植物葉片懸浮培養的研究

安惠韜 王茜 王瑞剛

收稿日期：2023-11-28

* 基金項目：呼和浩特市重大科技專項（2022-社-重-1-3）、科技創新團隊（NMGIRT2222和BR22-13-05）

第1作者：安惠韜（1998-），? 男，? 碩士研究生，? 主要研究方向：? 植物生物化學與分子生物學。

**通訊作者：王瑞剛（1972-），? 男，? 教授、? 博士生導師，? 主要研究方向：? 植物生物化學與分子生物學

引文格式：安惠韜，? 王茜，? 王瑞剛.? 植物葉片懸浮培養的研究［J］.? 林業科技，? 2024，? 49（1）：? 29 - 33.

DOI ： 10. 19750 / j. cnki. 1001 - 9499. 2024. 01.? 007

摘要：? 對于植物為適應脅迫環境的生理變化及其適應脅迫環境能力的研究是近年來的熱點問題。滲透調節機制是植物適應脅迫環境的主要生理機制，其中植物葉片細胞滲透勢的測定與研究是確定植物滲透調節能力的關鍵。本研究以擬南芥、檸條、落葉松為研究對象，經過梯度濃度蔗糖溶液培養，以質壁分離現象的發生為標準測定植物葉片細胞滲透勢。通過顯微鏡觀察發現，擬南芥、檸條、落葉松葉片細胞等滲濃度分別為0.375、0.575、0.825 mol/L（蔗糖溶液）。計算得出，擬南芥、檸條、落葉松葉片細胞滲透勢分別為-921.3、-1 412.66、-2 026.86 kPa。對南芥、檸條、落葉松等植物葉片細胞滲透勢的測定，有利于提高植物組織培養效率、提高植物植物存活率。同時，為植物滲透調節機制的研究、優良品種的選育提供理論依據。

關鍵詞：? 擬南芥；? 檸條；? 落葉松；? 質壁分離；? 滲透勢； 等滲

中圖分類號：? ?S 512. 1; Q 95; Q 71? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：１００1 － 9499（２０24）01 － 0029 － 05

Research on Isotonic Suspensions of Plant Leaves

AN Huitao WANG Qian WANG Ruigang**

（ Inner Mongolia Key Laboratory of Plants Adversity Adaptation and Genetic Improvement in Cold and Arid Regions，? ?Inner Mongolia Hohhot 010018）

Abstract Research on the physiological changes in plants to adapt to stressful environments and their ability to adapt to stressful environments has been a hot issue in recent years. Osmoregulation is the main physiological mechanism for plants to adapt to stressful environments， among which the determination and study of the osmotic potential of plant leaves is the key to determine the osmoregulatory capacity of plants. In this study， the osmotic potential of plant leaves was determined by the occurrence of the phenomenon of plasmatic wall separation after incubation with a gradient concentration of sucrose solution using arabidopsis， lemongrass and larch as the subjects. The isotonic concentrations of Arabidopsis thaliana， Caragana microphylla and Larix gmelinii were 0.375， 0.575 mol/L and 0.825 mol/L （sucrose solution） respectively. The calculated cellular osmotic potential was -921.3， -1 412.66， and -2 026.86 kPa for Arabidopsis， lemongrass， and Larix gmelinii， respectively. The determination of the osmotic potentials of the leaves of Arabidopsis thaliana， Caragana korshinskii microphylla and Larix gmelinii was useful for improving the efficiency of plant tissue culture and plant survival. At the same time， it provides theoretical basis for the study of osmoregulation mechanism of plants and the selection and breeding of excellent varieties.

