乳山長牡蠣共附生可培養細菌的多樣性和副溶血性弧菌拮抗菌的篩選

蔣之琛，劉明坤,3，王文岐，吳富村,3，李莉,3，張德超,3

（1.中國科學院海洋研究所，山東 青島 266071；2.中國科學院大學，北京 100049；3.中國科學院海洋大科學中心，山東 青島 266071；4.青島農業大學海洋科學與工程學院，山東 青島 266237）

長牡蠣（Crassostrea gigas）肉質富含蛋白質、牛磺酸和維生素及許多有利于人體健康的微量元素，具有極高的食用價值[1]，是我國近岸沿海的重要海水養殖種類。威海乳山地區位于山東半島的東南端，天然的地理環境優勢使乳山成為我國北方主要牡蠣養殖區，年產量居全國首位[2]，全產業鏈產值過百億元，是乳山漁業經濟的支柱產業，具有非常大的經濟價值和開發潛力。

牡蠣屬于濾食性雙殼綱貝類，能濾食周圍水體中直徑低于50 μm 的幾乎所有微粒,包括微生物和病毒，進食時大量海洋微生物進入牡蠣的濾食及消化器官[3]。牡蠣的胃和鰓含有豐富的共附生微生物，可作為幾種雙殼綱貝類幼蟲變態的誘導劑[4]。共附生微生物還可以為雙殼綱貝類宿主提供生長因子，如維生素和氨基酸，有助于食物消化；產生保護宿主免受病原體感染的抗菌劑[5]。很多雙殼類軟體動物在抵御致病細菌的同時，也會選擇與某些細菌進行特異性互惠共生，在長久的共同演化中，牡蠣等雙殼綱貝類與共附生細菌形成了復雜多樣的種間關系[6]。

目前關于長牡蠣共附生微生物的研究較少，主要集中在養殖環境或養殖模式等因素對牡蠣的影響[7-9]。本文研究了乳山長牡蠣養殖區內長牡蠣胃部與鰓部可培養的共附生細菌多樣性，同時篩選副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）拮抗菌，可為乳山牡蠣的生產管理及弧菌防治提供相關參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2020 年6 月7 日、7 月10 日、7 月30 日、8 月25 日和9 月25 日采集了山東省威海市乳山牡蠣養殖區的長牡蠣樣品（每批次7～10 只），放入保溫箱內冷藏運回實驗室。用滅菌海水清洗外殼后，在超凈臺無菌條件下用滅菌刀具提取牡蠣胃和鰓。

1.1.2 培養基和主要試劑

R2A固體培養基：蛋白胨0.5 g/L，酵母粉0.5 g/L，葡萄糖0.5 g/L，淀粉0.5 g/L，K2HPO40.3 g/L，MgSO40.05 g/L，丙酮酸鈉0.3 g/L，瓊脂20 g/L。過濾海水配制，pH 7.0，高壓蒸汽滅菌（115 ℃，30 min）。

2216E 固體培養基：蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L，瓊脂粉20 g/L，過濾海水配制，pH 7.6～7.8，高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min）。

M1 固體培養基：蛋白胨2 g/L，酵母粉1 g/L，淀粉10 g/L，瓊脂20 g/L。過濾海水配制，pH 7.0，高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min）。

主要試劑：細菌基因組DNA 提取試劑盒及PCR 相關試劑購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 指示菌及培養條件

供試指示菌副溶血性弧菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為CGMCC 1.1997。使用2216E 海水培養基25 ℃恒溫培養。

1.2 方法

1.2.1 乳山長牡蠣共附生細菌的分離培養、鑒定和系統進化分析

將長牡蠣胃和鰓分別置于滅菌的玻璃勻漿器中，加入1 mL 無菌生理鹽水磨成漿，用生理鹽水進行10 倍系列梯度稀釋，涂布在三種不同的固體培養基上，25 ℃倒置培養7 d，根據菌落形態、顏色等特征挑取不同單菌落，每個菌落至少純化2 次。

采用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取分離菌株的DNA，以27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1541R（5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）為引物，PCR 擴增得到16S rRNA 基因。PCR 反應體系為40 μL，其中含1 μL 27F，1 μL 1541R，20 μL 2×Taq PCR Mastermix，16 μL ddH2O，2 μL 細 菌DNA模板。反應條件為：94 ℃預變性5 min 之后，94 ℃1 min，55℃1 min，72℃1.5 min，30 次循環，72 ℃延伸1.5 min，4 ℃保藏。PCR 產物送至北京擎科生物有限公司測序分析，經過與NCBI 數據庫比對，明確細菌的分類地位。利用MEGA 軟件采用鄰接法構建系統進化樹。

