化濁解毒消癰方治療潰瘍性結腸炎機制的網絡藥理學研究?

婁瑩瑩 徐偉超 李佃貴 霍永利 孫潤雪 李 燕 王思月 楊 倩△

（1.河北省中醫院，河北 石家莊 050011；2.河北省中西醫結合胃腸病研究重點實驗室，河北 石家莊 050011；3.河北中醫藥大學，河北 石家莊 050200）

潰瘍性結腸炎（UC）屬于炎癥性腸病，其發病機制尚不完全明確，涉及遺傳、環境、飲食、免疫、精神等多方面因素［1］。目前西醫治療可短期緩解UC 的臨床癥狀，但存在副作用大、治療周期長、價格昂貴等缺點，限制了臨床的應用。目前，UC已經被世界衛生組織列為現代難治性疾病之一，中醫藥在UC的治療中日漸凸顯了重要作用，必將成為治療UC的重要研究方向。

國醫大師李佃貴教授通過多年的臨床實踐，傳承經典，守正創新，提出了UC 濁毒致病論［2］。在濁毒理論指導下，凝練出化濁解毒消癰方，臨床療效顯著［3］。前期實驗研究表明該方可通過調節Th1/Th2 平衡發揮抗炎效應［4］，但是對該方治療UC的機制并沒有進行系統全面的研究。本文應用網絡藥理學研究方法，整體、系統地研究該方治療UC 的有效物質成分基礎和相關分子網絡調控機制，并進行實驗驗證，可為化濁解毒消癰方治療UC的臨床與基礎實驗研究提供更加精準、清晰、立體的研究方向。

1 材料與方法

1.1 化濁解毒消癰方活性化學成分的篩選和潛在靶點的預測

以化濁解毒消癰方中單味藥：白頭翁、藿香、佩蘭、茵陳、黃連、黃柏、當歸、芍藥、茯苓、白花蛇舌草、半枝蓮、半邊蓮、秦皮、苦參、廣木香為關鍵詞，在TCMSP 數據庫中進行檢索。采用口服利用度參數（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，藥物半衰期（HL）≥5 作為條件對15味中藥進行篩選［5-6］，選出符合條件的化學成分，并且從TCMSP 數據庫中的Related Targets 預測成分相關靶點，確定化濁解毒消癰方有效活性成分和進行潛在靶點的預測。

1.2 UC疾病靶點的獲取

以“ulerative colitis”為關鍵詞，在GeneCards 數據庫進行相關檢索，獲得UC疾病發生相關基因。

1.3 化濁解毒消癰方治療UC的“藥物-成分-靶點”網絡的構建

將化濁解毒消癰方中藥物成分靶點與UC 疾病靶點進行韋恩圖（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）的繪制，尋找中和靶點，將兩者交集獲得的靶點作為化濁解毒消癰方治療UC 的潛在治療靶點，并利用Cyto?scape3.7.2軟件構建“中藥-成分-疾病-靶點”網絡關系圖，進行綜合分析，進而尋找化濁解毒消癰方中發揮重要作用的潛在物質基礎。

1.4 蛋白質交互作用（PPI）網絡的構建

在STRING 在線數據平臺上輸入“1.3”中得到的交集靶點，物種設定為“human”，置信度為0.4，剔除游離節點，將獲得的靶點網絡關系數據導入Cytoscape軟件，進行PPI 網絡構建［7］，根據PPI 中節點的平均“degree”值為最低標準進行核心靶點的篩選。

1.5 基因本體分析（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

利用Cytoscape 軟件中的ClueGO 插件對共同作用靶蛋白進行GO 生物功能注釋和KEGG 富集分析，以P＜0.01為差異具有統計學意義，分析化濁解毒消癰方治療UC的生物學過程（BP）、細胞組成（CC）、分子功能（MF）和信號通路［8］，探討其治療UC的主要治療機制。

1.6 實驗驗證

1.6.1 實驗藥物 化濁解毒消癰方：白頭翁15 g，藿香12 g，佩蘭12 g，茵陳15 g，黃連12 g，黃柏9 g，當歸12 g，白芍20 g，白花蛇舌草15 g，半枝蓮12 g，半邊蓮12 g，秦皮15g，苦參9 g，木香9 g，茯苓12 g。購于河北省中醫院中藥房（將藥物浸泡30 min 后煎煮，共煎煮2 次，合并煎液，濃縮成所需濃度，保存于4 ℃冰箱），由專人進行質量檢查，保證中藥飲片質量合格規范。美沙拉嗪腸溶片，規格0.25 g/片，葵花藥業生產，產品批號210817。

