蝦肝腸胞蟲極管蛋白3 的鑒定

于志君，王李寶，史文軍，黎慧，胡潤(rùn)豪，趙然，沈輝，管小平，萬(wàn)夕和

（1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；3.伊犁悅?cè)簧鷳B(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，新疆 伊犁 835300）

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）最早發(fā)現(xiàn)于泰國(guó)養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）中，是寄生在對(duì)蝦肝小管上皮細(xì)胞內(nèi)[1-3]的微孢子蟲。近年來(lái)，EHP 感染南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的報(bào)道越來(lái)越多，可引起南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢，規(guī)格不齊，嚴(yán)重影響南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖效益。微孢子蟲含有一個(gè)由錨定盤、極質(zhì)體和單個(gè)極管組成的獨(dú)特侵染器官——極管[4]，侵染過(guò)程從孢子萌發(fā)開始，然后極管外翻彈出，刺穿宿主細(xì)胞膜，最后將孢原質(zhì)注射到靶細(xì)胞中[5]。極管作為一種獨(dú)特的侵染結(jié)構(gòu)，在EHP 感染宿主的過(guò)程中起到輸送孢原質(zhì)的重要作用。探究極管蛋白的生物學(xué)特性、挖掘潛在的極管蛋白類型對(duì)于分析蝦肝腸胞蟲入侵機(jī)制具有重要意義。1894 年，Thelohan 描述了微孢子蟲極管特點(diǎn)及其釋放過(guò)程[6]。目前已有6 種不同的極管蛋白（PTP1-PTP6）被鑒定為微孢子蟲極管的主要成分[7-11]。克隆和氨基酸分析表明，占極管總蛋白70%的PTP1 具有高強(qiáng)度的張力和彈性，有利于極管的彈出以及孢原質(zhì)的輸送[8,12]。雖然不同種屬微孢子蟲的PTP2 擁有差異較大的氨基酸序列，但它們具有相似的等電點(diǎn)、高含量的賴氨酸和高度保守的半胱氨酸位點(diǎn)[13]。利用免疫篩選技術(shù)從Encephalitozoon cuniculi cDNA 文庫(kù)中鑒定到了第三種極管蛋白（PTP3）。該蛋白可以與前兩種蛋白形成復(fù)合體相互作用。利用蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)篩選鑒定到第四個(gè)極管蛋白-PTP4。在篩選E.cuniculi 基因組序列時(shí)發(fā)現(xiàn)了編碼另外一個(gè)極管蛋白（PTP5）的基因。該基因與編碼PTP4 的基因序列相似，與PTP4 定位于同一個(gè)染色體形成了一個(gè)新的基因簇。最近，LV等[11]又在家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種可與宿主細(xì)胞表面結(jié)合的新的極管蛋白—PTP6。迄今為止，對(duì)于家蠶微孢子蟲極管蛋白的研究已經(jīng)非常成熟，鑒定了6 種極管蛋白。對(duì)于蝦肝腸胞蟲極管蛋白的研究鮮有報(bào)道，只鑒定到了一種極管蛋白-EHPPTP2 的序列。本研究通過(guò)克隆南美白對(duì)蝦蝦肝腸胞蟲極管蛋白3（EHPPTP3）基因，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，通過(guò)原核表達(dá)獲得重組蛋白制備多抗，免疫熒光試驗(yàn)驗(yàn)證了EHPPTP3 的存在，為進(jìn)一步探明極管蛋白在EHP 侵染宿主過(guò)程中的作用機(jī)制提供新的線索和思路，同時(shí)為EHP 的檢測(cè)以及蝦肝腸胞蟲病的預(yù)防和治療提供新的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

EHP-NMB2019011 株（實(shí)驗(yàn)室命名）從江蘇如東患病南美白對(duì)蝦中分離獲得，原核表達(dá)載體選用蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司的pET-28a（+），超敏型辣根過(guò)氧化氫酶DAB 顯色試劑盒和總RNA 快速提取試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司，蛋白質(zhì)Marker 和相關(guān)免疫熒光染料購(gòu)自賽默飛（Thermofisher）公司。其他試劑參照LV 等所用試劑[11-14]。

1.2 總RNA 提取和cDNA 第一鏈合成

使用總RNA 快速提取試劑盒提取樣品總RNA；再使用cDNA 第一鏈合成試劑盒（上海生工）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所制得cDNA 于-20 ℃儲(chǔ)存，為后續(xù)PTP3 基因克隆備用。