1.2.2 副溶血性弧菌拮抗菌的篩選

采用紙片擴散法[10]檢測抗菌效果。胃鰓分離到的不同共附生細菌與副溶血性弧菌指示菌CGMCC 1.1997 的培養：分別從各自斜面接種到2216E 液體培養基中，搖床25 ℃，160 r/min 培養36 h。在超凈工作臺，吸取120 μL 副溶血性弧菌指示菌菌液，用一次性無菌涂布棒均勻涂在2216E 固體培養基平板，靜置0.5 h。將濾紙片（滅菌烘干）浸入待測菌株發酵液，輕輕放在涂布弧菌指示菌的2216E 平板上，將浸入滅菌2216E 液體培養基中的濾紙片（滅菌烘干）放在同一個平板上作為空白對照。25 ℃下恒溫培養，如果平板出現抑菌圈，而空白對照無抑菌圈，則表明待測菌株對副溶血性弧菌具有拮抗作用。

1.2.3 副溶血性弧菌拮抗菌與副溶血性弧菌發酵液的OD 值和對應活菌數預實驗

將副溶血性弧菌拮抗菌和副溶血性弧菌CGMCC 1.1997 分別接種于25 mL 2216E 液體培養基，搖床25 ℃，160 r/min 培養24～36 h。選用600 nm 波長紫外可見分光光度計，以滅菌后未接種的2216E 培養基為空白對照，測定兩者發酵液的OD 值，用平板計數法檢測兩者發酵液OD 值對應的活菌數。

1.2.4 副溶血性弧菌拮抗菌與副溶血性弧菌不同比例混合競爭培養

將副溶血性弧菌拮抗菌和副溶血性弧菌CGMCC 1.1997 分別接種于25 mL 2216E 液體培養基，搖床25 ℃，160 r/min 培養，測定兩者發酵液的OD 值。根據預實驗結果，將副溶血性弧菌拮抗菌和副溶血性弧菌CGMCC 1.1997 發酵液濃度調整為109CFU/mL。

將副溶血性弧菌拮抗菌和副溶血性弧菌CGMCC 1.1997 的兩種發酵液分別按1∶1 和1∶10 體積比，加入對應的2216E 液體培養基中，以不加副溶血性弧菌拮抗菌為對照組，每組三個重復，振蕩培養24 h 后，稀釋涂布，計算副溶血性弧菌拮抗菌和副溶血性弧菌CGMCC 1.1997 濃度。

2 結果與分析

2.1 乳山長牡蠣共附生細菌的分離鑒定

從乳山5 次采集的長牡蠣樣品中，共分離獲得422 株共附生細菌，經過形態觀察和16S rRNA 基因測序，剔除同批次重復菌株后共獲得258 株細菌，篩選后得到119 種不同菌株的16S rRNA 基因序列（系統發育關系如圖1），上傳至NCBI GenBank數據庫。其中，從長牡蠣鰓和胃分別分離到4 種和13 種弧菌，弧菌16S rRNA 基因序列登錄號分別為MW559525～MW559528 和MW559496、MW559498、MW559499、MW559503、MW559504、MW559507、MW559509、MW559510、MW559514、MW559516、MW559518、MW559521、MW 559523；除弧菌外，長牡蠣鰓和胃分別分離獲得54 種和71 種共附生細菌，16S rRNA 基因序列登錄號分別為OP522051～OP522104 和OP521932～OP522002。

圖1 長牡蠣胃和鰓共附生菌的系統發育樹Fig.1 Neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree of symbiotic bacteria isolated from stomach and gill of Pacific oyster Crassostrea gigas

2.1.1 長牡蠣鰓部共附生菌多樣性分析

5 批次的乳山長牡蠣鰓部共分離共附生細菌89 株，囊括了5 個綱39 個屬和58 個種，包括一個潛在新種ML-310。形態觀察發現，菌落顏色以橘黃、米黃和白色為主，部分菌落呈現透明狀或半透明狀，一些菌落表面褶皺。有1 株噬瓊膠假交替單胞菌（Pseudoalteromonas agarivorans）有降解瓊脂的現象（圖2）；有2 株產黑假交替單胞菌（P.nigrifaciens）和水蛹假交替單胞菌（P.undina）可產生色素（圖2）。

圖2 部分菌株降解瓊脂效果與產色素情況Fig.2 Agar degradation and pigment production for some strains

