長牡蠣弧菌抗性選育家系生長和存活性狀遺傳參數評估及基因型與環境互作效應分析

李 寅 魯林基 楊 奔 李鵬飛 徐成勛 李 琪 劉士凱

(中國海洋大學海水養殖教育部重點實驗室, 青島 266003)

長牡蠣(Crassostrea gigas)又稱太平洋牡蠣, 是中國北方重要的水產養殖物種, 也是世界上重要的海產經濟貝類[1,2]。近年來, 長牡蠣在世界不同養殖地都經歷不同程度的夏季大規模死亡(Mass summer mortality), 嚴重地影響了牡蠣產業的健康發展。相關研究表明細菌、病毒等病原體感染,與長牡蠣夏季大規模死亡事件密切相關[3,4]。在團隊先前開展的研究工作中, Yang等[5]從我國暴發大規模死亡的牡蠣體內分離出一株高致病性的菌株,經鑒定為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) Cg5菌株,由此推斷溶藻弧菌可能是導致長牡蠣夏季死亡的關鍵菌株。溶藻弧菌是一種革蘭氏陰性細菌, 廣泛分布于海洋和河口等自然水域中, 特別是在溫暖地區的海水中較為常見[6]。該弧菌已報道可在日本對蝦等多個海洋生物中引起疾病[7—9], 并且能夠引起人類的耳炎和傷口感染[10], 具有較強的危害性。

由于牡蠣自身缺乏適應性免疫系統, 加上養殖水體等人為無法控制的自然環境因素, 導致無法通過藥物或疫苗等人為干預的手段進行疾病的預防和治療[11], 較為有效的方法是通過遺傳改良手段選育具有弧菌抗性的長牡蠣, 以此降低弧菌感染造成的經濟損失。目前國內外針對長牡蠣遺傳改良已開展了多個選擇育種項目, 主要集中在生長[12—15]、殼色[16—18]等經濟性狀的遺傳改良。一些聚焦于提高牡蠣抗病能力和存活率的選擇育種方案也相繼開展并取得顯著效果, 例如牡蠣皰疹病毒Ostreid herpesvirus1 (OsHV-1)的抗性改良[19,20]、河口弧菌(Vibrio aestuarianus)的抗病性選育[21]。在溶藻弧菌的抗性選育方面, Yang等[22]于2019年以溶藻弧菌為病原, 對52個長牡蠣家系(n=1402)進行攻毒, 采用簡化基因組測序分型技術解析了抗弧菌性狀的遺傳基礎, 并通過家系選育結合全基因組選育的方法開展了長牡蠣抗弧菌家系的育種工作。Zhai等[23]評估了長牡蠣抗弧菌家系的弧菌抗性性狀遺傳參數,并指出弧菌抗性性狀遺傳力表現為中低等水平, 同時其研究還指出弧菌抗性性狀與生長性狀之間較低的遺傳和表型相關性, 表明生長性狀和抗性性狀同時遺傳改良的可行性。長牡蠣的生長和存活等性狀是重要的經濟性狀, 通過研究其遺傳參數, 制定合理的選育路線, 可以提高長牡蠣的產量, 獲得更高的經濟效益。目前已在多個品系開展工作, 例如, Dégremont等[24]和Chi等[25]報道了長牡蠣不同生長階段的生長、存活的遺傳參數。陳雨露等[26]、方佳峰等[27]和趙宗武等[28]報道了長牡蠣殼橙、殼白品系生長性狀的遺傳參數。然而, 目前尚未在長牡蠣弧菌抗性品系中開展有關生長和存活性狀的遺傳參數評估工作。

