不同萃取方法下綠萼梅花蕾揮發(fā)性成分的差異研究

王衍彬，陳雅丹，秦玉川，吳曉紅，黃旭波，程俊文，王麗玲，方茹，賀亮

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江東方梅園有限公司，浙江 湖州 313199 )

綠萼梅Prunusmumef.viridicalyx為薔薇科Rosaceae 李屬Prunus落葉小喬木，因其萼綠花白而得名。綠萼梅天然分布于我國浙江、江蘇、安徽、湖北等地[1]，是一種應(yīng)用廣泛的園林觀賞和藥用植物。綠萼梅的花香氣濃郁，既可作為芳香原料，亦是一種傳統(tǒng)中藥，被收錄在《本草綱目》《本草拾遺》等古代經(jīng)典藥籍中，具有疏肝和中、理氣化痰之功效，常被用于治療頭暈、肝胃氣痛以及食欲不振等病癥[2]；亦被收錄在《中國藥典》中，近年來研究發(fā)現(xiàn)，其花蕾中含有豐富的揮發(fā)油類、黃酮類、苷類、苯丙素類等活性成分[3-7]，其中以綠原酸為代表的苯丙素類和以蘆丁和金絲桃苷為代表的黃酮類成分含量最高[4-5]，并發(fā)現(xiàn)其具有防止黑色素沉積、抗抑郁、清除體內(nèi)自由基、抑制醛糖還原酶和抗血小板凝集等[2,5,8-10]功能，具有較好的應(yīng)用潛力。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者針對綠萼梅的研究，主要集中在中藥質(zhì)量控制和藥用成分分析方面，對其揮發(fā)性成分的研究尚未見報道，文獻僅有少量有關(guān)蠟梅Chimonanthuspraecox、杏梅P.mumevar.bungo、山桃P.davidiana等相近植物花揮發(fā)性成分的研究[11-16]，但其揮發(fā)性成分的組成均與綠萼梅揮發(fā)性成分相去甚遠。綠萼梅花質(zhì)輕、氣香、味淡、微澀，是一種優(yōu)質(zhì)的芳香原料，具有極大的芳香產(chǎn)品開發(fā)潛力。目前，植物揮發(fā)性成分提取方法研究眾多，水蒸氣蒸餾法（Steam distillation，SD）、同時蒸餾萃取法（Simultaneous distillation extraction，SDE）、減壓蒸餾法（Vacuum distillation extraction，VDE）、頂空吸附法（Headspace adsorption，HAS）、頂空-固相微萃取法（Headspace-Solid Phase Microextraction，HS-SPME）、超聲波萃取法（Ultrasonic extraction，UE）、超臨界CO2萃取法（Supercritical CO2extraction，SFE）等方法均有應(yīng)用，但各有優(yōu)缺點。不同萃取方法對獲得的揮發(fā)性成分物質(zhì)種類和相對含量有差異[17-18]，綠萼梅中的揮發(fā)性成分較為復(fù)雜，各種提取方法的原理不同，所得到的揮發(fā)性物質(zhì)是否一致，差異是否顯著，目前尚無報道。

本研究采用SD、HS-SPME 和SFE 三種常用萃取方法提取綠萼梅揮發(fā)性成分，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其提取物的組分進行對比分析，旨在全面了解綠萼梅的揮發(fā)性成分組成，探討研究能較完整保留綠萼梅揮發(fā)性成分的提取方法，為綠萼梅的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

綠萼梅花蕾，2023 年3 月13 日采自浙江省長興縣東方梅園有限公司梅花基地，每50 g 新鮮樣品放置于1個PE 袋中，每袋放干燥劑10 g，運回實驗室后立即進行處理；二氯甲烷，色譜純，美國Tedia 公司；無水硫酸鈉，分析純，成都科隆公司；二氧化碳，純度99.9%，杭州悅通氣體有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

固相微萃取裝置，100 μmDVB/CAR/PDMS 萃取頭，Supelco 公司；Spe-2 超臨界CO2萃取儀，美國AppliedSeparations(ASI)公司；低溫恒溫槽，南京新晨生物科技有限公司；7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；AL204-1C 型電子分析天平，感量：0.001 g，瑞士Mettler Toledo 公司；TC-15 套式恒溫器，海寧市新華醫(yī)療器械廠；DW-2030 低溫冷卻液循環(huán)泵，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 頂空-固相微萃取法（HS-SPME） 稱取15.000 g 綠萼梅花蕾加到50 mL 萃取瓶中，將萃取瓶放入金屬浴加熱槽中，設(shè)置加熱溫度為80 ℃，吸附時間為60 min。萃取完成后，將萃取頭插入氣相色譜進樣口，進行GC-MS 分析。

