脆肉鯇器官組織膠原纖維染色觀察

張瑋嵐，杜瑞雪，葉元土，肖旭全

（1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.江蘇省水產(chǎn)動物與營養(yǎng)重點實驗室，江蘇 蘇州 215123）

飼喂蠶豆（Vicia faba）可使草魚（Ctenopharyngodon idellus）肉質(zhì)變爽脆、緊實、有型而不易煮爛的獨特養(yǎng)殖方式備受推廣及關(guān)注。這種養(yǎng)殖類型的草魚外形與普通草魚差異不顯著，但肉質(zhì)已發(fā)生顯著變化，廣東稱之為“脆肉鯇”[1]。廣東省中山市東升鎮(zhèn)已成為全國脆肉鯇之鄉(xiāng)。脆肉鯇獨特的口味，營養(yǎng)價值高，深受大眾青睞。相關(guān)研究主要集中在探討脆肉鯇肌肉質(zhì)構(gòu)特性、肌肉營養(yǎng)成分、血液生化指標等，關(guān)于蠶豆如何引起草魚肌肉脆化的機理也有報道和不同的探討。有研究認為，肌肉的脆化和嫩度與肌肉結(jié)締組織中膠原蛋白的含量有一定的相關(guān)性[2,3]；劉邦輝等[4]研究發(fā)現(xiàn)，脆化后的草魚肌肉的膠原蛋白含量會有所增加；冷向軍等[5]研究了蠶豆對草魚生長和肉質(zhì)的影響，表明膠原蛋白含量與肌肉耐折力存在相關(guān)性。

石蠟切片技術(shù)中常用的蘇木精伊紅（HE）染色難用不同顏色將膠原纖維和肌纖維區(qū)分開，但Masson 染色法可實現(xiàn)[6]。根據(jù)器官組織的滲透性不同，選擇分子大小不同的陰離子染料染色。分子量小的陰離子染料易穿透紅細胞等結(jié)構(gòu)致密、滲透性低的組織；分子量大的陰離子染料只能進入膠原纖維等結(jié)構(gòu)疏松、滲透性高的組織。最終把膠原纖維染成藍色，把肌纖維染成紅色。再結(jié)合Imaje J 圖像處理軟件分析Masson 染色圖片，計算出膠原纖維容積分數(shù)（Collagen volume fraction,CVF），即在同一視野中，染成藍色的膠原纖維面積與組織總面積的比值，了解膠原纖維在組織中的沉積情況[7]。投喂蠶豆是普通草魚變化到脆肉鯇的主要條件，但蠶豆脆化的形成機理仍沒有定論。脆肉鯇的器官組織、尤其是肌肉組織的結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化。脆肉鯇肌肉組織中膠原纖維數(shù)量和分布及結(jié)締組織結(jié)構(gòu)的改變是否是“脆化”形成的主要原因？同時，肌細胞結(jié)構(gòu)也會發(fā)生一定的變化，但是肌細胞類型是否發(fā)生改變呢？基于此，本試驗通過Masson 染色方法，研究脆肉鯇器官組織中膠原纖維的數(shù)量和分布情況，以期為草魚肌肉脆化是否是蠶豆誘導(dǎo)肌肉和其他器官組織中膠原纖維顯著增加的分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用脆肉鯇體質(zhì)量7.0 kg，普通草魚體質(zhì)量4.5 kg 取自廣東省中山市東升鎮(zhèn)。將活魚解剖，取1.5 cm3的背肌（背鰭下部、側(cè)線上部）及腹肌（背肌對應(yīng)魚體位置的腹部）肌肉樣品，隨后取心臟、肝胰臟、脾臟、前腸、中腸及后腸，用PBS 緩沖液沖洗，吸干表面后置于4%甲醛溶液中固定，用于切片；然后再取背肌測定質(zhì)構(gòu)特性。

1.2 方法

將染色后的切片置于（100×、400×）倍數(shù)的光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。采用Imaje J 圖像處理軟件對各組織器官的膠原纖維進行定位，并隨機對3 幅圖像的膠原纖維面積進行測量，取3 幅圖像均值計算出膠原纖維面積與視野總面積的比值，即為膠原纖維容積分數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果用平均值±標準差（Mean±SD）表示，采用Microsoft Excel 2010 軟件和SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)整理和獨立T 檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通草魚和脆肉鯇背部肌肉組織顯微結(jié)構(gòu)觀察和膠原纖維容積分數(shù)差異