1.6.2 試劑 葡聚糖硫酸鈉（DSS，北京百諾威生物科技有限公司，產品批號S414）；ACTIN 抗體（Servicebio，GB15001）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（上海賽默飛生物科技有限公司，批號273586004）；白細胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（上海賽默飛生物科技有限公司，268362001）；B 細胞淋巴瘤2（Bcl-2）（武漢三鷹，26593-1-ap）；半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）一抗（Abcam，ab184787）等。

1.6.3 實驗動物 健康SPF 級雄性C57BL/6 小鼠48只，6～8 周齡，體質量18～22 g［斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2019-0010］。自由進食、進水，飼養溫度（23±5）℃，濕度30%～60%，光照12 h/d。每天更換墊料，適度通風，適應性喂養1 周后分組造模。本實驗經河北中醫學院倫理委員會批準，審批號：DWLL2021053。

1.6.4 造模 造模采用葡聚糖硫酸鈉（DSS），給予C57BL/6 小鼠3%DSS 溶液自由飲用7 d，期間禁水，每日更換新鮮DSS 溶液。模型制備成功的標準是1）癥狀、體征：小鼠體重明顯下降，出現腹瀉、便血癥狀。2）結腸黏膜病理光鏡下蘇木精-伊紅染色法（HE）：可見大量炎性細胞浸潤，伴有隱窩膿腫，杯狀細胞缺失，甚則可見潰瘍形成。

1.6.5 分組及處理 采用隨機數字表法將48 只C57BL/6 小鼠分成6 組，每組8 只，分別為正常對照組、模型對照組、美沙拉嗪組和中藥高、中、低劑量組。參照《中藥藥理研究方法學》，根據實驗動物和人體表面積折算系數（選取60 kg 成人體質量進行折算，成人的給藥劑量為2.35 g/kg，小鼠與人體的每千克體重折算系數為9.01）計算小鼠的給藥劑量［9］。中藥高、中、低劑量組給予化濁解毒消癰方28.68、14.34、7.17 g/kg，按照10 mL/（kg·d）給藥。西藥對照組給予美沙拉嗪混懸液0.45 g/（kg·d）灌胃，正常對照組、模型對照組給予等體積生理鹽水，每日1 次，連續灌胃7 d。小鼠末次給藥后禁食不禁水，選取眼球取血法進行采血，3 500 r/min離心15 min，取上清液于-80 ℃冰箱保存。結腸組織標本選取距肛門上方約2～10 cm 左右處剖取。實驗過程中模型對照組死亡2 只，中藥高劑量組死亡1 只，中藥中劑量組死亡1只，中藥低劑量組死亡2只。

1.7 指標檢測

1.7.1 結腸大體觀及病理組織學觀察 結腸組織標本固定24 h 后，常規制作石蠟切片，并進行HE 染色，顯微鏡下觀察各組小鼠結腸組織的情況。

1.7.2 血清IL-6、TNF-α 含量的測定 采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定各組大鼠血清IL-6、TNF-α 含量，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7.3 Western blotting 法檢測結腸組織中Caspase-3、Bcl-2 蛋白的表達 取結腸組織100 mg 置于勻漿管中，加入10 倍組織體積的裂解液進行勻漿；放置冰上裂解液30 min 確保組織完全裂解；離心收取上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度；蛋白變性；制膠與上樣，隨后進行SDS-PAGE 電泳、轉膜，將轉印完的PVDF 膜室溫下封閉30 min，進行一抗稀釋（1∶1 000），4 ℃孵育搖床過夜；回收一抗，快速洗膜3次；進行二抗稀釋（1∶3 000），室溫下孵育30 min。回收二抗，快速洗膜3 次，在暗室中進行PVDF 膜壓片，隨后進行顯影和定影，最后用Alpha 軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 化濁解毒消癰方中的活性成分和潛在靶點

通過TCMSP 數據庫篩選，化濁解毒消癰方中的活性成分共得到165 個，其中白頭翁11 個、藿香9 個、佩蘭4 個、茵陳13 個、黃連10 個、黃柏26 個、當歸2 個、白芍9個、白花蛇舌草6個、半枝蓮15個、半邊蓮15個、秦皮1 個、苦參36 個、木香5 個、茯苓3 個，共預測得到215 個活性成分相關潛在靶點。通過GeneCards 數據庫獲得UC疾病的潛在靶點共4 356個。

