溫和灸足三里穴對自然衰老大鼠腎組織p16 DNA 甲基化的影響

劉文博,趙舒羽,殷之光,楊秋紅,崔云華,,黃艷,,焦丹麗,吳煥淦,,趙琛

(1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院,上海 200437;2.上海市針灸經絡研究所,上海 200030;3.上海中醫藥大學,上海 201203)

衰老是人類生活中一個自然而漸進的過程,衰老緊張過程具有傷害性物質累積、生理功能完整性喪失,死亡易感性增加的特點[1]。目前針對衰老的研究集中在長壽蛋白修飾、表突變、甲基化、代謝副產物等[2-4]。衰老是年齡增長的動態變化過程,隨著老齡化過程的推進,多種慢性疾病伴隨發生,對老年人的身心健康、認知能力等都構成了威脅,嚴重影響老年人生活質量,因此,對于延緩老齡化,改善衰老進程的研究亟需關注[5-6]。隨著人口老齡化的增長,增齡性疾病的發病率逐漸增加,腎臟是受衰老影響最明顯的器官之一, 隨著年齡增長,腎臟代償和細胞修復的能力下降,與其他年齡相關的危險因素結合,使得老年性腎病風險增大,故腎臟已漸漸成為了目前研究衰老的主要器官之一,但目前尚無明確針對腎組織衰老及相關疾病的治療方法。課題組前期研究[7-9]發現,衰老大鼠存在腎組織炎癥性改變,溫和灸干預可降低衰老大鼠血清BUN 水平,改善衰老大鼠的腎小球結構,減輕腎組織炎癥;同時溫和灸足三里穴可抑制腎組織FN 表達、TGF-β1 基因轉錄,延緩腎臟衰老。DNA 甲基化是近年來研究最多、最為廣泛的表觀遺傳現象之一,在人體生長發育和衰老過程中都起著極為重要的作用,其動態變化被認為是衰老主要標志之一[10-11]。DNA 甲基化不僅與多種衰老相關性疾病有密切聯系,而且可以預測生物預期壽命和死亡風險[12]。目前針對DNA 甲基化參與腎臟衰老發生發展的機制尚不清楚。p16 作為抑癌基因,是細胞衰老的關鍵性效應物,在衰老發生發展中起著非常重要的作用。研究[13-15]發現,艾灸可以通過調控p16 的表達延緩衰老,但其調控p16 延緩衰老的具體機制的研究鮮有報道。基于此,本研究選取自然衰老大鼠模型,衰老典型器官(腎組織)進行靶向研究,以經典的大鼠衰老相關β-半乳糖苷酶作為腎臟衰老的生物學指標,通過觀察溫和灸足三里穴對自然衰老大鼠腎組織衰老生物學指標的影響,并進一步觀察大鼠腎組織衰老相關甲基轉移酶及甲基化程度,研究溫和灸足三里穴對腎組織衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用3 月齡,雄性清潔級Sprague-Dawley (SD)大鼠30 只,體質量(350±20)g(上海中醫藥大學動物實驗中心提供,合格證號2008001646891);飼養條件為溫度(22～27)℃,相對濕度為50%～70%,晝夜節律12 h/12 h。所有大鼠自由飲水進食,進行適應性飼養,1 周后如無不良反應,飲食飲水正常,則可納入正式試驗。所有實驗開展前均獲得上海中醫藥大學動物倫理委員會批準(批準號PZSHUTCM18120705)。

