右歸丸輔助骨髓間充質干細胞對家兔骨質疏松性骨折愈合的影響及機制初探

朱俊 姚帥輝 郭小磊

鄭州人民醫院骨一科，鄭州 450003

隨著人口老齡化，骨質疏松性骨折的患病率預計將大幅增加。骨重塑過程是成骨細胞形成新骨與破骨細胞吸收骨基質之間的生理平衡［1］。骨愈合過程是一個復雜的生理過程，涉及骨組織再生和骨重塑。影響骨折愈合和重塑的因素有多種，如患有骨質疏松癥的老年患者、絕經后激素水平發生變化、成骨細胞增殖減少；這使骨折后骨的愈合過程更加困難和緩慢，導致復雜的臨床問題，如骨折延遲愈合、骨折不愈合，甚至術后骨折。骨折修復是一個極其復雜的生理過程，涉及多種細胞，包括骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）、骨祖細胞、成骨細胞（源自骨折的關鍵功能細胞）和破骨細胞。BMMSCs 負責成人骨骼的新陳代謝和骨折愈合。BMMSCs 是首先在骨髓中發現的具有多向分化潛能的干細胞，可在體外分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和成肌細胞等功能細胞［2］。骨折后，BMMSCs 可快速遷移至骨折部位，然后開始增殖和成骨分化［3-4］。BMMSCs的成骨分化受到多種激素和局部因素的調節；因此，刺激其成骨分化被認為是加速骨折愈合的重要機制。中醫理論認為，脾腎虧虛是骨質疏松性骨折的重要原因；也就是說，筋膜和骨骼營養的喪失是腎虛的主要發病機制［5-6］。此外，在“腎主骨”的理論下，可以通過右歸丸來治療；右歸丸在促進骨形成、抑制骨吸收、調節骨重塑平衡、促進性激素分泌、抑制氧化應激、調節鈣磷代謝等方面發揮著重要作用［7-8］。Janus 蛋白酪氨酸激酶2/信號轉導和轉錄激活子3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）信號通路在細胞增殖和分化等多個過程中發揮著至關重要的作用。JAK2/STAT3 信號通路可以調節成骨細胞和骨組織再生的功能并促進血管生成，同時調節前破骨細胞的分化和遷移［9-10］。2023 年1 月至6 月，本研究探討JAK2/STAT3 信號通路在右歸丸輔助BMMSCs 對家兔骨質疏松性骨折愈合的作用及其對骨折修復的影響，為骨質疏松性骨折修復的相關研究提供理論依據，并為臨床提供潛在的治療方案。

資料與方法

1.主要試劑與儀器

右歸丸（北京同仁堂），賽拉嗪、氯胺酮（北京碧云天生物科技），磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM 培養基（美國sigma 生物科技），多聚甲醛、乙二胺四乙酸（EDTA）、二甲苯、蘇木精-曙紅（HE）溶液（中國Solarbio Science Technology），TRIzol?試劑（Invitrogen；美國Thermo Fisher Scientific），TIANGEN 試劑盒（中國Tiangen Biotech），SYBR-Green 試劑（德國Lifeint），二辛可寧酸蛋白測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠、聚偏氟乙烯膜（美國EMD Millipore），JAK2、STAT3、甘 油 醛-3-磷 酸 脫 氫 酶（GAPDH）一抗（美國信號通訊科技），辣根過氧化物酶標記的二抗（美國賽默飛世），電化學發光試劑（中國碧云天生物科技）。

Dexa 雙能X 線吸收骨密度儀（德國Lunar DPXIQ），Inveon PET-SPECT.CT 儀掃描（德國西門子），Endura TELELF 3200 機械測試儀（美國Bose Corporation），DP73 顯微鏡（日本奧林巴斯），Mx3000P 快速實時聚合酶鏈式反應系統（德國Agilent Technologies，Inc）。