1.3.2 水蒸氣蒸餾法（SD） 稱取15.000 g 綠萼梅花蕾放入500 mL 圓底燒瓶中，加入蒸餾水至燒瓶2/3 處，放入套式恒溫器加熱3 h，設(shè)置加熱溫度為102 ℃，冷凝回收揮發(fā)油。吸取收集到的揮發(fā)油50 μL，溶于2 mL正己烷中，加入0.200 g 無水硫酸鈉脫水，過0.45 μm 有機濾膜，進行GC-MS 分析。

1.3.3 超臨界CO2萃取法（SPE） 稱取15.000 g 綠萼梅花蕾加入到50 mL 超臨界二氧化碳萃取釜中，設(shè)置萃取溫度為40 ℃，萃取壓力為30 MPa，萃取時間為2 h，收集萃取產(chǎn)物，稱取50 mg 樣品，溶于2 mL 二氯甲烷中，加入0.200 g 無水硫酸鈉脫水，過0.45 μm 有機濾膜，進行GC-MS 分析。

1.3.4 GC-MS 分析條件 色譜柱Agilent J&W DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持1 min，以8 ℃·min-1升至160 ℃，保持1 min，再以5 ℃·min-1升至300 ℃，保持20 min；載氣為高純氦氣，流速：1.0 mL·min-1，不分流進樣；液體樣品進樣量1.0 μL，固相微萃取解析時間2 min。電子轟擊（EI）離子源，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，激活電壓1.5 V；質(zhì)量掃描范圍m/z 35 ～ 600。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理、平均值和標準差計算等采用WPS 2019，主成分分析和繪圖采用Origin Pro2023。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠萼梅揮發(fā)性成分比較分析

用SD、HS-SPME 和SFE 三種方法萃取綠萼梅花蕾中的揮發(fā)性成分，得到總離子流圖如圖1。經(jīng)NIST 譜庫對比、鑒定（相似的≥85%）所獲得化學(xué)成分，并對其采用面積歸一化法計算各成分的相對含量，結(jié)果見表1。綜合比較分析表1 和圖2，三種方法共鑒定出57 種化合物，包括醛類6 種、醇類5 種、酚類2 種、酮類4 種、酸類2 種、酯類15 種、烷烴類13 種、烯烴6 種和其它類4 種。

表1 不同萃取方法綠萼梅揮發(fā)性成分Tab. 1 Volatile componentfrom P. mume f. viridicalyxby different extraction method

圖1 綠萼梅揮發(fā)成分的氣質(zhì)總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram of GC-MS of volatile component from P. mume f. viridicalyx

圖2 綠萼梅主要揮發(fā)物組成與相對含量Fig. 2 The composition and relative content of main volatiles from P. mume f .viridicalyx

苯甲醛具有明顯的苦杏仁味和堅果香，在堅果、茶葉、酒、肉制品等[19-20]食品中均有檢出，在薔薇科植物的莖、皮、花、種子中存在，也常被用作食用和日化香精。在表1 中所有鑒定出的成分中，苯甲醛含量最高，是綠萼梅風(fēng)味的主要貢獻者，在三種方法所獲得化合物中分別占79.41%（HS-SPME）、66.99%（SD）和19.59%（SFE）。

三種不同方法提取的綠萼梅花揮發(fā)性組分在成分和含量上都存在一定差異。從圖3 可以看出，SD 和SFE兩種方法獲得的揮發(fā)物所鑒定出的化合物種類較多，分別為30 種和29 種，而HS-SPME 獲得的化合物種類較少，為21 種。在化合物種類方面，用HS-SPME 方法取獲得的醛、醇類化合物種類最多，均為5 種，用SD 法獲得的酮、酯和烯烴類化合物最多，分別為4 種、9 種和4 種，而用SFE 方法獲得的烷烴類物質(zhì)種類最多，達10 種。從萃取物的相對含量來看，用HS-SPME 方法獲得的醛類物質(zhì)相對含量最高，達86.18%；其次為SD 法，相對含量為66.99%；用SFE 法獲得的烷烴相對含量最高，達31.46%。烷烴類是植物蠟質(zhì)的主要組成，超臨界二氧化碳對低極性的烷烴類成分萃取效果更佳，而對極性大、沸點較低的醛類化合物萃取效果較差。