Key words Arabidopsis thaliana; Caragana korshinskii; Larix gmelinii; plasmolysis; osmotic potential; isotonic

滲透調節（Osmoregulation， osmotic adjustment）是指細胞通過增加或減少溶質以降低或提高滲透勢的調節作用[ 1 ]，是植物維持無機離子適當濃度的關鍵。滲透調節的含義是指植物通過新陳代謝活動增加細胞內溶質濃度，降低滲透勢（即水勢），繼續從細胞外介質中吸收水分以維持一定的膨脹壓力，使得其在干旱、鹽堿等脅迫環境下保持較正常的代謝活動[ 2 ]。在干旱條件下，參與植物細胞滲透調節的主要物質是滲透調節無機離子K+、Ca2+、Mg2+以及滲透調節有機物質可溶性糖、脯氨酸、甜菜堿等[ 3 - 4 ]。在水分脅迫作用下，植物會降低其細胞滲透勢即水勢，而其滲透調節機制則通過保持膨脹壓力來維持其穩定性，進而維持植物葉片細胞氣孔的傳導性，并且保護光系統的正常功能，維持光合作用光化學活性，保證光合作用的正常進行[ 5 ]。因此，滲透調節是植物重要的抗逆生理機制，是植物通過降低滲透勢適應鹽脅迫[ 6 ]、干旱脅迫[ 7 - 8 ]、水分脅迫等影響植物生長發育的逆境[ 9 ]，同時對植物的正常生理代謝活動與生長發育都有著重要作用。

植物可以在脅迫環境下繼續生長，依賴于較為復雜的滲透勢調節機制[ 10 ]。通常認為，等滲環境下植物組織用于調節細胞滲透壓的能量最少，有利于植物的生長發育。測定植物細胞與組織滲透勢的常用方法包括質壁分離法、冰點降低法和蒸汽壓力降低法等[ 11 ]。本研究擬用本實驗室常用實驗植物擬南芥（Arabidopsis thaliala）為草本植物代表、檸條（Caragana sinica）為灌木代表、落葉松（Larix gmelinii）為喬木代表，此三者作為研究材料，通過植物細胞質壁分離實驗，確定植物組織的等滲點。植物組織滲透勢的研究及確定對擬南芥、檸條、落葉松等植物生理代謝機制、抗逆機制的研究有重要意義，并且為植物組織培養技術、植物生理代謝活動及細胞內物質穩態的研究提供了理論依據。

1 材料與方法

1. 1 實驗材料

本研究所用實驗材料擬南芥、檸條、落葉松均由內蒙古農業大學旱寒區植物逆境適應與遺傳修飾改良自治區重點實驗室提供。

1. 2 梯度濃度蔗糖溶液的配置

1 mol/L蔗糖溶液（母液）：稱取34.2 g預先在60～80 ℃條件下烘焙至恒重的蔗糖置于100 mL容量瓶中，隨后使用蒸餾水溶解并定容至100 mL。用1 mol/L蔗糖溶液（母液）依C1V1=C2V2公式配置成以0.05 mol/L為濃度差，0.30～0.70 mol/L為范圍的系列梯度濃度的蔗糖溶液，將配置好的梯度濃度蔗糖溶液貯于小試劑瓶中。取9套干燥潔凈的培養皿編號標注，將配制好的梯度濃度蔗糖溶液按順序加入各培養皿中，使溶液成一薄層。

1. 3 植物葉片的處理及表皮細胞的液體懸浮培養

選擇生長狀況良好，無斑點、無蟲蛀的植物葉片，獲取其植物葉片表皮。所取材料應盡量保持處于同一植株部位，并且撕取葉片表皮細胞時應避開葉片主脈，取用其他部位。為了有良好的觀察效果，獲取植物葉片表皮細胞時應盡量去除葉肉部分，僅保留表皮細胞。因擬南芥、檸條的植物葉片較為幼嫩撕取較為困難，需選取生長周期長的植株或顏色較深的老葉片，用鑷子撕取其表皮。而落葉松葉片的表皮較難大面積撕取，可使用刀片刮去其中一面表皮與全部葉肉細胞。將獲取的植物葉片表皮，立即分別浸入準備好的培養皿中浸泡20～30 min。同時記錄室溫。