2.動物

鄭州大學實驗動物中心購買家兔50 只，雌雄各半［質量證明：SCXK（豫）2020-0008］。所有家兔喂食標準飼料，自由飲水，并保持在適當的溫度（25±1）°C 下，濕度為70%，并進行12 h 的明暗循環。本研究符合《實驗動物的護理和使用指南》，經鄭州人民醫院動物實驗倫理委員會批準。

3.模型制備及骨髓間充質干細胞的分離培養

選取40 只家兔制備骨質疏松性骨折模型。對家兔進行左股骨中段截骨和外固定。使用賽拉嗪（2.5 mg/kg）和氯胺酮（22 mg/kg）進行麻醉并用異氟醚維持。將動物置于右側臥位，左側骨盆和肢體準備手術。在股骨干處做一1 cm長的顱側切口，鈍性解剖分離顱骨股骨肌和腓腸肌，暴露股骨，用微型固定器固定。將股骨外側骨膜縱向切開，用鋸進行橫向截骨，并用無菌生理鹽水持續沖洗。隨后，將4 根直徑為1.6 mm 的針引入股骨干中外側，用2 根近端針和遠端股骨截骨針固定骨折部位。最后，將固定器固定到銷釘中以進行常規肌肉和皮下閉合。術前和術后3 d 皮下注射預防劑量的恩諾沙星（5 mg/kg）。

無菌條件下取出家兔脛骨，用PBS 清洗，鋸掉骨端，用注射器用含10% FBS 和1%雙抗的DMEM 沖洗骨腔。收獲細胞懸液，4 ℃、1 050×g離心5 min，加入適量含10% FBS 和1%雙抗的DMEM 重懸沉淀。計數后，將細胞以1×105個/ml的密度接種到100 mm 培養皿中，并在含有5% CO2的培養箱中37 °C 培養。每隔1 d 更換1 次培養基，直至覆蓋培養皿底部的90%。將所得細胞用PBS 洗滌2 次，用0.25%胰蛋白酶消化并以1∶3密度傳代培養。

4.動物分組與給藥方法

將成功建模的家兔隨機分為模型對照組、右歸丸組、骨髓間充質干細胞組、聯合治療組，每組10 只。右歸丸組灌胃給藥劑量為3.2 g/（kg·d），灌胃體積為10 ml/kg（每天1 次）。骨髓間充質干細胞組尾靜脈注射1×106個/ml BMMSCs 液3 ml（每周1 次）。聯合治療組右歸丸灌胃，給藥劑量為3.2 g/（kg·d），灌胃體積為10 ml/kg（每天1 次）；尾靜脈注射1×106個/ml BMMSCs 液3 ml（每周1 次）。上述各組均持續給予16周。另取10只家兔為正常對照組，正常對照組和模型對照組均給予等體積生理鹽水灌胃。

5.觀察指標及檢測方法

16周后處死家兔，同時分離雙側后肢股骨組織，冷凍于液氮中，用于病理學檢測及JAK2、STAT3 基因及蛋白的檢測。

5.1.家兔股骨骨密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁數量、骨小梁厚度、骨小梁分散度測定 通過雙能X 線吸收骨密度儀（Dexa）測股骨的BMD。Micro-CT 分析骨小梁數量、骨小梁厚度、骨小梁分散度；將大鼠股骨置于70%乙醇中，西門子Inveon PET-SPECT.CT 儀掃描遠端股骨松質骨，能量設置為500 mA 和80 kV，分析骨小梁數量、骨小梁厚度、骨小梁分散度。

5.2.家兔股骨生物力學性能指標測定 使用Endura TELELF 3200 機械測試儀將垂直載荷施加到股骨的左中軸和左股骨頭的頂部。將機械負荷速度保持在5 mm/min 的恒定位移速度下，直到股骨中軸和股骨頸均斷裂為止。記錄斷裂負荷。指標包括彈性模量、剛度、最大應力、最大承載力。