2.2 化濁解毒消癰方治療UC的“藥物-成分-靶點”網絡的構建

將藥物215 個成分靶點與4 356 個疾病靶點進行韋恩圖繪制（圖1），獲得共有靶點142 個。運用Cyto?scape3.7.2軟件構建化濁解毒消癰方治療UC的“藥物-成分-靶點”網絡圖（圖2），顯示：化濁解毒消癰方的81個主要化學成分通過前列腺素過氧化物合酶2（PTGS2）、前列腺素過氧化物合酶1（PTGS1）、IL-6、白細胞介素-1β（IL-1β）、半胱氨酸蛋白酶9（CASP9）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、B細胞淋巴瘤2（BCL2）、細胞促凋亡蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）等142 個靶點發揮治療UC 的作用，其中槲皮素（querce?tin）、木犀草素（luteolin）、山萘酚（kaempferol）、異黃酮（irisolidone）、刺芒柄花素（formononetin）、金魚草素（aureusidin）、刺槐素（acacetin）、茵陳色原酮（capillari?sin）、去甲氧基茵陳色原酮（demethoxycapillarisin）的度值均大于10，推斷它們是化濁解毒消癰方治療UC 的主要活性成分。

圖1 各組小鼠化濁解毒消癰方成分靶點與UC疾病靶點韋恩圖

圖2 化濁解毒消癰方治療UC的“藥物-成分-靶點”網絡圖

2.3 PPI蛋白相互作用網絡

PPI 蛋白相互作用網絡圖顯示（圖3）：142 個靶蛋白和2 601 條互作邊，蛋白相互作用關系中，PTGS2、IL-6、PPARG、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（Akt1）、IL-1β、原癌基因JUN、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、絲裂原活化蛋白激8（MAPK8）、原癌基因RELA、缺氧誘導因子1 亞基α（HIF1A）、HSP90AA1、原癌基因FOS、CASP3、B 細胞淋巴瘤2 樣蛋白（BCL2L1）、雄激素受體（AR）、血管內皮生長因A（VEGFA）、表皮生長因子（EGF）、雌激素受體1（ESR1）、信號傳導及轉錄激活蛋白1（STAT1）、轉錄因子MYC 這20 個靶點高于平均“degree”值，因此推測它們是化濁解毒消癰方治療UC的核心作用靶點。

圖3 PPI蛋白互作網絡圖

2.4 基因功能及通路分析

利用Cytoscape 軟件中的ClueGO 插件對142 個共同作用靶蛋白進行GO 生物功能注釋和KEGG 富集分析，根據保留P≤0.01 的結果，對排名前20 的條目進行可視化分析，得到柱狀圖。BP 分析（圖4A）可以看出，這些靶點主要涉及細胞對生物刺激的反應、細胞對脂多糖的反應、細胞對凋亡信號通路的調節、細胞對氧化應激的反應等生物過程。CC（圖4B）主要涉及膜微結構域、膜區、囊泡腔、核染色質、蛋白激酶復合物、轉錄因子復合體、基底質膜等細胞組分。MF 分析（圖4C）可以看出，主要涉及細胞因子活性、核受體活性、蛋白激酶調節劑活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、DNA 結合轉錄激活因子活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、死亡域等分子功能。KEGG 通路分析結果（圖5）顯示，化濁解毒消癰方治療UC 主要與IL-17、PI3K-Akt、TNF等炎癥信號通路、細胞凋亡、免疫調節、病毒感染、抗腫瘤等途徑相關。

圖4 化濁解毒消癰方治療UC的GO功能富集分析

圖5 化濁解毒消癰方治療UC的KEGG富集分析

2.5 化濁解毒消癰方對UC模型小鼠的影響

2.5.1 化濁解毒消癰方對UC 小鼠病理形態學的影響 見圖6。正常對照組小鼠結腸黏膜光滑，腺體結構完整，排列規則，無充血、水腫、糜爛或潰瘍。模型組小鼠結腸黏膜充血、水腫明顯，可見多發糜爛、潰瘍灶形成，鏡下腺體排列不規則、紊亂，杯狀細胞減少，周圍大量炎性細胞浸潤。中藥組、美沙拉嗪組結腸黏膜充血、水腫減輕，潰瘍較少，并可見已愈合的潰瘍面，腺體結構基本完整，炎性細胞也明顯減少。