1.2 主要儀器與試劑

特制細艾條(南陽漢醫艾絨有限責任公司);戊巴比妥鈉(Sigma 公司,美國,貨號P3761);無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司,貨號10009218);多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司,貨號80096618);二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司,貨號10023418);中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司,貨號10004160);十二水合磷酸氫二鈉(國藥集團化學試劑有限公司,貨號200040618);磷酸二氫鈉(國藥集團化學試劑有限公司,貨號200407008);氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司,貨號10019308);鹽酸(國藥集團化學試劑有限公司,貨號80070560);β-半乳糖苷酶一抗(Santa Cruz 公司);TBA 試劑盒(南京建成生物研究所);SYBR Green PCR 試劑盒(Thermo 公司);DNA 提取試劑盒(Tiangen Biotech 公司提供);酶聯免疫吸附法試劑盒(上海源葉生物有限公司);干式恒溫器(杭州藍焰科技有限公司);冷藏冰箱(伊萊克斯電器有限公司);Real-Time 檢測儀(ABI 公司);離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司);移液槍(吉爾森P 型移液器公司);旋渦振蕩器(青浦瀘西儀器廠);電動勻漿機(FLUKO 公司);冷凍離心機[BBI 公司(Canada)];電子數顯溫度計(上海醫用儀器廠);p16 抗體(abcam 公司,貨號ab54210);Dnmt3a 抗體(abcam 公司,貨號ab188470);Dnmt3b 抗體(abcam 公司,貨號ab2851);二抗試劑盒(武漢博士德公司)。

1.3 分組與干預方法

雄性SD 大鼠分為24 月齡組和艾灸組,每組10 只。24 月齡組飼養至24 月齡,不進行治療。艾灸組從大鼠12 月齡開始溫和灸足三里穴(穴位定位方法參照《實驗針灸學》[16]相關標準),采用直徑5 mm 小艾條點燃后在距離穴位2 cm 處施灸,電子數顯溫度計在大鼠穴位局部監測體表溫度,維持在(40±1)℃(通過手動方法上下移動,控制局部穴區溫度),左右兩側足三里穴交替施灸,每次20 min,每日1 次。連續溫和灸12 個月,直至大鼠24 月齡。另設12 月齡組(12 月齡雄性SD 大鼠10 只)作為對照。

1.4 標本采集

實驗結束后,大鼠禁食24 h、不禁水。用2%戊巴比妥鈉50 mg/(kg·bw)行腹腔注射,待大鼠麻醉后,冰浴狀態取腎組織,一部分(約1 cm3大小)置于多聚甲醛中固定,另一部分置于標記好的凍存管中,投入液氮中保存待測。

1.5 觀察指標

1.5.1 免疫熒光檢測大鼠腎組織β-半乳糖苷酶表達

治療結束后,3 組隨機選擇大鼠,取各大鼠腎組織,制備組織切片,然后進行免疫熒光染色,經過冰凍切片、脫蠟水化、滴加熒光標記的一抗(β-半乳糖苷酶)、二抗、DAPI 覆蓋組織切片染色步驟,最后通過熒光顯微鏡進行拍片。

1.5.2 qRT-PCR 法檢測3 組大鼠腎組織端粒長度、p16 mRNA 、 衰老相關甲基轉移酶(DNMT3a 和DNMT3b)mRNA 表達

取新鮮大鼠腎組織,加入蛋白酶溶解,與腎組織充分混合,后續依次加入緩沖液GB、無水乙醇、CB3 并分別離心,同時重復操作2～3 次,提取組織中DNA;后續根據設置好的擴增體系依次加入試劑,在特定反應程序下操作,取得結果后通過CT 值進行分析,端粒(T)重復拷貝數與單拷貝基因(S)的比率,即T/S 比率可以得出端粒的相對長度,而T/S 比率與端粒相對長度成正比關系。T/S 計算公式如下,T/S ＝[2CT(telomeres)/2CT(single copy gene)]＝2-ΔCT。腎組織端粒長度 mRNA 檢測引物序列設計為 Primer F:5’GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT 3’,rimer R:5'TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3';腎組織 p16 mRNA 檢測引物序列設計為 Primer F:5'CGTGCGGTATTTGCGGTATC 3',Primer R: 5' TGCCAGAAGTGAAGCCAAGG 3';腎組織Dnmt3a mRNA 檢測引物序 列 設 計 為 Primer F 5' ATTACCACCAGGTCAAACTC,Primer R 5' CCAAACACCCTTTCCATTTC 3;腎組織Dnmt3b mRNA 檢測引物序列設計為Primer F 5' TCCTGCGGTAAGAAGAACCC 3',Primer R 5' ACTGATAGCCGTCCTCATCG 3';GAPDH 引物序列設計為Primer F:5' GGAGTCTACTGGCGTCTTCAC 3',Primer R:5'ATGAGCCCTTCCACGATGC 3'。擴增體系,實時熒光定量PCR 預混液12.5 μL、Forwardprimer 0.5 μL。反應程序為95 ℃條件下,10 min(95 ℃條件下15 s;60 ℃條件下45 s;72 ℃條件下1 min)×40;95 ℃條件下15 s;60 ℃條件下1 min;95 ℃條件下15 s;60 ℃條件下15 s。