主要類群包括變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）4 大類群。變形菌門為主要共附生細菌類群，占比約60.7%，其余三種分別占比15.7%、20.2% 和3.4% 。其 中，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）占比44%，為主要優勢菌類群，其次為放線菌綱（Actinobacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）和黃桿菌綱（Flavobacteriia）（圖3-A）。屬水平的多樣性如圖3-C 所示，其中塩屋埼假交替單胞菌（P.shioyasakiensis）、特基拉芽胞桿菌（Bacillus tequilensis）和藤黃微球菌（Micrococcus luteus）在3個批次以上的長牡蠣鰓部樣品中都分離到，可能是乳山長牡蠣鰓部優勢共生菌。長牡蠣鰓部共發現4株不同的弧菌（圖1），分別為海濱弧菌（Vibrio litoralis）、波氏弧菌（V.pomeroyi）、塔斯曼尼亞弧菌（V.tasmaniensis）和巴西弧菌（V.brasiliensis）。

圖3 長牡蠣可培養共附生細菌多樣性Fig.3 Diversity of cultured symbiotic bacteria isolated from Pacific oyster Crassostrea gigas

2.1.2 長牡蠣胃部共附生細菌多樣性分析

從5 批次的乳山長牡蠣胃部共分離共附生細菌169 株，囊括了6 個綱45 個屬和84 種。形態觀察發現，菌落以米黃、黃、橘色和白色為主，部分菌落呈透明或半透明狀，一些菌落表面褶皺。有4 株細菌可以產生色素，4 株細菌有降解瓊脂的現象（圖2），分別為假交替單胞菌（P.hodoensis）、海濱噬瓊膠菌（Agarivorans litoreus）、白色噬瓊膠菌（A.albus）和河口噬瓊膠菌（A.aestuarii）。胃部分離的共附生細菌主要類群包括變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門4 大類群。變形菌門為主要類群，占比約77.7%，其余三種分別占11.5%、7.2%和3.6%。γ-變形菌綱為主要優勢類群，占63%（圖3-B），屬水平的多樣性見圖3-C。

共有4 批長牡蠣樣品的胃部分離到13 種弧菌。新喀里多尼亞弧菌（V.neocaledonicus）、燦爛弧菌（V.splendidus）、巴西弧菌（V.brasiliensis）和V.cortegadensis 出現批次均在3 次及以上。系統發育關系及多樣性分析結果表明，本研究分離培養方法獲得的絕大部分弧菌均來自于長牡蠣的胃（圖1），表明胃部分布的弧菌遠多于鰓部。

2.2 副溶血性弧菌拮抗菌的篩選及混合競爭培養結果

紙片擴散法檢測的119 株不同乳山長牡蠣胃鰓共附生細菌的抗弧菌效果發現，ML-231 殺魚假交替單胞菌（P.piscicida）對副溶血性弧菌指示株有較強的拮抗作用（圖4）。混合競爭培養后，殺魚假交替單胞菌ML-231 能明顯抑制副溶血性弧菌的生長（表1）。當殺魚假交替單胞菌ML-231 和副溶血性弧菌按照1∶1 的濃度混合培養后，副溶血性弧菌的濃度由對照組的109CFU/mL 降至107CFU/mL，當菌株ML-231 和副溶血性弧菌按照10∶1 的濃度混合培養后，副溶血性弧菌的濃度由對照組的109CFU/mL 降至106CFU/mL。

表1 殺魚假交替單胞菌ML-231 與副溶血性弧菌混合競爭培養Tab.1 Mixed culture of P.piscicida ML-231 and V.parahemolyticus

圖4 殺魚假交替單胞菌ML-231 對副溶血性弧菌的抑制圈Fig.4 Inhibition zones produced by P.piscicida ML-231 to V.parahemolyticus

3 討論

3.1 乳山長牡蠣共附生細菌多樣性

長牡蠣是世界上養殖量最大的經濟貝類之一。長期高密度養殖及人為活動的嚴重污染等導致近海區域內養殖水域環境的惡化，使牡蠣等貝類對病原抵抗力下降，外界環境因子的變化和刺激同樣使得牡蠣共附生微生物群落結構和豐度發生改變。本研究分離培養了乳山長牡蠣胃和鰓的共附生細菌，發現長牡蠣共附生細菌主要優勢類群為變形菌門。Yu 等[11]采用16S rDNA 序列V3-V4 區高通量測序手段，分析廣東省三個城市（廣州、珠海和江門）水產市場的長牡蠣微生物群落結構，發現變形菌門為主要門。該門5 個最主要的屬包括弧菌屬和希瓦氏菌屬（Shewanella），本研究均分離得到這2 個屬的菌株。一般認為，希瓦氏菌是牡蠣冷藏運輸中產生的腐敗菌。本結果表明，希瓦氏菌存在于長牡蠣體內，可能更適應在低溫環境下生長繁殖，而不是外部污染的雜菌。王煥南等[12]從日照海域野生牡蠣中分離得到62 株共生細菌，大部分為變形菌門的假交替單胞菌屬，其余為弧菌屬、芽孢菌屬和交替單胞菌屬等，與本研究分離結果相似。它們可能是普遍的牡蠣共附生細菌種類。