1.3 PTP3 基因克隆

1.3.1 PTP3 基因cDNA中間片段克隆及RACE 實(shí)驗(yàn)

以蝦肝腸胞蟲全基因組（GenBank 登錄號(hào)：GCA_023079535.1）[15]中A0755 基因中630～4 000 bp序列為模板，設(shè)計(jì)PTP3 核心序列引物MF/MR（表1）進(jìn)行中間片段克隆。產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，按照孫金秋等（2020）所述方法[16]，設(shè)計(jì)特異性引物用于5’端和3’端的RACE 實(shí)驗(yàn)（表1）。反應(yīng)完成后，進(jìn)行電泳驗(yàn)證，克隆測(cè)序以及序列拼接，獲得PTP3 基因的完整序列。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in the experiment

1.3.2 PTP3 基因核心區(qū)段的克隆及原核表達(dá)

以PTP3 核心序列的部分區(qū)段（909 bp）為模板，使用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)克隆引物（PTP3F/R）構(gòu)建PTP3 原核表達(dá)載體，所得產(chǎn)物于4 ℃保存。然后用BamH I、Xho I 和pET28a 進(jìn)行雙酶切和載體構(gòu)建，并進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆檢測(cè)[17]，送上海生工測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)和不同的軟件（表2）對(duì)EHP PTP3相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行不同層次的生物信息學(xué)分析。

表2 生物信息學(xué)分析軟件Tab.2 Bioinformatics analysis software

1.5 EHP PTP3 基因編碼蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

取重組載體pET28a-PTP3 轉(zhuǎn)化入Rosetta（DE3）感受態(tài)中，結(jié)合李孝良等[18]方法挑取單克隆進(jìn)行后續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)純化。利用LB 培養(yǎng)基和ITPG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)破菌緩沖液和NTA 層析柱進(jìn)行超聲破菌和純化。最后利用凝膠電泳檢測(cè)所收集的不同組別的成分，合并符合目標(biāo)蛋白的成分并進(jìn)行超濾濃縮。

1.6 多克隆抗體制備

純化的原核表達(dá)PTP3 蛋白作為免疫抗原，分裝保存于4 ℃。第1 d，混合Freund adjuvant 和抗原（1 mL∶1 mL），乳化后注射到頸后部位，免疫2 只新西蘭白兔。按照2 周時(shí)間間隔進(jìn)行4 次免疫，每次免疫完成后第10 d 從兔耳緣靜脈采集1 mL 血液，檢測(cè)效價(jià)。經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)后，再采兔頸動(dòng)脈全血靜置過(guò)夜后，離心（4 ℃，10 000 r/min）30 min 取多抗血清，分裝并在-20 ℃下保存。

1.7 抗體效價(jià)測(cè)定

用碳酸鹽包被緩沖液（CBS）將EHPPTP3 蛋白（抗原）稀釋至1 μg/mL，以每孔100 μL 的量加入酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜。24 h 后丟棄涂層溶液，在每孔加入200 μL 密封溶液（5%脫脂奶粉），37 ℃放置90 min。按照ELISA 試劑盒的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后加入終止液：每孔加入2 mol/L H2SO450 μL，終止反應(yīng)。參照李孝良等[17]用酶標(biāo)儀和比對(duì)公式計(jì)算出該抗體效價(jià)。

1.8 Western blotting 分析

分別取經(jīng)PCR 檢測(cè)驗(yàn)證[5]后的感染EHP 和未感染EHP 的南美白對(duì)蝦肝胰腺組織、純化的EHP孢子懸液（1 mL）。用PBS（pH 7.4）洗滌3 次，5 000 r/min 離心5 min，棄上清[18]。重懸沉淀后（400 μL PBS），加入Sigma 酸洗玻璃珠0.4 g（425～600 μm）和適量蛋白酶抑制劑PMSF，4 800 r/min 破碎6 次，每次60 s。用0.125 mol/L Tris-HCl，5%SDS，50%甘油和5%β-巰基乙醇配制適量的樣品緩沖液，取300 μL 充分混勻并在4 ℃孵育6 h。離心10 min（4 ℃，12 000 r/min）所得上清就是EHP 總蛋白[19,20]。通過(guò)電泳（12%SDS-PAGE）把總蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。用3%BSA 室溫封閉1 h，按1∶15 000 稀釋（V∶V）的PTP3 抗血清與PVDF 膜在4 ℃孵育過(guò)夜[16]。PBST 洗滌產(chǎn)物3 次后，利用超敏型HRP DAB 試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.9 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