5.3.組織形態觀察 將股骨近端樣品在4%多聚甲醛中固定48 h，并用EDTA 脫鈣30 d，然后將樣品包埋在石蠟中。將石蠟塊切成5 mm 厚的切片，并進行組織學檢查。在二甲苯中脫蠟并在一系列乙醇中水合后，用HE溶液對股骨組織切片進行染色，并在光學顯微鏡下觀察。

5.4.家兔股骨組織JAK2、STAT3 基因水平檢測 股骨組織在液氮中研磨成粉末，使用TRIzol?試劑提取總RNA。根據制造商的方案，使用TIANGEN 試劑盒將10 μl 總RNA提取物制得cDNA 模板。使用SYBR-Green 試劑（Lifeint）在Mx3000P 快速實時聚合酶鏈式反應系統上進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應。使用的熱循環條件：95 °C，3 min；95 °C 12 s；62 °C 40 s 的40 個循環。使用的引物序列：JAK2 正向 5’-UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’，反 向 5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’ ； STAT3 正 向 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’ ， 反 向 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；GAPDH 正 向 5’-TCGAGCGGACGCGTAGCTAGCTGCTA-3’，反 向 5’-TGGTCGTAGCTAGCTAGCTAGCTGATC-3’。 以GAPDH作為內部參照，并采用2-ΔΔCt方法根據以下公式計算目標基因的相對表達：ΔΔCt=［Ct（目標基因）-Ct（參考基因）］實驗組-［Ct（靶基因）-Ct（參考基因）］為正常對照組。實驗重復3次。

5.5.家兔股骨組織JAK2、STAT3 蛋白水平檢測 家兔股骨組織預先通過液氮碾磨成粉末，加入適量含蛋白酶抑制劑的組織裂解緩沖液，4 ℃裂解過夜，4 ℃、11 500 g 離心10 min 以提取總蛋白，通過二辛可寧酸蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，并通過8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉移到聚偏氟乙烯膜（EMD Millipore），使用5%脫脂奶粉和0.1% Tween-20將膜密封在Tris緩沖鹽水中，輕輕搖動，并與JAK2、STAT3 和GAPDH 一抗在4 °C 下反應過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗進行孵育，用電化學發光試劑處理蛋白質，曝光并檢測，使用Image-J 軟件對所有數據進行分析和量化，GAPDH用作加載控件。

6.統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件（IBM 公司）對數據進行統計處理，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。P<0.05 表明差異有統計學意義。

結 果

1.各組家兔股骨BMD、骨小梁數量、骨小梁厚度、骨小梁分散度比較

模型對照組家兔股骨BMD、骨小梁數量、骨小梁厚度均低于正常對照組，骨小梁分散度高于正常對照組（均P<0.05）；右歸丸組、骨髓間充質干細胞組、聯合治療組家兔股骨BMD、骨小梁數量、骨小梁厚度高于模型對照組，骨小梁分散度均低于模型對照組（均P<0.05）；聯合治療組股骨BMD、骨小梁數量、骨小梁厚度高于右歸丸組、骨髓間充質干細胞組，骨小梁分散度低于右歸丸組、骨髓間充質干細胞組（均P<0.05）。見表1。

表1 各組家兔股骨BMD、骨小梁數量、骨小梁厚度、骨小梁分散度比較（± s）

表1 各組家兔股骨BMD、骨小梁數量、骨小梁厚度、骨小梁分散度比較（± s）

注：正常對照組未做任何干預；模型對照組構建骨質疏松性骨折模型；正常對照組和模型對照組均給予等體積生理鹽水灌胃；右歸丸組構建骨質疏松性骨折模型+右歸丸灌胃；骨髓間充質干細胞組構建骨質疏松性骨折模型+注射骨髓間充質干細胞；聯合治療組構建骨質疏松性骨折模型+右歸丸灌胃和注射骨髓間充質干細胞。BMD 為骨密度。與正常對照組比較，aP<0.05；與模型對照組比較，bP<0.05；與右歸丸組比較，cP<0.05；與骨髓間充質干細胞組比較，dP<0.05