育種計劃的有效性不僅取決于目標性狀的遺傳基礎及育種策略, 還取決于基因型與環境的相互作 用(Genotype × Environment interaction, GEI)[37]。不同養殖海域, 水體環境條件等存在差別, 造成牡蠣在生長或存活率等方面會產生顯著差異, 不可避免地產生GEI效應, 即基因型在不同環境中具有不同的表現型[28]。GEI等遺傳參數值的準確估計是實施良好育種計劃的先決條件, 因為顯著的GEI可能會減少遺傳增益, 所以在設計育種方案時, 確定影響這些不同養殖區域下的選育性狀間的GEI具有重要意義。有關長牡蠣GEI的研究也有較多的報道。例如, Evans等[29]報道了長牡蠣生長和存活性狀在俄勒岡州和華盛頓州兩個不同養殖環境下的互作情況。Dégremont等[30]則報道了法國3個不同養殖地點長牡蠣的存活率和產量情況。Chi等[31]報道了長牡蠣收獲性狀在乳山、黃島、榮成3個養殖地點的GEI效應。邢德等[32]報道了長牡蠣殼白品系的生長和殼色性狀在乳山、榮成兩地的GEI效應。目前還沒有關于弧菌抗性長牡蠣生長及存活性狀的基因型與環境互作的相關報道。

本研究以前期篩選出的弧菌抗性家系為親本,采用單對單交配方案, 構建了40個全同胞家系, 以單變量動物模型和父本母本閾值動物模型評估了長牡蠣抗弧菌選育G2代家系在不同日齡下生長和存活性狀的遺傳參數, 同時針對不同養殖區域的環境, 評估了長牡蠣弧菌抗性家系生長和存活性狀在多環境下的基因型與環境互作效應。本研究旨在為長牡蠣弧菌抗性的遺傳改良提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 親本來源和家系構建

2019年, 收集不同遺傳背景(野生品系、中日韓選育系、美國殼型選育系、橙黑相關選育系)的52個長牡蠣家系作為基礎群體G0[23]。隨機選取基礎群體G0中的1402只長牡蠣進行溶藻弧菌的人工侵染, 以篩選抗病性家系, 同時對溶藻弧菌感染的抗性性狀遺傳力進行了估算[23]。根據應用閾值動物模型, 計算G0中各家系抗性性狀的育種值(即親本育種值的平均值), 2020年選擇家系育種值排名前20%的G0家系以單對單的交配設計構建了長牡蠣抗溶藻弧菌選育家系(G1)。

本實驗所使用的親本來自2020年構建的G1家系。2021年3月選擇經過人工篩選的30個G1家系,轉移至室內進行人工促熟。2021年5月, 待親本性腺發育成熟, 對長牡蠣進行雌雄辨別, 挑選性腺發育良好的父母本各40個, 按照雌雄比1∶1的比例進行人工授精, 共構建40個全同胞家。

1.2 孵化、幼蟲培育和養成

在授精完成后, 所有家系轉移至獨立的100 L聚乙烯桶內進行孵化, 孵化時受精卵密度控制在30個/mL, 海水溫度控制在23℃左右。在孵化24h后, 受精卵發育至D型幼蟲, 并用300目篩絹進行選優。幼蟲的密度前期控制在8—10個/mL, 臨近投附著基時調整至2—3個/mL。整個幼蟲培育期間保持持續充氣, 定期檢查沉淀池的水質情況, 每日換水,換水量約為1/3, 在幼蟲的整個生長期間以等鞭金藻(Isochrysis galbana)為主, 后期加入適量的扁藻(Platymonassp.)進行投喂。當桶內有超過30%的幼蟲到達眼點幼蟲階段時, 投放扇貝殼作為附著基以供幼蟲附著。附著期間加大換水量、投餌量和充氣量, 待幼蟲完成附著后, 轉移至室外沉淀池暫養以適應海洋環境。

當暫養個體達到3 mm左右時, 從40個家系中隨機選取90個個體分成3個重復, 每個重復30個個體, 放在20網目0.3 m×1.5 m×0.3 m規格的網籠中并轉移至榮成桑溝灣海區。為了評估抗弧菌家系在不同海區的基因環境互作, 從剩余的40個家系中挑選個體數目較多的30個家系, 同樣隨機選取90個個體設置3個重復, 存放在20網目0.3 m×1.5 m×0.3 m規格的網籠中并轉移至乳山海區(同時對每個家系做好標記方便與榮成海區的家系對應)。即榮成養殖海區含40個家系, 每個家系90只牡蠣, 共3600只牡蠣; 乳山海區含30個家系, 每個家系90只牡蠣, 共2700只牡蠣。乳山和榮成養殖海區的基本情況如表1所示。