圖3 綠萼梅花揮發(fā)物熱圖Fig. 3 Heat map of volatile components from P. mume f. viridicalyx

從圖3 的聚類熱圖結(jié)果可以明顯看出，由于三種提取方法原理不同，所提取化合物的成分組成與含量亦存在著較大的差異。HS-SPME 獲得提取物中含量超過1%的化合物共8 種，分別為苯甲醛、壬醛、苯甲酸乙酯、金合歡醇、α-香樹脂醇、葉綠醇、苯甲酸甲酯和植酮，其平均相對含量分別為79.41%、6.38%、2.51%、2.44%、1.97%、1.82%、1.19%和1.10%，占總提取物的96.82%；SD 法獲得提取物中含量超過1%的化合物共7 種，分別為苯甲醛、α-香樹脂醇、D-檸檬烯、苯甲酸甲酯、植酮、苯甲酸芐酯和二十一烷，其平均相對含量分別為66.99%、13.66%、7.35%、3.48%、1.54%、1.36%和1.34%，占總提取物的95.72%；SFE 法獲得提取物中含量超過1%的化合物共13 種，分別為苯甲醛、二十一烷、金合歡醇、苯甲酸、丁香酚、苯甲酯芐酯、五十烷、十七烷、植酮、硬脂烷醛、二十烷、鄰苯二甲酸二丁酯和9-二十三烯，其平均相對含量分別為19.59%、15.76%、11.34%、10.82%、7.88%、6.53%、6.37%、5.04%、3.62%、3.02%、1.45%、1.22%和1.13%，占總提取物的93.77%。

2.2 主成分分析

為了進一步了解3 種萃取工藝的差異，將氣相色譜質(zhì)譜鑒定出的57 種成分，利用Origin 進行主成分分析。從圖4 和圖5 可以得出，特征值大于1 的主成分共兩個，其貢獻率PC1 為93.6%，PC2 為5.9%，兩個主成分累計貢獻率達99.5%，可以很好地代表綠萼梅揮發(fā)性成分的信息。圖2 中HS-SPME、SD 和SFE 樣品主成分得分圖中，不同提取方法樣品的間距較大，可以明顯區(qū)分，說明3 種提取方法由于原理的不同，所獲得成分差異較大，這與2.1 結(jié)果相吻合。

圖4 碎石圖Fig. 4 Scree plot

圖5 得分圖Fig. 5 Score plot

圖6 為主成分分析載荷圖，從圖中可以看出，對主成分1 貢獻較大的成分為苯甲醛、α-香樹脂醇、金合歡醇、苯甲酸和正二十一烷，其載荷分數(shù)（loading score）分別為0.905 3、0.103 6、-0.157 6、-0.174 5 和-0.245 2，前2 種成分對主成分1 的貢獻是正相的，后3 種成分的貢獻是負向的；對主成分2 貢獻最大的成分是苯甲醛、壬醛、金合歡醇、苯甲酸乙酯、苯甲酸、α-香樹脂醇、苯甲酸甲酯、D-檸檬烯，其載荷分數(shù)分別為0.190 4、0.325 5、0.236 2、0.127 9、0.101 8、-0.718 8、-0.150 1 和-0.442 4。前5 種成分對主成分2的貢獻是正向的，后3 種成分的貢獻是負向的。綜合兩個主成分分析結(jié)果，苯甲醛、壬醛、金合歡醇、苯甲酸、α-香樹脂醇、D-檸檬烯應(yīng)該是綠萼梅的主要揮發(fā)性成分，與表1 的不同提取方法樣品中不同化合物的相對含量結(jié)果基本吻合。