n組別正常對照組模型對照組右歸丸組骨髓間充質干細胞組聯合治療組10 10 10 10 10 BMD（g/cm3）2.06±0.18 1.10±0.13a 1.41±0.15b 1.47±0.14b 1.76±0.13bcd骨小梁分散度（mm）0.20±0.02 0.68±0.01a 0.42±0.03b 0.43±0.03b 0.34±0.02bcd骨小梁數量（個/mm）6.65±0.25 2.36±0.24a 3.88±0.28b 3.89±0.28b 5.87±0.24bcd骨小梁厚度（mm）0.19±0.02 0.05±0.01a 0.10±0.02b 0.09±0.03b 0.14±0.03bcd

2.各組家兔股骨股骨micro-CT掃描結果的影響

正常對照組股骨骨小梁結構正常，密度較大，可見相互連接的網狀結構；模型組股骨骨小梁結構異常疏松，數量明顯減少，且骨小梁網狀結構減少，相互獨立；經過右歸丸、BMMSCs 以及聯合治療干預后，股骨骨小梁結構趨于正常，密度增加，網狀結構也增加，且聯合治療效果均優于右歸丸、BMMSCs單獨治療效果。見圖1。

3.各組家兔股骨生物力學性能指標比較

模型對照組家兔股骨彈性模量、剛度、最大應力、最大承載力均低于正常對照組（均P<0.05）；右歸丸組、骨髓間充質干細胞組、聯合治療組家兔股骨彈性模量、剛度、最大應力、最大承載力均高于模型對照組（均P<0.05）；聯合治療組家兔股骨彈性模量、剛度、最大應力、最大承載力均高于右歸丸組、骨髓間充質干細胞組（均P<0.05）。見表2。

表2 各組家兔股骨骨生物力學性能指標比較（± s）

表2 各組家兔股骨骨生物力學性能指標比較（± s）

注：正常對照組未做任何干預；模型對照組構建骨質疏松性骨折模型；正常對照組和模型對照組均給予等體積生理鹽水灌胃；右歸丸組構建骨質疏松性骨折模型+右歸丸灌胃；骨髓間充質干細胞組構建骨質疏松性骨折模型+注射骨髓間充質干細胞；聯合治療組構建骨質疏松性骨折模型+右歸丸灌胃和注射骨髓間充質干細胞。與正常對照組比較，aP<0.05；與模型對照組比較，bP<0.05；與右歸丸組比較，cP<0.05；與骨髓間充質干細胞組比較，dP<0.05

彈性模量（MPa）395.96±17.52 204.35±18.65a 304.62±20.41b 299.54±16.94b 343.27±21.04bcd組別正常對照組模型對照組右歸丸組骨髓間充質干細胞組聯合治療組n 10 10 10 10 10剛度（N/mm）1 237.71±63.22 478.24±70.35a 698.52±69.55b 720.33±69.48b 904.25±73.25bcd最大應力（N/mm2）42.25±3.74 19.11±3.25a 25.34±3.22b 23.24±3.13b 32.63±3.17bcd最大承載力（N）428.99±10.76 201.85±13.58a 297.34±13.24b 289.38±13.13b 358.85±13.02bcd

4.各組家兔股骨病理形態學結果比較

正常對照組家兔股骨結構正常；模型組股骨小梁稀疏，可見空洞結構；經右歸丸、骨髓間充質干細胞聯合治療后，骨小梁密度增加，空骨腔減少；聯合治療效果均優于右歸丸、骨髓間充質干細胞單獨治療效果。見圖2。