1.3 取樣觀測

在稚貝附著后的120、180、300、400和460日齡前往榮成海域記錄40個牡蠣家系的生長和存活率數據。同時, 在稚貝附著后的300、400和460日齡統計乳山海域30個牡蠣家系的生長和存活率數據, 并與榮成海區對應的家系形成對比, 用作基因型與環境互作分析。

生長性狀的測量是通過電子游標卡尺(精確度0.01 mm)從各個家系的90個個體中隨機選取30個個體測量牡蠣的殼高(Shell height, SH)和殼長(Shell length, SL), 當存活的牡蠣個數不足30只時, 全部測量。存活性狀則通過計算吊籠里各家系三層牡蠣死亡個數的均值, 然后計算出該家系死亡個數均值占起始牡蠣總個數的比例即為該家系的存活率(Survival rate, SR)。

1.4 遺傳力估計

采用SPSS軟件(22.0)對生長和存活率數據進行單因素方差分析和多重比較來分析不同家系間生長和存活率的差異, 將P＜0.05設為差異顯著。使用ASREML3.0運行動物模型進行遺傳參數的評估[33],采用單性狀動物模型的限制最大似然法(REML)計算不同生長階段的殼高和殼長的遺傳力, 公式如下:

采用單變量動物模型計算殼高和殼長的遺傳力, 計算公式:

采用父本母本閾值logit模型計算存活性狀的遺傳力, 模型:

對于父本母本閾值模型來說, 存活性狀遺傳力計算公式:

1.5 生長與存活性狀的相關性分析

用雙變量動物模型來估計生長性狀間的遺傳相關和表型相關, 計算公式:

1.6 基因型與環境互作分析

評估榮成與乳山海區間的基因型與環境的相互作用(GEI)情況可以通過計算2個不同養殖地點間的遺傳相關來處理[34]。將2個環境中的同一性狀視為2個不同性狀。通過單變量動物模型預測殼高、殼長數據的育種值; 通過父本母本閾值模型估計存活性狀的育種值。然后通過使用SPSS22.0軟件進行Pearson相關性分析, 計算得出2個環境同一性狀間的遺傳相關。不同環境中的同一性狀的遺傳相關性為0.5、0.7和0.9, 分別代表了不同程度的GEI效應(嚴重、中等和不顯著)[34]。

2 結果

2.1 長牡蠣弧菌抗性家系生長和存活性狀的表型參數

如表2所示, 在不同日齡下存活性狀的變異系數范圍最大, 榮成海區的變異系數為14.79% (120d)—60.73% (460d), 在乳山海區的變異系數為21.74%(300d)—40.19% (400d)。殼高和殼長變異范圍較小且較為接近, 榮成海區的殼高變異系數為13.68%(400d)—16.97% (180d), 殼長的變異系數為13.83%(460d)—20.67% (300d); 乳山海區的殼高變異系數為10.62% (460d)—14.44% (300d), 殼長的變異系數為13.12% (460d)—17.02% (300d)。

表2 長牡蠣弧菌抗性家系不同日齡下生長和存活性狀的表型參數Tab. 2 Phenotypic parameters of growth and survival traits in Vibrio resistant families of C. gigas at different ages

2.2 長牡蠣弧菌抗性家系生長和存活性狀的遺傳參數估計

如表3所示, 在榮成海區, 殼高的遺傳力估計為(0.46±0.10) (460d)—(0.53±0.11) (120d), 不同日齡下的遺傳力均為中高等遺傳力; 殼長的遺傳力估計為0(.30±0.08) (120d)—(0.56±0.11) (180d), 均為中高等遺傳力。在乳山海區, 殼高的遺傳力估計為(0.55±0.14) (460d)—(0.59±0.13) (300d), 不同日齡下的遺傳力均為高等遺傳力; 殼長的遺傳力估計為(0.50±0.12) (300d)—(0.59±0.13) (400d), 均為高等遺傳力。在榮成海區, 存活性狀的遺傳力估計為(0.25±0.06) (180d)—(0.41±0.09) (460d), 存活性狀除在460日齡遺傳力為中等遺傳力外, 其余階段均為低等遺傳力; 而在乳山海區, 存活性狀的遺傳力估計為(0.27±0.07) (300d)—(0.41±0.11) (460d), 存活性狀除在300日齡遺傳力為低等遺傳力外, 其余兩階段均為中等遺傳力。