普通草魚和脆肉鯇肌肉經(jīng)過Masson 染色后，膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色；相同倍數(shù)下，背肌橫切中可見肌纖維聚集成束，周圍包裹大量疏松結(jié)締組織，為不規(guī)則圓形（圖1-A、1-B）。橫切中可看出，膠原纖維主要在肌束膜中形成沉積。相比于普通草魚，脆肉鯇的肌纖維排列雜亂，肌束較粗。在背肌縱切（圖1-C、1-D）中，普通草魚的肌纖維肌束間的間隙較大且寬，而脆肉鯇的肌纖維束排列更緊密。

圖1 普通草魚和脆肉鯇背肌的組織染色（100 ×）Fig.1 Tissue staining of the back muscle of grass carp and crisped grass carp (100 ×)

脆肉鯇背肌的膠原纖維染色比普通草魚深、面積更大（圖1）。脆肉鯇背肌橫切面的膠原纖維容積分數(shù)是普通草魚的1.27 倍，從縱切面測量則是普通草魚的1.13 倍，脆肉鯇背肌的膠原纖維含量比普通草魚高（表1）。

表1 普通草魚和脆肉鯇背肌膠原纖維容積分數(shù)Tab.1 Volume fraction of collagen fiber in the back muscle of grass carp and crisped grass carp

2.2 普通草魚和脆肉鯇腹部肌肉組織顯微結(jié)構(gòu)觀察和膠原纖維容積分數(shù)差異

普通草魚腹肌的橫切面肌纖維直徑更小，肌束分布松散，肌纖維間隙更大；從腹肌縱切面觀察到，普通草魚的肌束排列緊密且整齊，相比之下，脆肉鯇的肌束增粗，肌束間排列稀疏且不整齊（圖2）。

圖2 普通草魚和脆肉鯇腹肌的組織染色（100 ×）Fig.2 Tissue staining of the abdominal muscle of grass carp and crisped grass carp (100 ×)

脆肉鯇腹肌的膠原纖維染色比普通草魚深、面積更大。從表2 可知，脆肉鯇腹肌橫切面的膠原纖維容積分數(shù)是普通草魚的2.09 倍，從縱切面測量則是普通草魚的1.11 倍，脆肉鯇腹肌的膠原纖維含量比普通草魚豐富。

表2 普通草魚和脆肉鯇腹肌膠原纖維容積分數(shù)Tab.2 Collagen fiber volume fraction of abdominal muscle of grass carp and crisped grass carp

2.3 普通草魚和脆肉鯇肝胰臟、脾臟、心臟組織顯微結(jié)構(gòu)觀察和膠原纖維容積分數(shù)差異

普通草魚（圖3-I）和脆肉鯇（圖3-J）的肝細胞形態(tài)清晰，近似卵圓形，且細胞邊界明顯，細胞核單個、居中，呈圓形，肝細胞索不明顯。相同倍數(shù)下，相比于普通草魚，脆肉鯇的門管區(qū)動脈、靜脈管壁間隙中有大量被染為藍色的膠原纖維，竇周隙中散布膠原纖維，部分肝星狀細胞中有膠原纖維。由表3可知，脆肉鯇肝胰臟的膠原纖維容積分數(shù)是普通草魚的1.41 倍。脾臟實質(zhì)由紅髓和白髓構(gòu)成，二者混合分布，分界不明顯。白髓由較為密集的淋巴細胞及少量的吞噬細胞組成。普通草魚脾臟組織切片中血竇較多，由大量血細胞聚集而成，形態(tài)不規(guī)則，且周圍含Masson 染色染為藍色的膠原纖維（圖3-K）。在脆肉鯇脾臟組織切片中可見少量聚集成團的吞噬細胞被染為深藍色，細胞質(zhì)內(nèi)有大量染為紫紅色的顆粒。紅髓區(qū)域由脾索和脾竇構(gòu)成（圖3-L）。脾索在切面上呈索條狀，內(nèi)含有大量被染成藍色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膠原纖維，而脾竇位于脾索之間，脾竇竇腔中含有大量被染為紅色的紅細胞。

表3 普通草魚和脆肉鯇膠原纖維容積分數(shù)Tab.3 Volume fraction of collagen fiber of grass carp and crisped grass carp

圖3 普通草魚和脆肉鯇肝胰臟、脾臟、心臟的組織染色（100 ×）Fig.3 Tissue staining of hepatopancreas,spleen and heart of grass carp and crisped grass carp（100 ×）