用載玻片把感染EHP 的蝦肝胰腺組織固定，用磷酸鹽緩沖溶液（1×PBS）清洗3 次（5 min/次）；滴加封閉液覆蓋組織，放入37 ℃水浴箱，封閉45 min；把封閉液小心倒出并加入一抗（EHP 多抗）4 ℃過(guò)夜；重復(fù)洗滌一抗3 次后避光孵熒光二抗，AlexaFlour488 和Cy3 按照1∶400 稀釋標(biāo)記二抗后，室溫避光孵育2 h；最后洗去二抗，避光封片，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 EHPPTP3 鑒定及序列結(jié)構(gòu)特征分析

2.1.1 目的基因鑒定

克隆得到的EHPPTP3 序列全長(zhǎng)為4 030 bp，CDS 區(qū)長(zhǎng)度為3 390 bp，兩端均存在UTR。其中，5’UTR 長(zhǎng)度為345 bp，3’UTR 長(zhǎng)度為294 bp。將此序列提交至NCBI 進(jìn)行Blastx，比對(duì)出1 個(gè)EHPPTP3的氨基酸序列（GenBank 登錄號(hào)：OQS53455.1）。將此序列上傳至GenBank 獲得登錄號(hào)為ON206665。

2.1.2 序列比對(duì)分析

將獲取的序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的3 個(gè)不同種屬PTP3 序列（蝦肝腸胞蟲PTP3，GenBank 登錄號(hào)：OQS53455.1；兔腦炎微孢子蟲PTP3，GenBank 登錄號(hào)：AGW15357.1 和家蠶微孢子蟲PTP3，GenBank登錄號(hào)：AEF33802.1）進(jìn)行多序列比對(duì)。結(jié)果顯示，EHPPTP3 與蝦肝腸胞蟲PTP3 序列相似度（identity percent）極高，為97.95%；與其他微孢子蟲PTP3 之間的氨基酸序列相似度較低，均低于21%（圖1-A）；通過(guò)NCBI 的Batch CD-Search 工具，發(fā)現(xiàn)其中家蠶微孢子蟲PTP3（GenBank 登錄號(hào)：AEF 33802.1）存在保守結(jié)構(gòu)域。后續(xù)從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇多個(gè)不同種屬PTP3 序列，采用Neighbor-joining 法來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，建樹的bootstrap 取值為1 000 個(gè)重復(fù)。進(jìn)化樹結(jié)果顯示，EHPPTP3 與蝦肝腸胞蟲PTP3 序列聚為一支，再次印證了本研究中的EHPPTP3 與OQS53455.1 親緣關(guān)系較近，而與其他微孢子蟲PTP3 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖1-B）。

圖1 氨基酸序列比對(duì)（A）和系統(tǒng)發(fā)育樹（B）Fig.1 Amino acid sequence alignment（A）and phylogenetic tree（B）

2.1.3 編碼氨基酸序列的N-糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

EHPPTP3 由1 130 個(gè)氨基酸組成，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為125 kD，等電點(diǎn)為4.84，無(wú)信號(hào)肽區(qū)域。預(yù)測(cè)具有13 個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)和558 個(gè)O-糖基化位點(diǎn)（圖2）。

圖2 EHPPTP3 蛋白的N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of N-glycosylation site in EHPPTP3 protein

磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)分別有71 個(gè)、37 個(gè)和9 個(gè)（圖3）。

圖3 EHPPTP3 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.3 Phosphorylation site prediction of EHPPTP3 protein

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，α 螺旋占41.77%，延伸鏈占12.48%，無(wú)規(guī)卷曲占39.29%，而β 轉(zhuǎn)角占6.46%。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，EHPPTP3 主要有α 螺旋和無(wú)規(guī)卷曲，結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單（圖4）。

圖4 EHPPTP3 蛋白序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Tertiary structure prediction of EHPPTP3 protein sequence