1.5.3 酶聯免疫吸附法檢測3組大鼠腎組織p16蛋白表達

取3 組大鼠腎組織勻漿上清進行酶聯免疫吸附法(Rat CDKN2A/p16INK4a ELISA Kit, Catalog No. LS-F15224)檢測。采用“三明治”法進行檢測,將標準品添加至微孔板中,目標抗原與抗體結合,洗去未結合的樣品。接著加入生物素結合的檢測抗體,與相應抗原結合,洗去未結合的抗體。接著加入Avidin-HRP 標記的結合物、TMB 底物顯色等。最后在(450±2)nm 波長下測量每孔的光學密度(OD)。通過生成標準曲線確定抗原濃度。

1.5.4 免疫組化法檢測3 組大鼠腎組織衰老相關甲基轉移酶(DNMT3a 和DNMT3b)蛋白表達

取3 組大鼠腎組織,經福爾馬林固定后放入石蠟包埋并切片,將石蠟切片經脫蠟、水化、抗原修復、山羊血清封閉、滴加一抗(p16 abcam54210 1:800,Dnmt3a abcam188470,1:2 000,Dnmt3b abcam2851,1:300)、二抗、 DAB 顯色、 中性樹膠封片等步驟, 選用LEICADM6000B 光學顯微鏡鏡下觀察。切片背景為天藍色,陽性表達呈黃褐色或者棕色。圖像分析通過Imagepro-Plus6.0 圖像分析系統進行圖像定量測定。攝片時在每張切片中隨機選取3 個視野,計算陽性積分光吸度值(IOD),通過公式AOD＝IOD/area 計算平均光密度,最終結果取3 個切片的平均值。

1.5.5 重亞硫酸鹽測序技術檢測3 組大鼠腎組織p16 DNA CPG 島甲基化程度

亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA,進一步通過PCR 擴增技術,連接產物轉化、藍白斑篩選、質粒提取、質粒測序等步驟,比對所測序列。

1.6 統計學分析

采用SPSS21.0 統計軟件進行數據分析。計量資料數據服從正態分布,采用均數±標準差表示;不服從正態分布,則以中位數(四分位間距)表示。數據方差齊時,采用單因素方差分析,兩兩比較采用最小顯著差法(LSD);方差不齊時采用Games-Howell 比較組間差異。數據不符合正態分布,組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗,兩兩比較則采用Mann-WhitneyU檢驗。統計結果以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 最終納入實驗3 組大鼠數量

12 月齡組大鼠死亡1 只,24 月齡組大鼠死亡2 只,艾灸組大鼠死亡1 只。故最終納入實驗的為12 月齡組9 只、24 月齡組8 只和艾灸組9 只。

2.2 3 組大鼠腎組織衰老標志物檢測

2.2.1 3 組大鼠腎組織β-半乳糖苷酶的表達

鏡下觀察,大鼠腎組織內可看到β-半乳糖苷酶陽性表達。12 月齡組腎組織中陽性表達染色較淡,呈現弱陽性反應;24 月齡組腎組織中陽性表達面積較大,染色較深;艾灸組腎組織中陽性表達較衰老組弱,陽性表達面積小,染色偏淡。詳見圖1。

圖1 3 組大鼠腎組織β-半乳糖苷酶表達(免疫熒光,×200)

2.2.2 3 組大鼠腎組織端粒長度變化

3 組大鼠腎組織端粒相對長度檢測結果顯示,與12 月齡組大鼠比較,24 月齡組大鼠腎組織端粒相對長度表達降低,差異具有統計學意義(P＜0.05);與24 月齡組比較,艾灸組腎組織端粒相對長度表達升高,差異具有統計學意義(P＜0.05)。詳見圖2。