1. 4 顯微鏡玻片的制備及觀察

從低到高濃度依次取出材料，放在滴加對應濃度蔗糖溶液的載玻片上并編號標注，蓋好蓋玻片。將制備好的玻片置于顯微鏡下，觀察各玻片的植物細胞是否發生質壁分離現象。若在兩個相鄰濃度的材料中，一個沒有發生質壁分離或質壁分離細胞數不足50%，則該濃度即沒有引起細胞發生質壁分離的最高外液濃度；另一個發生質壁分離的細胞數超過50%，則該濃度即引起細胞發生質壁分離的最低外液濃度。此時，對這兩個濃度取平均值后的結果即可作為本材料葉片細胞的等滲濃度。

1. 5 細胞滲透勢（ΨS）的計算

將所得的等滲濃度和記錄的室溫帶Van Hoff公式ΨS= -icRT，計算出細胞等滲溶液的滲透勢即細胞的滲透勢（ΨS）。式中，ΨS為溶液的滲透勢力（與細胞的滲透勢相等）；c為等滲濃度（mol/L）；R為摩爾氣體常量[（0.0083 L·MPa）/（mol·K）]；T為熱力學溫度（K），即273+t℃（實驗時溫度）；i為溶液溶質的解離系數（蔗糖i=1）。

2 結果與分析

2. 1 擬南芥葉片表皮細胞質壁分離現象的顯微鏡觀察

成熟植物細胞水勢Ψ=ΨS+ΨP+ΨM[ 12 ]。襯質勢（ΨM）是由于細胞膠體物質親水性和毛細管對自由水的束縛而引起的水勢降低值。由于已經形成中心大液泡的細胞含水量很高，襯質勢只占整個水勢的微小部分，通常一般忽略不計。滲透勢（ΨS）是指因溶質的存在而使水勢降低的值。溶液滲透勢決定于溶液中溶質顆粒總數，故滲透勢以負值表示。壓力勢（ΨP）是指細胞吸水膨脹時原生質向外對細胞壁產生膨壓，而細胞壁向內產生的反作用力引起的細胞水勢增加的值，一般為正值。當細胞失水時，細胞膨壓降低，原生質體收縮，壓力勢則為負值。當剛發生質壁分離時壓力勢為零。因此，在測定植物細胞水勢時ΨP、ΨM可忽略不計[ 13 ]。本研究中，選用質壁分離法來測定植物細胞的滲透壓。活細胞的原生質膜具有選擇性滲透功能，細胞內外物質的進出都由其控制，它對于水具全透性，但對于某些溶質的透性則較低。當植物組織被置于一定濃度的某溶液中時，其細胞內外的水分便可根據水勢梯度的方向發生遷移，從而通過過原生質膜。當外液濃度低時，細胞內滲透壓將升高，胞外溶液中的水則進入細胞內；而當外液濃度較高時，細胞內滲透壓降低，細胞內的水分則向外滲出，從而發生質壁分離。當細胞在一定濃度的外液中剛剛發生質壁時，細胞的壓力勢等于零。此時，細胞的滲透勢等于細胞的水勢。該溶液即稱為細胞或組織的等滲溶液，其濃度稱為等滲濃度。根據Van Hoff公式ΨS=-icRT[ 14 ]，即可計算出植物細胞的滲透勢。

擬南芥在蔗糖溶液濃度為0.35 mol/L時未發生質壁分離現象，在蔗糖溶液濃度為0.40 mol/L時發生質壁分離現象的細胞數超過50%（圖1）。因此取平均值得到擬南芥葉片表皮細胞發生質壁分離現象的等滲濃度為0.375 mol/L。此時室溫為23 ℃。