2.2 PTP3 的克隆與原核表達(dá)載體的鑒定

用PCR 方式克隆EHPPTP 基因的部分片段，獲得一條符合預(yù)期目標(biāo)的909 bp 條帶，預(yù)測(cè)蛋白分子量為33.5 kD（圖5）。參考李孝良等（2017）方法[17]，將pET28a 與擴(kuò)增產(chǎn)物連接，進(jìn)行原核表達(dá)載體的鑒定。測(cè)序比對(duì)結(jié)果表明，未出現(xiàn)堿基突變，原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖5 pET28a 質(zhì)粒雙酶切圖及重組質(zhì)粒pET28a-PTP3 的酶切產(chǎn)物圖Fig.5 Electrophoretogram of double enzyme digestion of pET28a and double enzyme digestion analysis of pET28a-PTP3 recombinant plasmid

2.3 EHPPTP3 基因蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定

SDS-PAGE 檢測(cè)經(jīng)超聲波處理和誘導(dǎo)表達(dá)的菌體（0.5 mmol/L ITPG 20 ℃誘導(dǎo)12 h）上清液和沉淀。上清液中含有接近目標(biāo)蛋白質(zhì)大小的條帶（圖6），說(shuō)明EHPPTP3 蛋白的存在形式主要為可溶性物質(zhì)。

圖6 EHPPTP3 蛋白表達(dá)的SDS-PAGE 檢測(cè)Fig.6 SDS-PAGE detection of expression of EHPPTP3 protein

對(duì)EHPPTP3 蛋白進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，超聲波破碎、離心后，選擇上清液，利用NTA 層析柱純化目的蛋白。咪唑濃度梯度洗脫后，挑取高純度部分合并，超濾濃縮。最終獲得高純度PTP3 蛋白，大小約43 kD，符合理論值（圖7）。Western blot（WB）檢測(cè)后確定純化蛋白為目的PTP3 蛋白（圖8）。

圖7 不同咪唑濃度下EHPPTP3 蛋白表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.7 SDS-PAGE detection of expression of EHPPTP3 protein in different imidazole concentrations

圖8 純化蛋白的WB 檢測(cè)Fig.8 Western blot analysis of purified protein

2.4 EHPPTP3 多克隆抗體的驗(yàn)證

免疫印跡法驗(yàn)證PTP3 多抗的特異性結(jié)果顯示，被EHP 感染組織和純化到的EHP 孢子懸液中與健康組織相比均獲得更為明顯的PTP3 目標(biāo)條帶（圖9），說(shuō)明制備的PTP3 多抗特異性良好。

圖9 EHPPTP3 多克隆抗體驗(yàn)證Fig.9 Verification of EHPPTP3 polyclonal antibody

2.5 免疫熒光試驗(yàn)

為驗(yàn)證EHPPTP3 是否為蝦肝腸胞蟲極管蛋白，將感染EHP 的蝦肝胰腺組織固定封閉加入一抗二抗孵育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用EHPPTP3 多克隆抗體開展的免疫熒光試驗(yàn)成功捕獲了肝腸胞蟲在侵染過(guò)程中極管的彈出狀態(tài)，離EHP 頂端不遠(yuǎn)處存在強(qiáng)紅色熒光分布（圖10）。EHPPTP3 多抗特異性識(shí)別極管表面的抗原表明可引起免疫反應(yīng)。該結(jié)果證實(shí)EHPPTP3 天然蛋白在蝦肝腸胞蟲彈出的極管上真實(shí)存在，是新鑒定出的蝦肝腸胞蟲極管蛋白，確認(rèn)了EHPPTP3 的存在。

3 討論

EHP 主要寄生在南美白對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦等肝胰腺中，盡管它并非致命性病原，但傳染性很強(qiáng)，可在蝦池中通過(guò)水平傳播和垂直傳播，導(dǎo)致對(duì)蝦生長(zhǎng)滯緩，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[21-24]。EHP 屬于腸胞蟲科，與畢氏腸微孢子蟲的Small Subunit rRNA 基因有84%的一致性[1]。和其他微孢子蟲一樣，EHP 生活史也涉及感染性孢子的萌發(fā)、增殖和成熟、釋放[21,25]。在孢子萌發(fā)階段，EHP 產(chǎn)生單核的0.7 μm×1.1 μm 卵圓形孢子母細(xì)胞，孢子內(nèi)含4～6 圈極絲等其他結(jié)構(gòu)[1]。在一定的環(huán)境刺激下，極絲可被擠壓彈出，此時(shí)其為極管。

