唑Hosechst 33258和Mithraymcim，這幾個染料均能與核酸中的堿基相結合，作為染料有高特異性，染色過程中所需濃度相對較低，且染色程序便捷[8]。DAPI是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料[9]。和雙鏈DNA結合后可以產生比DAPI自身強20多倍的熒光，結合作用強，在與DNA小溝的AT豐富序列結合[10?12]后在顯微鏡紫外波段光（405 nm）的激發下可以觀察到藍色熒光的細胞核[13?14]。

灰黃青霉F-208是林琳等以Penicillumpatulum（灰黃青霉Penicillumgriseofulvum的異名）D-756為出發菌株經復合誘變育種獲得的灰黃霉素高產突變菌株[15]。本試驗旨在通過DAPI染色法分析灰黃青霉F-208分生孢子的核型及核數目，以明確其在不同條件下的核數變化，并結合已完成的基因組測序，為進一步研究灰黃青霉遺傳體系的構建和同核子篩選提供理論數據。

1材料與方法

1.1試驗材料

灰黃青霉Penicillumgriseofulvum F-208菌株由本實驗室保存于?80℃冰箱中。

1.2試驗培養基

（1）察氏培養基：蔗糖3 g、氯化鉀0.05 g、硝酸鈉0.3 g、磷酸二氫鉀0.1 g、硫酸亞鐵0.001 g、硫酸鎂0.05 g、瓊脂2 g，加蒸餾水至100 mL，pH自然。121℃、0.1 MPa，高壓滅菌20 min。（2）水瓊脂培養基：瓊脂2 g；加蒸餾水至100 mL；pH自然。121℃，0.1 MPa，高壓滅菌20 min。

1.3試驗方法

1.3.1灰黃青霉分生孢子懸液制備將從4℃冰箱中取出的灰黃青霉F-208接種到察氏斜面上，在28℃下培養9 d。用無菌水洗下孢子，轉移到離心管中并稀釋至濃度107個·mL?1。取100μL孢子懸液涂布于90 mm察氏和水瓊脂培養基上，在28℃培養。察氏培養基在5、7、9、11、15 d收集孢子；水瓊脂培養基在5、7、9、11、13、15、20、25 d收集孢子，每組3個重復，濕度保持＞70%。用0.9%生理鹽水刮取孢子并過濾，離心洗滌后重懸。

1.3.2灰黃青霉細胞核染色取20μL孢子懸液滴加在載玻片中央，加熱固定孢子懸液，4%多聚甲醛再次固定10 min，固定完成后，用0.9%的1×PBS緩沖液洗滌3次，每次3～5 min，用1%Triton-X-100的生理鹽水室溫下處理5 min，用0.9%的1×PBS緩沖液洗滌3次，每次3～5 min，加入DAPI染料于室溫暗環境下染色10 min，吸除DAPI染料，用0.9%的1×PBS緩沖液洗滌3次，每次3～5 min，加入DAPI封片液后于生物熒光顯微鏡下觀察[16]。

1.3.3生物熒光顯微鏡觀察及照相待染色完成后，采用OLYMPUS BX 53顯微鏡進行觀察DAPI染色后的孢子核型，運用cellSens Standard軟件對圖像進行采集。每個培養條件的樣本觀察N大于500個分生孢子，并進行核型分析及核數目統計（目鏡10×，物鏡100×的圖片進行計數）。

2結果與分析

2.1灰黃青霉分生孢子細胞核染色結果

灰黃青霉分生孢子經DAPI核染色后于熒光顯微鏡下進行鏡檢，細胞核與DAPI染料結合之后在紫外光的激發下顯示出藍色熒光。由于在目鏡10×，物鏡40×條件下難以辨析分生孢子是否為多核，而于熒光場為100倍物鏡下可清晰觀察到灰黃青霉分生孢子不同數目的核型。單核、雙核以及多核核型于察氏培養基和水瓊脂培養基以及不同天數都有存在，見圖1。

2.2不同培養條件下灰黃青霉分生孢子的細胞核數分析

由表1可知，察氏培養基中灰黃青霉分生孢子的核型情況，其中單核和雙核占主要部分，由于三核及以上的數目不多，統稱為多核。察氏培養基中不同培養時間采集的分生孢子單核平均占比約34.1%，雙核占比52.9%以及多核13.0%。方差分析表明，不同培養時間的特定核型分生孢子的百分比間未呈現顯著差異：單核分生孢子群體（T=0.783，DF=4，P=0.761 3）、雙核群體（T=0.384，DF=4，P=0.639 9）、多核群體（T=?0.190，DF=4，P=0.429 2）。說明培養時間對特定環境（培養基）中灰黃青霉各分生孢子核型的占比無顯著影響。