圖2 3 組大鼠腎組織端粒長度表達(12 月齡組n＝9,24 月齡組n＝8,艾灸組n＝9)

2.3 3 組大鼠腎組織p16 表達

2.3.1 3 組大鼠腎組織p16 蛋白表達

3 組大鼠腎組織p16 蛋白表達免疫組化結果顯示,p16 陽性表達染色呈棕黃色,在腎組織腎小球細胞、腎間質細胞及腎小管細胞胞核均可看到p16 蛋白表達。12 月齡組腎組織中p16 蛋白陽性表達染色較淡,呈弱陽性反應;24 月齡組腎組織中p16 蛋白表達較12 月齡組增多,呈陽性反應;艾灸組腎組織中p16 蛋白表達較24 月齡組降低,呈弱陽性反應。詳見圖3。

圖3 3 組大鼠腎組織p16 蛋白表達(免疫組化,×200)

3 組大鼠腎組織p16 蛋白經酶聯免疫吸附法檢測結果顯示,與12 月齡組大鼠比較,24 月齡組大鼠腎組織p16 蛋白表達增加(P＜0.05);與24 月齡組比較,艾灸組p16 蛋白表達下降(P＜0.05)。詳見圖4。

圖4 3 組大鼠腎組織p16 蛋白表達(12 月齡組n＝9,24 月齡組n＝8,艾灸組n＝9)

2.3.2 3 組大鼠腎組織p16mRNA 表達

3 組大鼠腎組織p16 mRNA 經qRT-PCR 檢測結果顯示,與12 月齡組大鼠比較,24 月齡組大鼠腎組織p16 mRNA 表達增加,差異具有統計學意義(P＜0.05);與24 月齡組比較,艾灸足三里組p16 mRNA 表達下降,差異具有統計學意義(P＜0.05)。詳見圖5。

圖5 3 組大鼠腎組織p16 mRNA 表達(12 月齡組n＝9,24 月齡組n＝8,艾灸組n＝9)

2.4 3 組大鼠腎組織p16 DNA 甲基化程度

3 組大鼠腎組織p16 DNA CpG 島甲基化率經BSP檢測顯示,3 組腎組織p16 DNA CpG 島甲基化率比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。與12 月齡組和24 月齡組比較,艾灸組大鼠p16 DNA CpG 島甲基化率升高,差異具有統計學意義(P＜0.05)。詳見圖6。

圖6 3 組大鼠腎組織p16 DNA CpG 島甲基化(12 月齡組n＝9,24 月齡組n＝8,艾灸組n＝9)

2.5 3 組大鼠腎組織衰老相關甲基轉移酶表達

2.5.1 3 組大鼠腎組織衰老相關甲基轉移酶蛋白表達

3 組大鼠腎組織Dnmt3a 和Dnmt3b 蛋白表達免疫組化結果顯示,Dnmt3a 和Dnmt3b 陽性表達染色呈棕黃色,在腎組織腎小球細胞、腎小管細胞及腎間質細胞胞核均可看到Dnmt3a 和Dnmt3b 蛋白表達。12 月齡組腎組織中Dnmt3a和Dnmt3b陽性表達較多,染色相對較深,呈強陽性反應;24 月齡組腎組織中Dnmt3a 和Dnmt3b表達較低,呈弱陽性反應;艾灸組腎組織中Dnmt3a 和Dnmt3b 蛋白陽性表達較24 月齡組增加,呈陽性反應。詳見圖7。

圖7 3 組大鼠腎組織Dnmt3a 和Dnmt3b 表達(免疫組化,×200)

2.5.2 3 組大鼠腎組織衰老相關甲基轉移酶mRNA 表達

3 組大鼠腎組織衰老相關甲基轉移酶Dnmt3a 和Dnmt3b mRNA 表達經qRT-PCR 檢測結果顯示,與12 月齡組比較,24 月齡組大鼠Dnmt3a 和Dnmt3b mRNA 表達降低,差異具有統計學意義(P＜0.05);與24 月齡組比較,艾灸組大鼠Dnmt3a 和Dnmt3b mRNA 表達增加,差異具有統計學意義(P＜0.05)。詳見圖8 和圖9。