極管作為獨(dú)特的侵染器官，可以把孢原質(zhì)透過(guò)細(xì)胞膜傳遞到宿主細(xì)胞[26]。本文對(duì)于EHPPTP3 的研究，可以更好地分析極管蛋白的組成以及進(jìn)一步探索微孢子蟲的感染機(jī)制。目前已經(jīng)報(bào)道有6 種不同的極管蛋白（PTP1-PTP6）被鑒定為微孢子蟲極管的主要成分[7-11]。其中，Peuvel 等[10]利用免疫篩選技術(shù)從Encephalitozoon cuniculi cDNA 文庫(kù)中鑒定到了第三種極管蛋白（PTP3），而本文則通過(guò)同源性比對(duì)篩選到了蝦肝腸胞蟲極管蛋白3 的序列，利用序列分析和定位特征初步鑒定了蝦肝腸胞蟲極管蛋白3。

3.1 EHPPTP3 的序列特征

序列特征分析表明，本研究獲得的極管蛋白3與王禮君[27]所鑒定的EHPPTP2 相似，具有高比例的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，可以變構(gòu)蛋白質(zhì)以及激活蛋白的活力；不同的是：該極管蛋白3 不具有N 端信號(hào)肽，其或許并不發(fā)揮引導(dǎo)蛋白質(zhì)的功能，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸往往需要信號(hào)肽的指引。本研究中的PTP3 具有較多的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，與Peuvel 等[10]篩選到的Encephalitozoon cuniculi PTP3 相同。它的功能是變構(gòu)并激活蛋白，更重要的是提供一個(gè)結(jié)構(gòu)基因，以促進(jìn)和其他蛋白質(zhì)相互作用而形成多蛋白復(fù)合體[28,29]。該蛋白的氨基酸數(shù)目為1 130 個(gè)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為125 kD，磷酸化位點(diǎn)等方面均符合極管蛋白3 的保守特征。值得注意的是，該蛋白具有許多潛在的糖基化位點(diǎn)，作為一種最常見的蛋白翻譯后修飾，這些位點(diǎn)的糖基化可以讓一些多肽改變構(gòu)象，也可使蛋白增強(qiáng)穩(wěn)定性。因此本文推測(cè)，該蛋白是蝦肝腸胞蟲極管蛋白3，且或許可與PTP1-2 形成復(fù)合體，并發(fā)生相互作用。

3.2 EHPPTP3 的定位特征

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備的PTP3 多克隆抗體可以在被EHP 感染組織和純化到的EHP 孢子懸液中表達(dá)，產(chǎn)生陽(yáng)性條帶，具有良好的特異性（圖9）。定位特征分析表明，利用制備的EHPPTP3多克隆抗體進(jìn)一步開展的免疫熒光試驗(yàn)，成功捕獲了肝腸胞蟲在侵染過(guò)程中極管的彈出狀態(tài)（圖10），表明了EHPPTP3 多抗可以特異地識(shí)別極管表面的抗原并與之發(fā)生免疫反應(yīng)，揭示了極管蛋白3 定位于EHP 的整根極管上（紅色熒光），證明它是在EHP 上鑒定出的一種新的極管蛋白——蝦肝腸胞蟲極管蛋白3（EHPPTP3），為EHP 的檢測(cè)以及蝦肝腸胞蟲病的預(yù)防和治療提供新的靶標(biāo)。

3.3 結(jié)論

本研究通過(guò)同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)了南美白對(duì)蝦肝腸胞蟲極管蛋白3 的序列，并利用相關(guān)生信分析軟件分析了其序列，闡述了其分子量、氨基酸組成、信號(hào)肽、糖基化和磷酸化位點(diǎn)等特征。克隆到了PTP3基因，成功構(gòu)建了PTP3 的原核表達(dá)載體pET28a-PTP3，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)和純化獲得了大量PTP3 蛋白，并通過(guò)免疫新西蘭白兔制備了特異性較好的PTP3多克隆抗體；利用SDS-PAGE 和Western blot 實(shí)驗(yàn)分析了目的基因原核表達(dá)蛋白的表達(dá)特征，驗(yàn)證了PTP3 多克隆抗體的特異性。利用EHPPTP3 多克隆抗體開展免疫熒光試驗(yàn)，成功捕獲肝腸胞蟲在侵染過(guò)程中極管的彈出狀態(tài)，揭示PTP3 在南美白對(duì)蝦肝腸胞蟲上的定位特征。綜合以上PTP3 的序列特征，蛋白表達(dá)特征，多抗特異性以及定位特征證實(shí)PTP3 即為EHP 極管蛋白3（EHPPTP3），是蝦肝腸胞蟲中鑒定出的一種新的極管蛋白。