脆肉鯇脾臟的膠原纖維容積分數(shù)是普通草魚的1.89 倍，遠高于普通草魚（表3）。心肌纖維呈螺旋狀排列，可同時觀察到心肌的橫切和縱切面（圖3）。從圖3-M和圖3-N 中均可看到各心肌纖維間由結(jié)締組織相連，結(jié)締組織內(nèi)含有膠原纖維。脆肉鯇心臟的膠原纖維容積分數(shù)是普通草魚的3.75 倍（表3），二者存在差異。

2.4 普通草魚和脆肉鯇腸道組織顯微結(jié)構(gòu)觀察和膠原纖維容積分數(shù)差異

由圖4 可以清楚觀察到普通草魚和脆肉鯇腸道平滑肌的肌纖維和肌間結(jié)締組織分布，前、中及后腸的平滑細胞間含有大量被染為藍色的膠原纖維。相同比例視野內(nèi)，普通草魚前腸（圖4-O）的平滑肌細胞與結(jié)締組織染色分明，脆肉鯇前腸（圖4-P）的平滑肌細胞間含有大量錯綜排列形成致密的束狀結(jié)構(gòu)的膠原纖維。普通草魚中腸（圖4-Q）平滑肌細胞間隙的膠原纖維分布為疏松的束狀結(jié)構(gòu)，排列不緊密，而脆肉鯇中腸（圖4-R）的膠原纖維在平滑肌的內(nèi)環(huán)行及外縱行間分布均勻。普通草魚后腸（圖4-S）的膠原纖維明顯較少，平滑肌細胞間隙較大，外縱行間及內(nèi)環(huán)行間僅較少膠原纖維，而脆肉鯇后腸（圖4-T）的平滑肌細胞間膠原纖維分布分層，且膠原纖維的分布在外縱行間明顯比內(nèi)環(huán)行間多。

圖4 普通草魚和脆肉鯇前腸、中腸、后腸的組織染色（400 ×）Fig.4 Tissue staining of foregut,midgut and hindgut of common grass carp and crisped grass carp（400 ×）

脆肉鯇前、中和后腸的膠原纖維容積分數(shù)分別是普通草魚的2.16 倍、1.68 倍和2.66 倍（表4）。脆肉鯇腸道的膠原纖維含量比普通草魚豐富。

表4 普通草魚和脆肉鯇腸道膠原纖維容積分數(shù)Tab.4 Volume fraction of intestinal collagen fiber of grass carp and crisped grass carp

與普通草魚相比，脆肉鯇腸道組織中膠原纖維數(shù)量和分布密度非常明顯，這是本研究的重要結(jié)果。這是否是草魚攝食蠶豆之后，蠶豆成分在誘導(dǎo)膠原蛋白合成量增加、膠原纖維數(shù)量顯著增加，并誘導(dǎo)疏松結(jié)締組織顯著增加首先從腸道組織開始？還是誘導(dǎo)肌肉組織變性主要位點就是在腸道組織？本文提供了很有意義的觀察結(jié)果，但還需要系統(tǒng)試驗深入研究。

2.5 普通草魚和脆肉鯇肌肉的質(zhì)構(gòu)參數(shù)分析

由表5 可知，普通草魚和脆肉鯇背肌的質(zhì)構(gòu)參數(shù)有所差異（P＜0.05）。脆肉鯇的硬度和咀嚼性分別比普通草魚高24.63%和22.11%，差異顯著（P＜0.05）。彈性變化不顯著（P＞0.05）。

表5 普通草魚和脆肉鯇肌肉的質(zhì)構(gòu)參數(shù)分析Tab.5 Analysis of muscle texture parameters of grass carp and crisped grass carp