圖8 3 組大鼠腎組織Dnmt3a mRNA 表達(12 月齡組n＝9,24 月齡組n＝8,艾灸組n＝9)

圖9 3 組大鼠腎組織Dnmt3b mRNA 表達(12 月齡組n＝9,24 月齡組n＝8,艾灸組n＝9)

3 討論

3.1 艾灸可影響衰老標志物的表達

隨著人口日趨老齡化,衰老成為目前人們研究的熱門話題。衰老本身是生命發展過程中不可逆的過程,但自古以來諸多醫家不斷尋求多種方式延緩衰老進程。腎為先天之本,早在《黃帝內經》中就提到腎氣盛衰主宰人體生長、發育、衰老的生命過程,其中腎虛、腎陰陽不足是衰老的主要病機。傳統灸法可通過借助灸火或輔以藥物燃燒的熱度及藥物作用于相關腧穴以達到治未病和延年的作用。

艾灸一方面可使得穴位局部組織溫度升高、能量代謝增加以及改善局部血液循環;另一方面可以影響機體遠部,通過刺激體表經穴發揮作用。此外,艾灸可調節體內自由基代謝[17],增強機體免疫功能[18],調節神經內分泌[19-20],改善脂質代謝[21-22],調控不同組織內c-fos、Bcl-2、Bax 等衰老相關基因的表達[18],延緩衰老進程。因艾灸燃燒時產生溫熱作用影響局部經穴,結合操作情況,考慮到43 ℃以上的熱刺激信號會對機體產生潛在性危害,動物在接受這個程度的熱刺激時會產生逃避、跳躍等傷害性反應,因此本實驗在經穴局部使用電子數顯溫度計進行溫度監測,控制在(40±1)℃,進一步關注溫和灸對衰老相關標志物及相關基因甲基化程度的影響。

隨著人口老齡化進展,多種腎臟疾病發病率日益增高,針對腎臟衰老的研究近年來熱度高漲,同時腎臟是受到衰老影響最明顯的器官之一。特異性的衰老標志物的出現說明細胞進入了衰老狀態,對衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)的檢測是能夠說明細胞進入衰老周期強有力的證據。相關研究發現[23-24],在細胞所處環境pH 為6 時,其SA-β-Gal 表達隨年齡增加而上調,且SA-β-Gal 敏感程度較高,在未發生衰老的細胞中檢測不到,因此SA-β-Gal 是目前被廣泛認可的檢測細胞衰老的金標準[25-27]。足三里穴是常用的保健要穴,是足陽明胃經的合穴、胃之下合穴,為回陽九針穴之一,土經中的土穴,為后天之本。本實驗在前人基礎上,采用自然衰老模型鼠為研究對象,通過溫和灸足三里穴,觀察衰老相關指標及相關基因甲基化程度,從p16 DNA 甲基化角度觀察溫和灸足三里穴對自然衰老模型鼠腎組織的影響,探究其延緩衰老的機制。此外,衰老的進展過程中伴隨端粒長度的損耗,研究發現端粒長度變化不僅影響腎臟衰老進程,而且與腎臟疾病、腎臟移植等有密切關系[28-29]。本研究發現,溫和灸可降低腎組織內衰老相關β-半乳糖苷酶的表達,降低端粒長度的損耗。隨著年齡的增長,腎臟的宏觀和微觀結構均會相應地發生變化。在微觀結構水平上,腎臟的衰老主要表現在出現腎間質纖維化、腎小球硬化、基底膜增厚、腎小管萎縮和動脈硬化等病變。本課題組前期研究發現,艾灸可有效降低衰老大鼠腎組織衰老標志物SA-β-Gal 的表達,改善自然衰老大鼠的腎小球結構,減輕腎組織炎癥,抑制腎間質纖維化;與此同時,溫和灸可同時可降低衰老大鼠24 h尿蛋白含量及血清BUN 水平,通過抑制FN 表達及TGF-β1 基因轉錄發揮腎臟保護作用[7-8],對腎臟衰老進程產生影響。