表3 不同生長階段生長性狀和存活性狀的遺傳力估計Tab. 3 Estimates of heritability of growth and survival traits at different growth stages

2.3 長牡蠣弧菌抗性家系生長和存活性狀的表型相關與遺傳相關

如表4所示, 除在榮成海區180日齡時, 殼高和殼長的表型相關為低度正相關, 其余各階段殼高和殼長之間的遺傳相關和表型相關均為中高度正相關。且不同日齡的生長性狀的遺傳相關(0.429—0.828)均高于表型相關(0.192—0.611)。在不同日齡下, 生長和存活性狀的遺傳相關范圍為-0.138—0.380, 表型相關范圍為-0.073—0.512, 除120日齡時, 生長和存活性狀之間的遺傳相關和表型相關為負相關外, 其余日齡下遺傳相關和表型相關均為正相關。榮成海區除300日齡時, 生長性狀和存活性狀之間的表型相關為中度正相關外, 其余各階段均為低度的正相關, 而乳山海區各階段生長性狀和存活性狀之間的表型相關均為低度正相關。

表4 長牡蠣抗弧菌家系不同日齡下生長性狀和存活性狀的遺傳相關(對角線上方)和表型相關(對角線下方)Tab. 4 Genetic correlation (above the diagonal) and phenotypic correlation (below the diagonal) of growth and survival traits in Vibrio resistant families of C. gigas at different ages

2.4 基因型與環境互作效應

長牡蠣弧菌抗性選育家系在榮成和乳山兩個養殖地點的生長和存活性狀的遺傳相關如表5所示, 對于各個時間段來說, 榮成和乳山海域牡蠣的殼高遺傳相關范圍為(0.34±0.07)—(0.68±0.01); 而對于殼長指標, 在不同日齡下, 榮成和乳山海域殼長遺傳相關范圍為(0.35±0.06)—(0.63±0.03)。對于存活率指標, 榮成和乳山海域存活性狀遺傳相關范圍為(0.32±0.08)—(0.50±0.03)。同一性狀在不同環境下遺傳相關為0.5、0.7和0.9, 代表嚴重、中等和不顯著的基因型與環境互作。不同日齡的弧菌抗性長牡蠣的生長和存活性狀的遺傳相關均小于0.7,這說明不同時間段乳山和榮成養殖海區存在非常顯著的基因型與環境互作效應。

表5 兩個環境下的長牡蠣抗弧菌家系生長和存活性狀的遺傳相關Tab. 5 Genetic correlation of growth and survival traits of Vibrio resistant families of C. gigas in two environments

3 討論

3.1 生長和存活性狀的表型變異

變異系數(CV)是用于衡量數據集相對于均值的離散程度, 在選擇育種中CV常被用于量化和比較表型性狀變異的程度[35]。在本研究中, 通過對長牡蠣弧菌抗性家系生長和存活率的表型數據觀測發現, 長牡蠣弧菌抗性家系存活性狀的變異系數最大, 而殼高和殼長性狀的變異范圍較小且較為接近。這說明對于存活性狀而言, 生長性狀在選育過程中能夠穩定的遺傳。先前也有研究報道長牡蠣存活性狀表現出較大的遺傳變異, 例如Chi等[36]對長牡蠣幼蟲和稚貝階段的殼高和殼長性狀進行測量并對存活率進行了統計, 發現存活率的變異系數為最大, 為6.68%—47.42%, 而殼高和殼長性狀的變異系數較小且較為接近, 分別為8.21%—23.03%、8.12%—24.58%。結合上述的研究結果不難發現,以存活性狀作為長牡蠣的選育指標具有較大的遺傳改良的潛力和優勢。