圖2 各組家兔右側股骨組織形態比較（HE染色 ×200）。A：正常對照組；B：模型對照組；C：右歸丸組；D：骨髓間充質干細胞組；E：聯合治療組

5.各組家兔股骨組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA 水平比較

模型對照組家兔股骨JAK2 mRNA、STAT3 mRNA 水平均低于正常對照組（均P<0.05）；右歸丸組、骨髓間充質干細胞組、聯合治療組家兔股骨JAK2 mRNA、STAT3 mRNA水平均高于模型對照組（均P<0.05）；聯合治療組家兔股骨JAK2 mRNA、STAT3 mRNA 水平均高于右歸丸組、骨髓間充質干細胞組（均P<0.05）。見表3。

表3 各組家兔股骨組織JAK2、STAT3 mRNA水平比較

6.各組家兔股骨組織JAK2蛋白、STAT3蛋白水平比較

模型對照組家兔股骨JAK2 蛋白、STAT3 蛋白水平均低于正常對照組（均P<0.05）；右歸丸組、骨髓間充質干細胞組、聯合治療組家兔股骨JAK2 蛋白、STAT3 蛋白水平均高于模型對照組（均P<0.05）；聯合治療組家兔股骨JAK2 蛋白、STAT3 蛋白水平均高于右歸丸組、骨髓間充質干細胞組（均P<0.05）。見表4、圖3。

圖3 各組家兔股骨組織JAK2、STAT3 蛋白表達的印跡圖。A：正常對照組；B：模型對照組；C：右歸丸組；D：骨髓間充質干細胞組；E：聯合治療組

表4 各組家兔股骨組織JAK2、STAT3蛋白水平比較

討 論

骨質疏松性骨折愈合是骨骼局部修復的復雜生理過程；這一過程涉及成骨細胞和破骨細胞等直接參與骨重塑和骨吸收的細胞；愈合早期產生的大量成骨細胞對于骨質疏松性骨折的修復至關重要。相關研究證實，骨質疏松性骨折后，BMMSCs 遷移至骨折部位增殖并分化為成骨細胞［11］。成熟的成骨細胞分泌一種稱為類骨質的基質物質，然后嵌入類骨質中并分化為骨細胞，然后鈣化形成骨基質。最終，骨折的愈合以骨組織的形成而告終。BMMSCs 在骨質疏松性骨折的整個修復過程中發揮著重要的作用。BMMSCs 已應用于骨折的治療，例如骨不連。移植培養擴增的BMMSCs可以增強局部修復。

中醫雖無骨質疏松癥之名，但從其臨床表現和發病機制來看，屬于骨枯范疇。《素問》認為骨枯的基本病理是骨枯骨髓減少。具體來說，骨枯病相當于骨組織微結構的退化和改變，表現為骨小梁變薄、斷裂，從而改變了骨組織的正常負荷功能，增加了骨的脆性；骨髓減少對應的是骨量減少，包括骨基質和骨礦物質等比例地減少。由于骨萎的內容與骨質疏松的病機和臨床表現相同，因此將骨萎作為骨質疏松的中醫臨床診斷［12］。中醫理論認為，腎藏精、主骨、生髓，為先天之本，說明腎與精骨、髓之間存在著內在的生理關系，形成腎學說［13］。中醫理論認為，骨質疏松的發病機制與衰老、先天遺傳、勞累損傷、飲食習慣、機械應激等因素導致的腎虛有關。右歸丸的用途很多，如補腎強骨、修復損傷、止痛等，其通過調節多種信號通路來控制骨質疏松，具有增加骨生成、穩定骨結構、增強成骨細胞增殖和分化、抑制破骨細胞的作用［14］。此外，右歸丸能增加人體對鈣的吸收，促進鈣轉運入骨，強化骨礦化，維持骨重塑的平衡；調節下丘腦-垂體-性腺軸的代謝水平、改善內分泌功能、抑制骨代謝中炎癥因子的合成和分泌具有潛在的抗骨質疏松作用。研究表明，右歸丸與CaCO3聯合使用對雌激素缺乏引起的骨質流失有預防作用；右歸丸可以增加骨含量，降低RANK 和RANKL 含量，改善卵巢摘除模型大鼠骨丟失，促進卵巢摘除模型大鼠骨折骨小梁的修復［15］。