2. 2 檸條葉片表皮細胞質壁分離現象的顯微鏡觀察

檸條在蔗糖溶液濃度為0.55 mol/L時未發生質壁分離現象，在蔗糖溶液濃度為0.60 mol/L時發生質壁分離現象的細胞數超過50%（圖2）。因此取平均值得到擬南芥葉片表皮細胞發生質壁分離現象的等滲濃度為0.575 mol/L，此時室溫為23 ℃。

圖2 檸條葉片表皮細胞質壁分離現象

注：A：0.55 mol/L蔗糖溶液下細胞未發生質壁分離；B：0.60 mol/L蔗糖溶液下細胞發生質壁分離

2. 3 落葉松葉片表皮細胞質壁分離現象的顯微鏡觀察

落葉松在蔗糖溶液濃度為0.80 mol/L時未發生質壁分離現象，在蔗糖溶液濃度為0.85 mol/L時發生質壁分離現象的細胞數超過50%（圖3）。因此取平均值得到擬南芥葉片表皮細胞發生質壁分離現象的等滲濃度為0.825 mol/L，此時室溫為23 ℃。

圖3 落葉松葉片表皮細胞質壁分離現象

注：A：0.80 mol/L蔗糖溶液下細胞未發生質壁分離；B：0.85 mol/L蔗糖溶液下細胞發生質壁分離

2.4 細胞滲透勢（ΨS）的計算

擬南芥葉片表皮細胞發生質壁分離現象的等滲濃度為0.375 mol/L，室溫為23 ℃，將其帶入Van Hoff公式ΨS= -icRT得到擬南芥細胞滲透勢為-921.3 kPa。

檸條葉片表皮細胞發生質壁分離現象的等滲濃度為0.575 mol/L，室溫為23 ℃，將其帶入Van Hoff公式ΨS= -icRT得到擬南芥細胞滲透勢為-1 412.66 kPa。

落葉松葉片表皮細胞發生質壁分離現象的等滲濃度為0.825 mol/L，室溫為23 ℃，將其帶入Van Hoff公式ΨS= -icRT得到擬南芥細胞滲透勢為-2 026.86 kPa。

3 結論與討論

植物具有固著附生的特性，因此周圍持續變化的多種環境條件極易形成脅迫環境，影響植物的生長發育甚至造成植物死亡。例如，病原體感染、食草動物的啃食等生物脅迫，以及干旱、高溫、冷、營養匱乏、鹽堿、有毒金屬等非生物脅迫都對植物的生長、發育有著重要影響。土壤中的高濃度鹽分會對植物形成脅迫環境，會降低植物根部細胞的水勢，破壞根部細胞內的離子平衡，進而導致植物根部無法正常吸收水分，引起植物體內的離子穩態失衡，從而影響植株對其他離子的吸收以及植株的正常生長。滲透脅迫是指由于環境因素的變化使植物得不到充足水分的一種狀況。植物體內的滲透壓低于環境滲透壓（如土壤溶液），植物體不能吸水甚至失水，最終可導致死亡。常見的滲透脅迫因素有干旱、鹽害及凍害等。在脅迫環境下，植物通過調節細胞的滲透勢來控制水分流失，從而維持細胞膨脹[ 1 ]，進而來維持植物的正常生理生命活動，如細胞的正常生長、氣孔開放以及光合作用等生理過程。

生物膜結構與功能的適應、細胞質膜透性的變化、滲透調節作用、氣孔調節作用、逆境誘導蛋白及基因表達、激素調節、過氧化作用等生理機制是植物抵抗脅迫環境的主要途徑。目前，滲透調節是國內外抗性生理研究的熱點問題。植物往往通過滲透調節這一主動調節方式，適應干旱脅迫、鹽脅迫[ 6 ]、水分脅迫等影響植物生長發育的逆境。滲透調節是植物在干旱[ 7 ]、澇或鹽漬等脅迫條件下，通過代謝活動增加細胞內溶質的濃度，降低滲透勢（即水勢），并從細胞外的介質中吸收水分，從而維持正常的生理代謝過程[ 2 ]，如細胞生長、氣孔開放和光合作用等，并保持較正常的生理代謝活動。在逆境條件下，滲透調節物質的積累對植物細胞維持正常細胞膨壓、調節細胞內溶質的濃度、促進光合作用等都有重要作用。因此滲透調節對植物的正常生理代謝活動與生長發育都有著重要作用。這有利于葉肉細胞間隙保持較高水平的CO2含量，從而避免或減少其細胞內的光合器官受到光抑制作用的影響。