圖6 各組小鼠結腸組織病理改變（HE染色，200倍）

2.5.2 各組小鼠血清IL-6、TNF-α 的比較 見表1。與正常對照組相比，模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05），與模型對照組相比，各藥物干預組小鼠血清IL-6、TNF-α 水平下降（P＜0.05），化濁解毒方高劑量組與美沙拉嗪組比較無顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

注：與正常組比較，?P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與美沙拉嗪組比較，△P ＜0.05。下同。

TNF-α 0.94±0.10 6.97±0.24*1.88±0.24*#3.13±0.75*#4.48±0.56*#△1.94±0.37*#△組 別正常對照組模型對照組美沙拉嗪組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組n8 6 8 7 7 6 IL-6 2.21±0.55#9.45±1.02*3.75±0.90*#3.84±0.70*#5.19±0.42*#△6.76±0.65*#△

2.5.3 各組小鼠結腸組織Caspase-3、Bcl-2 蛋白表達比較 見表2、圖7。與正常對照組相比，模型組小鼠腸黏膜組織中Caspase-3、Bcl-2 蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，化濁解毒消癰方各劑量組、美沙拉嗪組小鼠腸黏膜組織中Bcl-2、Caspase-3 蛋白水平均明顯降低（P＜0.05）；隨著化濁解毒消癰方給藥濃度的增加，化濁解毒消癰方各劑量組小鼠腸黏膜組織中Bcl-2、Caspase-3 蛋白水平逐漸降低（P＜0.05）；化濁解毒消癰方高劑量組與美沙拉嗪組小鼠腸黏膜組織中Bcl-2、Caspase-3蛋白水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠結腸組織Caspase-3、Bcl-2蛋白表達比較（±s）

表2 各組小鼠結腸組織Caspase-3、Bcl-2蛋白表達比較（±s）

組 別正常對照組模型對照組美沙拉嗪組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組n8 6 8 7 7 6 Caspase-3/β-actin 0.123 9±0.015 3#0.786 6±0.016 4*0.183 0±0.008 5*#0.191 6±0.009 1*#0.306 0±0.012 6*#△0.491 1±0.010 2*#△Bcl-2/β-actin 0.2 518±0.015 7 0.552 4±0.004 7*0.329 4±0.022 0*#0.320 1±0.012 5*#0.392 1±0.005 8*#△0.486 5±0.013 0*#△

圖7 化濁解毒消癰方對小鼠結腸組織Caspase-3、Bcl-2蛋白表達的影響

3 討 論

化濁解毒消癰方是國醫大師李佃貴教授在濁毒理論的指導下創立而成，臨床驗證療效顯著。網絡藥理學是目前藥理學研究領域的成熟方法，它融合了系統生物學、多向藥理學、計算生物學等多學科的技術，通過各大網絡數據庫，構建藥物-成分-靶點-疾病復雜網絡關系圖，預測治療疾病的關鍵靶點和信號通路，從整體、系統角度揭示復方組分在疾病防治方面發揮作用的分子機制，是研究中藥復方行之有效的研究策略，與中醫整體觀、辨證論治的本質科學內涵相同［10］。

本研究通過檢索TCMSP 數據庫的篩選，獲得化濁解毒消癰方化學成分165 個，成分相關疾病靶點215個，通過GeneCards 數據庫的篩選發現疾病靶點4 356個，并進行韋恩圖的繪制，獲得共同靶點142 個，活性成分81 個，同時發現藥物化學成分與靶點的對應不是單一的，而是存在“一對多”“多對一”形式，這與中藥復方的作用特點完全符合。運用Cytoscape 構建化濁解毒消癰方治療UC 的“藥物-成分-靶點”網絡，發現槲皮素、木犀草素、山萘酚、刺芒柄花素、刺槐素、茵陳色原酮等活性成分可能是化濁解毒消癰方治療UC 的關鍵化學成分。研究表明，槲皮素可以通過影響腸道菌群、抑制炎癥反應，保護腸黏膜［11］。木犀草素可以通過影響氧化應激過程，花生四烯酸的代謝和多種炎性信號通路，抑制炎性細胞因子和炎癥介質的表達，從而進一步發揮抗炎作用［12］。山萘酚（kaempferol）是一種黃酮類化合物，可以調節炎癥相關基因的表達，抑制轉錄因子、黏附分子以及基質金屬蛋白酶等［13］。刺芒柄花素可以降低UC 小鼠TNF-α、IL-6 和環氧合酶（COX-2）的含量，通過誘導Nrf2表達緩解DSS誘導的小鼠UC［14］。刺槐素是藿香的主要成分之一［13］，具有抗腫瘤的作用，可以抑制腫瘤細胞生長與侵襲，誘導腫瘤細胞凋亡及調節免疫反應等［15］。茵陳色原酮可以通過影響癌基因及細胞上皮-間質轉化標志蛋白的表達抑制結腸癌細胞增殖與轉移［16］。