3 討論

3.1 脆肉鯇肌肉組織顯微結(jié)構(gòu)觀察

Masson 染色切片對比和測量發(fā)現(xiàn)，脆肉鯇背肌、腹肌的膠原纖維含量比普通草魚的膠原纖維含量要豐富；脆肉鯇背肌橫切面的膠原纖維容積分數(shù)是普通草魚的1.27 倍；縱切面是普通草魚的1.13倍，脆肉鯇腹肌橫切面的膠原纖維容積分數(shù)是普通草魚的2.09 倍，縱切面是普通草魚的1.11 倍，且膠原纖維大多存在于肌束膜的結(jié)締組織間。脆肉鯇背肌的硬度和咀嚼性顯著高于普通草魚。林婉玲等[8]比較不同肌肉組織的質(zhì)構(gòu)特征時發(fā)現(xiàn)，脆肉鯇腹部肌肉脆度大于背部，提出引起脆肉鯇肉質(zhì)清爽脆口的因素之一可能是肌束間隔膜組織增多，肌隔膜可能有膠原蛋白等結(jié)締組織的成分。朱志偉等[9]也發(fā)現(xiàn)，脆肉鯇的肌肉膠原纖維含量極顯著高于普通草魚肌肉膠原纖維含量。陳度煌[10]在研究質(zhì)構(gòu)特性時發(fā)現(xiàn)，脆肉鯇肌肉硬度、咀嚼性和回復(fù)性比普通草魚分布高15.4%、11.5%和9.76%。張曦等[11]研究發(fā)現(xiàn)，提升草魚肌肉間膠原蛋白含量可以改善草魚質(zhì)構(gòu)性能，增強草魚肌肉品質(zhì)。因此，肌肉中膠原纖維含量的增加可能是脆肉鯇肌肉脆化的因素之一。本試驗結(jié)果顯示，蠶豆誘導(dǎo)“脆肉鯇”的“肌肉脆性”形成，肌肉組織中膠原纖維數(shù)量顯著增加，且分布狀態(tài)發(fā)生顯著變化；肌肉組織中疏松結(jié)締組織增生；但肌細胞類型并未發(fā)生改變。這些結(jié)果對于探討脆肉鯇肌肉脆化機制有重要意義，即飼喂的蠶豆組成物質(zhì)中，含有誘導(dǎo)魚體器官組織膠原蛋白質(zhì)合成量和膠原纖維數(shù)量增加、疏松結(jié)締組織增生的作用機制，可能是誘導(dǎo)肌肉“脆化”的重要作用機制。

3.2 脆肉鯇腸道組織顯微結(jié)構(gòu)觀察

腸道是重要的消化吸收器官，機體的生長發(fā)育與腸道的組織形態(tài)密不可分。投飼蠶豆會抑制脆肉鯇前腸的蛋白酶活性[12]，降低脆肉鯇對飼料的消化利用率，增加了腸道的定向蠕動。魚體腸道肌肉層與腸道節(jié)律性蠕動有關(guān)，肌層厚度增加有利于強化腸道消吸收功能[13]。而膠原纖維是支撐平滑肌結(jié)構(gòu)的重要因素，與肌纖維間緊密連接，促進腸道平滑肌的收縮與蠕動。本試驗結(jié)果顯示，與普通草魚腸道組織相比，脆肉鯇腸道疏松結(jié)締組織顯著改變，膠原纖維數(shù)量顯著增加。腸道組織中，膠原纖維的顯著增加是否是蠶豆成分（具體何種成分目前未知）誘導(dǎo)膠原蛋白合成、膠原纖維數(shù)量顯著增加的首發(fā)位點？這個問題值得深入研究，這也是探討蠶豆成分誘導(dǎo)“脆肉鯇”形成機制的重要內(nèi)容之一。

3.3 結(jié)論

本文利用Masson 染色方法，觀察了普通草魚和脆肉鯇背部、腹部肌肉和心臟、肝胰臟、脾臟、前腸、中腸、后腸組織中膠原纖維數(shù)量和分布狀態(tài)，顯示出脆肉鯇的這些器官組織中膠原纖維數(shù)量較多、分布區(qū)域面積較大，組織中疏松結(jié)締組織有增生的狀態(tài)，尤其是腸道組織、血管壁周圍的分布結(jié)果較為明顯。本試驗中，脆肉鯇背肌橫切面、腹肌橫切面的膠原纖維容積分數(shù)分別是普通草魚的1.27 倍和2.09 倍，從脆肉鯇背肌縱切面、腹肌縱切面測量則是普通草魚的1.13 倍和1.11 倍，脆肉鯇肝胰臟、脾臟、心臟、前腸、中腸及后腸的膠原纖維容積分數(shù)分別是普通草魚的1.41 倍、1.89 倍、3.75 倍、2.16 倍、1.68 倍和2.66 倍。這些結(jié)果提示：草魚肌肉脆化的機制可以更多地從肌肉、腸道等器官組織中膠原蛋白合成機制、膠原纖維數(shù)量變化等深入、系統(tǒng)的研究。