本研究中，長牡蠣胃部共附生細菌種類較鰓部更為豐富，可能與該時期攝食的藻類等浮游生物種類豐富有關，有23 種共附生細菌在牡蠣胃部與鰓部均有存在。從胃部分離到的3 種噬瓊膠菌和1 種假交替單胞菌，具有降解瓊脂的能力。這些菌株通過產瓊膠酶降解瓊脂多糖，可能有助于牡蠣消化吸收攝食的藻類。從胃中分離的菌株ML-310，同分離自中國南海石磺屬無脊椎動物的海藻桿菌（Algibacter onchidii）16S rRNA 基因序列的相似性為94.9%[13]，推測其為海藻桿菌屬的一個新種。

近些年，我國和其他很多國家面臨養殖牡蠣在夏季大規模死亡的問題，給相關養殖業帶來沉重打擊，因而調查牡蠣死亡的原因至關重要。弧菌作為長牡蠣養殖中的常見機會性致病細菌類群，分布區域廣，海水溫度升高更利于其生長繁殖與毒力因子表達，通常與夏季牡蠣的高死亡率有關[14]。本研究連續跟蹤乳山牡蠣養殖區夏季高溫期6—9 月份5個批次的長牡蠣樣品，所分離到的弧菌主要分布在長牡蠣的胃部，加之鰓部，共分離到16 種弧菌，其中很多弧菌為已報道或潛在的牡蠣病原菌，可能導致牡蠣染病甚至死亡[15]。據報道，胃部出現頻次較高的燦爛弧菌與影響全球范圍內長牡蠣產量的夏季高死亡率有關[16]，從遭受“夏季死亡綜合癥”的牡蠣中分離出的燦爛弧菌GP32，注射到雙殼類動物時顯示出高致病性并導致死亡[17]。高曉建等[18]發現，哈維氏弧菌（V.harveyi）是引起連云港養殖長牡蠣大規模死亡的主要病因。Wang 等[19]報道了中國北方長牡蠣夏季高溫期死亡的主要致病菌有巴西弧菌、維氏弧菌、燦爛弧菌和歐文弧菌（V.owensii）等。上述弧菌均在本研究中分離得到，其中巴西弧菌在胃和鰓均分離得到。胃分離的其他弧菌，如新喀里多尼亞弧菌（V.neocaledonicus）、沙氏弧菌（V.chagasii）和施羅氏弧菌（V.shilonii）均為水產養殖動物常見致病菌[20,21]，是長牡蠣生長過程中的潛在威脅。鰓部分離的弧菌有塔斯曼尼亞弧菌（V.tasmaniensis）能作為牡蠣血細胞的兼性細胞內病原體，在牡蠣幼蟲死亡事件中有報道[22]。

3.2 副溶血性弧菌拮抗菌

副溶血性弧菌是貝殼常見的主要致病菌，盡管本文在長牡蠣樣品中沒有分離到這種致病菌，但從牡蠣的胃中分離的一株殺魚假交替單胞菌ML-231對副溶血性弧菌有很強的抑制作用。ML-231 與副溶血性弧菌不同比例混合競爭培養時，能有效抑制副溶血性弧菌的生長繁殖，推測殺魚假交替單胞菌ML-231 可能通過分泌胞外代謝產物，并利用營養競爭作用，抑制副溶血性弧菌的生長。有研究發現，假交替單胞菌某些類群對弧菌具有良好的拮抗作用[23]。王楓林等[24]報道了一株殺魚假交替單胞菌2515 對鰻弧菌（V.anguillarum）和副溶血性弧菌有拮抗作用。本研究的ML-231 為長牡蠣弧菌病生物防控提供了菌種資源。

3.3 結論

本研究通過分離培養的方法，分析了高溫期乳山長牡蠣胃和鰓可培養共附生細菌多樣性。分離菌株主要為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門4 個類群，囊括了6 個綱，63 個屬，119 個種；長牡蠣胃部共附生細菌多樣性高于鰓部，共分離到16種弧菌。多種弧菌為已報道或潛在的牡蠣病原性細菌，可能與夏季長牡蠣的高死亡率有關；篩選出1株副溶血性弧菌拮抗菌，可對于今后乳山長牡蠣的生產管理及弧菌防治提供一定的參考意見。