3.2 艾灸可對衰老相關甲基轉移酶表達的調控作用

DNA 甲基化是目前發現最早、研究較深入的重要表觀遺傳修飾作用之一,這一遺傳方式在胚胎發育、染色體失活、細胞功能的維持、基因印記等過程中具有十分重要的作用。DNA 甲基化的實現主要依賴于Dnmts的催化作用,相關Dnmts 的表達變化可直接或間接對DNA 甲基化狀態產生影響。哺乳動物的Dnmts 包含兩個結構和功能不同的家族,即Dnmt1 和Dnmt3。Dnmt1在生物體內表達廣泛,參與甲基化模式的復制過程;Dnmt3 家族包括Dnmt3a 和Dnmt3b,其表達在胚胎發生的不同階段,具有組織特異性,同時Dnmt3b 作為重要的從頭甲基化酶,可催化基因甲基化的新生位點[30-32]。Dnmt3b 可結合至分泌性卷曲相關蛋白1(secreted frizzled-related protein 1, SFRP1)基因啟動子區域,誘導CpG 島發生高甲基化,抑制SFRP1 基因轉錄,參與腎組織纖維化進程的調控[33]。此外,吳麗云等[34]通過研究發現,左金丸干預可以影響人體腸組織中Dnmts 的表達,對其異常表達可以有一定的調整作用。殷秋憶[35]通過研究發現,六味地黃方可調整雄性大鼠血清同型半胱氨酸水平進一步對其血管內皮細胞Dnmts 表達,起到抗內皮損傷的作用。因此傳統中藥可能通過多種路徑對組織器官內甲基轉移酶的表達進行調控,進一步對相應基因的表達產生干預作用,對細胞生長增殖產生影響。相關研究發現,年齡相關的去甲基化與甲基轉移酶表達的下調有關。DNA 甲基化內源性調控因素主要包括DNA 甲基轉移酶和去甲基化酶活性水平及體內其他因素對DNA 甲基化活性的調節。隨著年齡增長,甲基轉移酶的表達量顯著減少,此外體內重要激素如生長激素、性激素水平的變化也會對甲基轉移酶的活性起到重要干預作用并影響衰老相關進程。本研究發現,艾灸干預可明顯增加衰老大鼠腎組織內Dnmt3a 和Dnmt3b 的表達,提示艾灸足三里穴可提高衰老大鼠腎組織內甲基轉移酶的表達,這可能是艾灸延緩衰老的重要機制。

3.3 艾灸可通過調控p16 DNA CpG 島甲基化發揮延緩衰老進程的作用

DNA 甲基化作為一種復制后修飾,主要出現在原核生物和真核生物基因組中,體內多種重要的生理過程均有其參與,對基因表達的調節,染色體完整性的維持及染色體滅活等都起到了十分重要的干預作用。DNA甲基化與腫瘤、遺傳性疾病和衰老的發生具有十分密切的關系。甲基化模式非常不穩定,并受多種刺激如理化刺激、衰老、疾病等多種因素的影響。甲基化的DNA與甲基CpG結合蛋白二者結合(甲基CpG結合蛋白具有與組蛋白去乙酰化酶蛋白復合體相結合的性質),因此在兩種蛋白參與的情況下,細胞染色體聚簇成團,導致DNA 轉錄活性喪失,細胞生長阻滯,出現細胞衰老[36]。本實驗研究發現,12 月齡組大鼠p16 DNA CpG 島整體甲基化水平與24 月齡組未見明顯差異,提示腎組織衰老相關p16 DNA CpG 島甲基化程度在大鼠老年前期即趨于穩定,從老年早期開始的持續的溫和灸足三里穴可提高p16 DNA CpG 島整體甲基化水平,降低p16 mRNA及p16 蛋白在衰老機體的表達,這可能是溫和灸參與調控衰老進程的重要機制之一。

4 結論

艾灸可通過影響衰老相關甲基轉移酶的表達,調控p16 DNA CpG 島整體甲基化水平,降低p16 mRNA 及p16 蛋白在衰老機體的表達,從而發揮延緩衰老的生物學效應。