本研究結果顯示，右歸丸組、骨髓間充質干細胞組、聯合治療組家兔股骨BMD、骨小梁數量、骨小梁厚度、彈性模量、剛度、最大應力、最大承載力均高于模型對照組（均P<0.05），骨小梁分散度低于模型對照組（P<0.05）；聯合治療組股骨BMD、骨小梁數量、骨小梁厚度、彈性模量、剛度、最大應力、最大承載力均高于右歸丸組、骨髓間充質干細胞組（均P<0.05），骨小梁分散度低于右歸丸組、骨髓間充質干細胞組（均P<0.05）；經過右歸丸聯合BMMSCs 治療后，股骨骨小梁結構趨于正常，密度增加，網狀結構也增加。這說明，右歸丸輔助BMMSCs 能明顯促進家兔骨質疏松性骨折愈合。

成骨細胞和破骨細胞在骨發育和修復過程中受到多種局部因素的調節，包括骨微環境中的細胞因子和多種細胞因子信號通路，例如JAK/STAT 信號通路。JAK/STAT 信號通路最初被確定為主要響應干擾素γ 和白細胞介素6 家族成員受體激活的通路。JAK 家族成員包括JAK1、JAK2、JAK3 和Tyk2；細胞質轉錄因子STAT 的磷酸化是由細胞因子通過JAK2/STAT2 信號通路與細胞表面的受體結合而觸發的。JAK2/STAT2 信號通路在各類細胞的生長和分化中發揮著關鍵作用。許多激活該通路的細胞因子可影響成骨細胞和破骨細胞的增殖和分化，體外激活JAK2/STAT2信號通路可以增強堿性磷酸酶活性并增加骨鈣素表達，表明其可以促進成骨細胞的分化［16-17］。一項體外研究通過JAK 抑制劑抑制BMMSCs 中JAK2 的表達，發現BMMSCs 的增殖和遷移能力減弱，提示JAK2/STAT3 信號通路對BMMSCs 有一定的影響［18］。STAT3 可以促進增殖并增強抗炎活性，而JAK 抑制劑抑制JAK2 的表達并減弱STAT3 的活性，從而導致細胞增殖能力下降［19］。本研究結果顯示：模型對照組家兔股骨JAK2 mRNA 和蛋白、STAT3 mRNA 和蛋白水平均低于正常對照組（均P<0.05）；右歸丸組、骨髓間充質干細胞組、聯合治療組家兔股骨JAK2 mRNA和蛋白、STAT3 mRNA和蛋白水平均高于模型對照組（均P<0.05）；聯合治療組家兔股骨JAK2 mRNA 和蛋白、STAT3 mRNA 和蛋白水平均高于右歸丸組、骨髓間充質干細胞組（均P<0.05）。這說明，右歸丸輔助BMMSCs 能明顯促進骨質疏松性骨折家兔股骨高表達JAK2、STAT3，進而激活JAK2/STAT3 信號通路。這也是右歸丸輔助BMMSCs 能明顯促進家兔骨質疏松性骨折愈合的機制之一。

綜上所述，右歸丸輔助BMMSCs 能明顯促進家兔骨質疏松性骨折愈合［20］，其機制可能與右歸丸輔助BMMSCs 治療能激活骨質疏松性骨折家兔股骨JAK2/STAT3 信號通路有關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明朱俊：醞釀和設計實驗，實施研究，采集數據，分析/解釋數據，起草文章，對文章的知識性內容作批性審閱，統計分析，獲取研究經費，行政、技術或材料支持，指導，支持性貢獻；姚帥輝：醞釀和設計實驗，實施研究，采集數據，分析/解釋數據，起草文章，對文章的知識性內容作批性審閱，統計分析，獲取研究經費；郭小磊：實施研究，采集數據，分析/解釋數據，統計分析，行政、技術或材料支持