由表2可知，灰黃青霉在水瓊脂培養基中的核型情況，其中單核占比為主要部分。水瓊脂培養基中不同培養時間采集的分生孢子單核平均占比約80.0%，雙核占比16.0%以及多核4.0%。方差分析結果表明，水瓊脂培養基中不同培養時間的特定核型分生孢子的占比未顯示顯著差異：單核分生孢子群體（T=0.018，DF=7，P=0.506 9）、雙核（T=?0.662，DF=7，P=0.264 4）、多核（T=0.517，DF=7，P=0.689 3）。情況與察氏培養基的類似，即培養時間對灰黃青霉分生孢子的核型無明顯影響，說明在特定營養條件下，灰黃青霉分生孢子的各種核型比例相對穩定。但水瓊脂培養基中灰黃青霉分生孢子的單核比例顯著高于察氏培養基（P＜0.001），而雙核與多核的比例則相反，即察氏培養基中雙核與多核分生孢子的比例都顯著高于水瓊脂培養基（P＜0.001）。說明營養狀況對灰黃青霉的孢子核型有顯著影響。

3討論與結論

本試驗采用DAPI染色法對灰黃青霉的分生孢子進行核染色，發現灰黃青霉分生孢子核型在生長發育過程中具有多樣性，單核、雙核與多核并存，這與目前發現的部分青霉及其他絲狀真菌相似。劉淼等[17]對粉擬青霉、環鏈擬青霉、玫煙色擬青霉用Hoechst 33 258染液進行分生孢子核染色，用AO-120型落射熒光顯微鏡觀察到其分生孢子均出現多核。擴展青霉在PDB平板上培養一定時間，經過DAPI染色后于熒光顯微鏡觀察到分生孢子有單核和多核[18?19]。絲狀真菌中的曲霉菌也有很多被發現其分生孢子為多核[20]，如米曲霉分生孢子經察氏培養基平板上培養，采用DAPI核染色法對其進行染色，熒光顯微鏡觀察到分生孢子核呈現出不同核型[21]。本試驗首次對灰黃青霉在不同培養基、不同培養時間的分生孢子核型變化進行了較系統的研究，結果發現在特定營養條件下（培養基），培養時間對其核型變化無顯著影響（P＞0.1）；而營養條件（培養基）的改變將顯著影響其分生孢子的核型分布（P＜0.001）。該結果對未來開展灰黃青霉的相關遺傳操作如同核子篩選等具有重要的指導意義。

本研究采用DAPI核染色對灰黃青霉平板培養的孢子核數做了較系統研究，通過熒光染色觀察，發現灰黃青霉分生孢子存在單核、雙核甚至是多核的現象。而Fletcher[3]通過液體振蕩培養的方式培養灰黃青霉，利用Giemsa染色觀察灰黃青霉分生孢子萌發過程中的形態以及核行為，發現單個孢子的細胞核最初為單核，萌發過程中核體積增加，隨之分裂為雙核，分裂后一個子核留在孢子中，另一個遷移到新形成的芽管中。該研究也提到一些分生孢子在萌發前細胞核有可能已經發生分裂，但未提供詳細數據，這可能限于早期試驗條件所致。本研究采用的DAPI染色可以穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結合而發揮標記作用，可以清晰觀察到灰黃青霉單核、雙核或多核分生孢子。類似的結果在其他物種亦有發現，HU等[22]觀察冬蟲夏草菌絲只有單個細胞核，但是Bushley等[23]和胡曉棣等[24]則發現其具有雙核甚至是多核的結果。染色方法的改進，不同染色劑的使用等均可能導致結果的差異。可見技術的進步推動著科學的發展。

參考文獻：

[1]俞沁如，劉瑤瑤，李冉，等.基于蛋白質組學的癸醛抑制擴展青霉機制分析［J］.杭州師范大學學報（自然科學版），2023，22（4）：411?419.

[2]RICHARDSON S N，WALKER A K，NSIAMA T K，et al.Griseofulvin-producing Xylaria endophytes of Pinus strobus and Vaccinium angustifolium：Evidence for a conifer-understory species endophyte ecology［J］.Fungal Ecology，2014，11：107?113.

[3]FLETCHER J.Morphology and nuclear behavior of germinating conidia of Penicillium griseofulvum［J］.Trans Br Mycol Soc，1969，53（3）：425?432.