在植物細胞外液的濃度產生變化時，其細胞內溶質濃度改變，從而其滲透壓也會發生相應的變化。當植物葉片表皮細胞內溶液濃度小于細胞外溶液濃度時，細胞內滲透壓降低，細胞失水皺縮，發生質壁分離現象。當植物葉片表皮細胞內溶液濃度大于細胞外溶液濃度時，細胞內滲透壓增高，細胞吸水膨脹，質壁分離復原。在等滲條件下，細胞內外溶液濃度相等，此時植物用于滲透調節機制的能量最少。在能量消耗最少的狀態下，植物的組織培養與生長發育效率更高。對于植物細胞等滲點的確定，在一定程度上可以減少植物的能量消耗，增快植物的培養效率。本研究對植物在脅迫環境下的滲透調節機制進行了研究與分析，并通過質壁分離法確定了擬南芥、檸條、落葉松的葉片表皮細胞等滲點。通過上述研究，得到如下結論：擬南芥葉片表皮細胞滲透勢為-921.3 kPa；檸條葉片表皮細胞滲透勢為-1 412.66 kPa；落葉松葉片表皮細胞滲透勢為-2 026.86 kPa。

干旱、鹽脅迫及低溫等非生物逆境導致滲透脅迫造成作物生產的損失，對糧食安全有重要影響。眾所周知，干旱、鹽堿、高/低溫脅迫是影響全球植物地理分布、限制農作物產量、制約經濟發展，甚至威脅糧食安全的主要環境因子。近年來，伴隨極端天氣的頻繁出現，非生物脅迫對農作物產量以及農業發展的不利影響愈發嚴重。干旱是制約生態環境、地區經濟發展、人類生存和植物分布的一個常見的主要因素。在全球范圍內，干旱和半干旱地區約占土地面積的35%[ 1 ]，且這種趨勢每年都在增加。此外，干旱是造成作物減產的主要原因，且干旱造成的作物減產程度甚至高于其他環境因素造成的作物減產總和[ 1 ]。對于植物如何識別、響應脅迫環境這一科學問題的研究也是近年來廣受科學家們關注的科學問題。植物因其固著生長的特性而難以躲避所受到的滲透脅迫，被迫進化出感知和適應逆境的機制，主要包括信號接收與傳導、植物激素脫落酸（abscisic acid， ABA）相關調控和后期應答等過程[ 15 - 16 ]。此外，植物在脅迫環境下需要消耗比正常環境下更多的水分和營養物質來抵抗不利于生存的環境，這一問題在農業生產中尤為重要。內蒙古地區位于中國北部邊疆，其西部地區具有生態環境較為脆弱、自然災害較為頻繁、土地問題如干旱和鹽堿化等較為嚴重的特點。基于內蒙古地區的土地特點，對植物適應逆境脅迫的滲透調節作用的研究，可以為提高植物抗旱性、提高植物存活率、選育抗旱優良品種提供理論指導。并且，通過提高植物抗逆性應對脅迫環境來降低農業生產中對肥料的需求、節約水資源，進而促進農業生產與生態環境的可持續發展有著重要意義。本研究通過對植物葉片表皮細胞在梯度濃度蔗糖溶液中質壁分離現象的觀察，對植物細胞滲透調節機制有了進一步的了解。同時，對擬南芥、檸條、落葉松的葉片表皮細胞等滲點的確定，有利于提高植物培養效率，為提高植物育種、培育效率提供理論指導。

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