3.2 生長和存活性狀的遺傳參數

遺傳力大小是決定選擇育種方案的主要根據之一, 目標性狀的遺傳參數的準確估計對設計育種方案具有重大的指導意義[37]。本研究對長牡蠣弧菌抗性家系生長性狀的遺傳力進行估計發現在不同日齡下殼高和殼長性狀的遺傳力均為中高等遺傳力。這說明對于本研究中的弧菌抗性家系來說, 開展生長性狀的選育是有效的。此外, 對于長牡蠣生長性狀的遺傳力估計先前也有不少報道, 例如,Kong等[38]采用全因子交配設計方法估計了來自雙島灣長牡蠣一齡個體的殼高、殼長等生長性狀的遺傳力, 發現各性狀遺傳力介于0.35—0.49, 屬于中高等遺傳力, 這與我們結果類似。Li等[12]利用群體選育方法在相同養殖環境下估測中國、日本和韓國3個群體的殼高在不同生長階段的遺傳力分別為0.334、0.402和0.149, 遺傳力介于中低遺傳力之間。王慶志等[39]采用二因素系統分組的方差、協方差分析估計長牡蠣5—25日齡殼高的遺傳力為0.161—0.387, 殼長的遺傳力為0.139—0.398, 遺傳力范圍均為中低等遺傳力。綜合上述分析發現, 各研究中有關長牡蠣生長性狀的遺傳力不盡相同, 這可能是由于養殖區域、日齡及年份的差異導致的,因此在開展遺傳力選育時要綜合考慮因素以制定合理計劃。

牡蠣的存活率是與牡蠣產量直接相關聯的, 存活性狀在遺傳學上被定義為閾值性狀, 如患病或正常、存活或死亡, 都可被視為閾值性狀[40]。本研究通過父本母本閾值模型估計了長牡蠣弧菌抗性家系存活性狀的遺傳力, 結果顯示為中低水平遺傳力,這與Chi等[25]采用相同的數據分析模型估計的長牡蠣存活性狀的遺傳力相似。Evans等[29]在4個養殖地點估計3個不同日齡下長牡蠣存活性狀的遺傳力,顯示在360日齡, 華盛頓州達博灣潮間帶的長牡蠣存活性狀遺傳力范圍為0.36—0.49, 屬于中等遺傳力, 而其他3個地點則展現出較高的遺傳力水平, 范圍為0.50—0.71, 遺傳力略為高于本研究結果。Dégremont等[30]報道了法國海岸3個不同地點長牡蠣存活性狀的遺傳力分別為1.08、0.89和0.47, 均處于高等遺傳力水平, 高于本研究的結果。在以上研究中, 各存活性狀的遺傳力各有差異, 這可能與環境等外部因素有關, 也可能是評估方法的差異導致。當某一性狀的遺傳力較高時可以采用群體選育方法進行選育, 而當遺傳力較低時則可以通過家系選育等方法進行選育, 本研究所估計的存活性狀處于中低遺傳力水平, 表明進行家系選育的方法是合理的。另外本研究的遺傳參數評估還顯示, 在前期養殖過程中存活性狀的遺傳力估計為低等水平,這表明在前期選擇的準確性比較低, 不過隨著牡蠣的不斷生長, 遺傳力水平也由前期的低等轉為后期的中等, 因此在養殖階段的后期進行存活性狀的篩選, 具有較高的選擇潛力。