[4]SEKIGUCHI J，GAUCHER G M，COSTERTON J W.Microcycle conidiation in Penicillium urticae：an ultrastructural investigation of spherical spore growth［J］.Can J Microbiol，1975，21（12）：2048?2058.

[5]LITTLE R，MANNERS J G.Somatic recombination in yellow rust of wheat（Puccinia striiformis）：The production and possible origin of two new physiologic races［J］.Transactions of the British Mycological Society，1969，53（2）：251?258.

[6]李振岐，陸和平，馬青，等.小麥條銹菌夏孢子芽管核染色方法的改進研究［J］.西北農林科技大學學報（自然科學版），1985（1）：1?13.

[7]HONG H，HU Y，SHI S，et al.Listeria monocytogenes：possible mechanism of infection of goat uterus and its effects on uterine autophagy and cell apoptosis［J］.Frontiers in Veterinary Science，2024，11：1413523?1413523.

[8]康振生，李振歧，商鴻生.植物病原真菌細胞核的熒光染色技術［J］.植物保護，1992（2）：43.

[9]TARNOWSKI B I，SPINALE F G，NICHOLSON J H.DAPI as a Useful Stain for Nuclear Quantitation［J］.Biotechamp;Histochem，1991，66（6）：296?302.

[10]KANIA J，FANNING T G.Use of a sequence-specific DNA-bindingligand to probe the environments of EcoRI restriction endonuclease cleavage sites［J］.Eur J Biochem，1976，67（2）：367?371.

[11]KAPUSCINSKI J.Interactions of nucleic acids with fluorescent dyes;spectral properties of condensed complexes［J］.Journal of Histochemistryamp;Cytochemistry Official Journal of the Histochemistry Society，1990，38（9）：1323?1329.

[12]MANZINI G，BARCELLONA ML，AVITABILE M，et al.Interaction of diamidino-2-phenylindole（DAPI）with natural and synthetic nucleic acids［J］.Nucleic Acids Res，1983，11（24）：8861?8876.

[13]BELLLEC L，MAURER-ALCALA XX，KATZ LA.Characterization of the life cycle and heteromeric nature of the macronucleus of the ciliate Chilodonellauncinata using fluorescence microscopy［J］.The Journal of eukaryotic microbiology，2014，61（3）：313?316.

[14]MAURER-ALCALA XX，KATZ LA.Nuclear Architecture and Patterns of Molecular Evolution Are Correlated in the Ciliate Chilodonellauncinata［J］.Genome biology and evolution，2016，8（6）：1634?1642.

[15]林琳，楊梅，黃諺諺，等.灰黃霉素產生菌耐前體變株F-208的選育及其特性的研究［J］.藥物生物技術，1995，2（4）：28?32.

[16]MUNYENYEMBE K，TIMMONS C，WEINER AKM，et al.DAPI staining and DNA content estimation of nuclei in uncultivable microbial eukaryotes（Arcellinida and Ciliates）［J］.European Journal of Protistology，2021，81：125840.

[17]劉淼，武覲文.粉擬青霉異核性研究［J］.真菌學報，1992，11（3）：234?254.

[18]ZHOU T，WANG X，LUO J，et al.Identification of differentially expressed genes involved in spore germination of Penicillium expansum by comparative transcriptome and proteome approaches［J］.Molecular Medicine Reports，2018，7（3）：1?13.

[19]LAI T，YU Q，PAN J，et al.The Identification and Comparative Analysis of Non-Coding RNAs in Spores and Mycelia of Penicillium expansum［J］.Journal of Fungi，2023，9（10）：999.

[20]YUILL E.The numbers of nuclei in conidia of aspergilli［J］.Transactions of the British Mycological Society，1950，33（34）：324?331.

[21]田野.米曲霉分生孢子核型研究及萌發物成分的初步分析［D］.福州：福建師范大學，2016.

[22]HU X，ZHANG YJ，XIAO GH，et al.Genome survey uncovers the secrets of sex and lifestyle in caterpillar fungus［J］.Chinese Science Bulletin，2013，58（23）：2846?2854.

[23]BUSHLEY E K，Li Y，WANG W，et al.Isolation of the MAT1-1 mating type idiomorph and evidence for selfing in the Chinese medicinal fungus Ophiocordyceps sinensis［J］.Fungal Biology，2013，117（9）：599?610.

[24]胡曉棣，李熠，任蜀豫，等.冬蟲夏草、蛹蟲草菌絲隔膜和細胞核熒光染色［J］.菌物學報，2016，35（9）：1099?1105.

（責任編輯：陳文靜）