PPI 蛋白互作網絡描述靶蛋白與靶蛋白之間的相互作用力的強度，靶蛋白的度值高低與其在網絡中發揮的作用大小成正比［17］。本研究結果表明以前列腺素PTGS2、IL-6、絲氨酸/Akt1、IL-1β、TNF-α、Caspase-3、BCL2L1等為代表的度值偏高的靶蛋白在UC的發病中扮演重要角色。上述核心靶點與抗炎相關信號通路、細胞凋亡聯系密切，其中PTSG2 又稱COX2，是催化合成前列腺素的限速酶，可誘導IL-1和TNF-α的釋放，參與了UC的發展［18］。前期我們研究發現［19］，化濁解毒中藥能夠下調COX-2表達，抑制PGE2分泌，抑制UC 大鼠結腸組織的炎癥損傷，促進結腸黏膜修復。IL-6是多功能炎性細胞因子，由Th1細胞分泌，是炎性介質網絡的關鍵成分，在炎癥反應中起重要作用。IL-6的過度表達會影響腸上皮細胞的通透性，引起炎性細胞浸潤，從而發生腸道慢性炎癥［20］。TNF-α 與炎癥反應關系密切，TNF-α 在UC 患者的腸道微環境明顯增高，可以作為UC 病情進展的評價指標［21-22］。另外研究發現UC 發生時，腸上皮細胞過度凋亡或提前死亡，將破壞隱窩結構，損傷腸黏膜，可見細胞的不正常的程序性死亡參與UC的發生發展［23］。Caspase-3、Bcl-2是凋亡相關蛋白［21］。Bcl-2 的主要生物學功能是通過抑制細胞凋亡來延長細胞存活時間。Caspase-3 是Cas?pase 級聯激活下游的主要因子，在細胞凋亡中發揮重要的作用［24］。

KEEG 分析結果表明，化濁解毒消癰方治療UC 主要與炎癥通路、免疫調節、細胞凋亡、抗病毒感染、抗癌等相關通路密切相關，其中TNF 信號通路、PI3K-Akt參與炎癥、免疫反應。黃芩苷通過PI3K/Akt 信號通路抑制UC 大鼠腸道免疫反應，減少腸上皮細胞凋亡［25］；另外，通過PI3K/Akt 信號通路活化IKK，激活NF-κB，擴大炎癥反應，增加黏膜損傷，參與了UC 相關結腸癌變的過程［26］。巨細胞病毒感染與UC 患者病情嚴重程度相關，可使UC 的病情復雜化，產生激素抵抗甚至使病情惡化，是UC 預后不良的獨立危險因素［27-28］。UC病程較長，反復發作，可通過“炎癥-異型增生-癌變”途徑轉化成結腸癌，TNF-α 可激活ERK/MAPK、PI3K/Akt等通路，促使UC向結腸癌進展［26］。

為進一步驗證本研究預測的有效成分、核心靶點及通路的可行性，研究者采用DSS 法構建UC 小鼠模型，給予化濁解毒消癰方中藥干預，研究結果顯示，模型組中小鼠血清IL-6、TNF-α升高，結腸組織中Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達升高，經過藥物干預后，小鼠血清IL-6、TNF-α 以及結腸組織Bcl-2、Caspase-3蛋白均表達下降，提示化濁解毒消癰方可能通過下調血清細胞因子IL-6、TNF-α 水平，抑制炎癥反應；抑制腸上皮細胞的凋亡，減輕腸道黏膜損傷。這與網絡藥理學預測的藥物作用靶點主要集中在炎癥通路、免疫調節、細胞凋亡等方面具有一致性，間接驗證了其可行性。

綜上所述，本研究發現化濁解毒消癰方組方涉及多種細胞生物行為及分子功能，網絡多種信號通路，通過調節炎癥、免疫反應、細胞死亡、抗病毒感染、抗癌等相關途徑發揮作用，與中醫系統性、整體性的特點十分契合，符合UC 疾病的特點，為全面深入闡述化濁解毒消癰方治療UC 的作用機制開拓了新的思路，為課題組后續的藥理學研究打下一定基礎，指明了下一步的方向。