3.3 生長和存活性狀的表型相關與遺傳相關

了解性狀間遺傳相關性是在選擇育種過程中至關重要的一步。生長性狀間的遺傳相關和表型相關在之前的研究中已有大量報道。例如, Zhang等[14]報道了“海大1號”第八代和第九代選育群體殼高和殼長之間的表型相關和遺傳相關均處于高度的正相關。孔寧等[41]研究發現長牡蠣一齡下的殼高和殼長遺傳相關性為高度的正相關。在本研究中不同日齡下, 殼高和殼長的遺傳相關均大于表型相關, 這說明對殼高進行選育的同時也可以對殼長進行選育。另外, 除榮成海區180日齡時殼高和殼長的表型相關為低度正相關外, 其余各階段殼高和殼長間的遺傳相關和表型相關為中高度正相關。對于180日齡表現出低度正相關的現象, 這里推測可能是受到環境因素的影響。例如, 180日齡在2月取樣, 冬季低溫環境影響牡蠣生長[42]。此外, 近年來海區養殖密度的不斷加大, 隨著牡蠣的不斷發育,密度可能成為影響殼型的重要因素[43], 不過要深入了解這個現象, 需要進行更多的研究和數據分析。綜合以上研究表明, 殼高性狀和殼長性狀具有較高的正相關性, 這說明控制殼高和殼長的基因可能是緊密連鎖的且具有多效性。因此在選育殼高的同時, 也會對殼長起到間接選育的效果。生長和存活性狀間的遺傳相關研究也被多次報道, 如Chi等[25]報道長牡蠣幼蟲和稚貝期生長和存活性狀遺傳相關范圍為-0.21—0.35, 屬于低遺傳相關性。在日本囊對蝦中, 鄭靜靜等[44]發現在285日齡下各生長與存活性狀間的遺傳相關表現出中低度正相關。在本研究的生長和存活性狀的相關性分析中, 生長和存活性狀間的遺傳和表型相關均較低。除榮成海區300日齡外, 生長和存活性狀之間的表型相關為中度相關, 其余各發育階段均為低度相關性, 而乳山海區300日齡生長和存活性狀之間的表型相關仍呈現低度相關性。這可能是受到各自海區環境和生態因素的影響, 導致了不同的表型表現和相關性強度。綜上, 結合本研究結果發現控制長牡蠣生長和存活性狀的基因可能在不同的基因座上, 因此可分別對生長和存活性狀進行改良, 即對存活性狀的選擇性育種不會對長牡蠣的生長性產生負面影響,反之亦然。

3.4 基因型與環境互作

一般來說, 隨著養殖環境(水溫、鹽度、餌料和管理方式)的變化, 選擇的目標性狀在不同養殖環境會存在基因型與環境互作(GEI)效應[45]。較大的GEI效應會導致長牡蠣的生長和存活性能得不到充分的發揮, 從而導致養殖產能的下降, 造成經濟損失, 因此了解不同養殖環境下的GEI是至關重要的。對于長牡蠣GEI效應的研究已有很多報道,Mallet等[46]報道了5個不同遺傳背景的美洲牡蠣群體在2個不同養殖環境下的生長性狀存在顯著GEI效應。Dégremont等[30]對法國3個不同養殖地點長牡蠣的存活和產量情況進行研究, 同樣發現顯著的GEI效應。以上研究結果都說明有必要開展牡蠣的GEI效應研究, 用以科學合理地指導遺傳育種工作。在本研究中, 300日齡、400日齡和460日齡時乳山和榮成養殖海區長牡蠣的存活性狀存在明顯的重排效應, 且不同日齡的長牡蠣在兩海域間生長性狀的GEI達到中度和重度水平。這可能是由于乳山海域比榮成海域年平均水溫高, 風浪大所導致。當兩個養殖海域養殖生物存在GEI, 單一的選擇育種方案會大大降低遺傳增益, 因此, 為了提高長牡蠣在多種養殖環境下的存活率, 需要針對不同養殖環境制定不同的選育方案。

4 結論

本研究分析了不同日齡長牡蠣弧菌抗性家系的表型參數、遺傳力及生長和存活性狀的關聯性,確定了以存活性狀作為選育目標的可行性; 同時發現生長性狀的遺傳為中高遺傳力, 而存活性狀遺傳力為中低遺傳力, 并且生長和存活性狀之間的相關性較低, 這說明無法通過單一的存活性狀選育實現對生長性狀的改良, 而同時將生長和存活性狀進行協同選育是可行的。本研究還發現弧菌抗性長牡蠣在乳山和榮成2個養殖海區存在顯著的基因型與環境互作效應。因此在實際育種過程中要結合具體養殖環境制定特定的育種方案。本研究為長牡蠣抗弧菌品系的選育提供基礎資料和科學依據。