圖6 載荷圖Fig. 6 Loadingplot

3 結(jié)論與討論

3.1 頂空-固相微萃取和水蒸氣蒸餾法結(jié)合更適合綠萼梅花揮發(fā)性成分的提取

綠萼梅是我國重要的藥用、園林和芳香植物，具有悠久的觀賞和藥食應(yīng)用歷史[2]。本研究通過對比分析HS-SPME、SD、SFE 三種提取方法獲取的綠萼梅花主要揮發(fā)性成分，共鑒定出醛、醇、酮、烯、烷等9 類57種化合物。根據(jù)主成分分析結(jié)果，苯甲醛、壬醛、金合歡醇、苯甲酸、α-香樹脂醇、D-檸檬烯是綠萼梅花的主要揮發(fā)性成分；其中含量最高的是苯甲醛，占HS-SPME 提取物的79.41%、SD 提取物的66.99%、SFE 提取物的19.59%。HS-SPME、SD、SFE 三種工藝提取原理不同，所獲得化合物的種類與含量亦存在較大差異，HS-SPME是采用吸附原理，吸附劑對其吸附化合物的種類影響較大，本研究采用的是適用于揮發(fā)性和半揮發(fā)性香味物質(zhì)的DVB/CAR/PDMS 萃取頭，共獲得了21 種化合物，主要是分子量較小的醛類、醇類和酯類化合物；SD 工藝是利用高溫將揮發(fā)油和水同時蒸餾、冷凝，再利用油水自然分離而獲得揮發(fā)油的方法，共鑒定出30 種化合物，以酯類、烯烴、酮類等水難溶化合物為主；SFE 工藝是利用二氧化碳在超臨界流體狀態(tài)的強溶解能力來萃取揮發(fā)油的方法，共鑒定出29 種化合物，以與低極性二氧化碳互溶性好的長鏈烷烴（蠟質(zhì)）、酯類為主。綜合三種方法，SFE 提取物中蠟質(zhì)含量較高，HS-SPME 和SD 法結(jié)合更適合作為植物芳香揮發(fā)物的檢測手段。

3.2 綠萼梅花中的特征性揮發(fā)成分

通過主成分分析，苯甲醛、壬醛、金合歡醇、苯甲酸、α-香樹脂醇、D-檸檬烯是綠萼梅花的主要揮發(fā)性成分。苯甲醛、壬醛分屬于醛類，其中苯甲醛是綠萼梅花中最重要的香氣成分，它賦予綠萼梅花特殊的杏仁香和焦甜香，是三種萃取方法獲得的揮發(fā)性成分中含量最高的物質(zhì)，它在薔薇科植物如櫻桃Prunuspseudocerasus、巖薔薇Cistuscreticus等中普遍存在[21]。壬醛呈現(xiàn)柑橘香、花香、焦糖香，該成分僅在HS-SPME 中獲得，在其他物種如杜仲Eucommiaulmoides[22]、芫荽Coriandrumsativum[23]中亦是呈味的主要基礎(chǔ)物質(zhì)之一。苯甲酸是最簡單的芳香酸，在SFE 萃取物中獲得量最高，HS-SPME 萃取物中未檢出，由于苯甲酸可以作為前體物質(zhì)生成各種酯類，如苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯，因此該成分目前還未在其他植物的揮發(fā)性成分中檢測到，可作為綠萼梅的香氣的特征性成分。金合歡醇和α-香樹脂醇屬于醇類，也是三萜類化合物，是植物中重要的香氣物質(zhì)之一，前者在HS-SPME 和SFE 萃取物中檢出，后者在HS-SPME 和SD 萃取物中檢出，這也說明HS-SPME 方法利于醇類揮發(fā)性成分的吸附。金合歡醇呈現(xiàn)鈴蘭花香氣，并有青香和木香香韻，目前在草豆蔻Alpiniahainanensis揮發(fā)油[24]和草豆蔻芳香水[25]中均有檢出。α-香樹脂醇以游離或成酯形式廣泛存在于植物界，也被稱為α-香樹精，是長白山野菊花Chrysanthemumindicum揮發(fā)油中特有的成分之一，在梅葉冬青Ilexasprella[26]、番茄Solanum lycopersicum[27]、油橄欖Canariumoleosum[28]和甜羅勒Ocimumbasilicum[29]等植物中都有發(fā)現(xiàn)，在長白山野菊花揮發(fā)油中含量為9.02%[30]，高于本研究采用HS-SPME 法獲得的得率（1.97±0.33%），而低于SD 法的得率（13.66±1.88%）。D-檸檬烯，大量存在于蕓香科柑橘屬植物中，是陳皮揮發(fā)油的質(zhì)量標志物之一[31]，本研究采用的3種萃取方法中均有檢出，其中以SD 法相對檢出率最高。根據(jù)載荷分數(shù)和主成分分析法確定苯甲醛、壬醛、金合歡醇、苯甲酸、α-香樹脂醇、D-檸檬烯6 種成分為綠萼梅特有成分，研究結(jié)果可為后續(xù)綠萼梅揮發(fā)油及香氣成分質(zhì)量評價奠定實驗基礎(chǔ)。