不同冷凍方法對犬精液冷凍效果的影響

宮曉東 郜 旭 董 巖 亓光斌 徐 可

精液冷凍保存是種質資源保存利用的重要方法之一，尋找一種廉價、高效的冷凍方法自精液冷凍技術誕生以來便是人們努力的方向。目前精液冷凍主要有三種方法，即程序冷凍、液氮熏蒸和顆粒冷凍。這三種方法各有利弊，本實驗將對三種方法冷凍效果做一個對比，以供選擇冷凍方法時作為參考。

一、材料方法

（一）材料試劑

冷凍液使用前加20%蛋黃混勻后冷藏備用。瑞式吉姆薩染液購自索萊寶。其他試劑如無特殊說明均為國藥集團滬試AR 級。

精液質量分析系統（CASA）為TYCASA.V1.0，程序冷凍儀為TYLDY-900，紅寶石精子計數板為上海微圖10μm 款。

實驗動物品種為柯基犬。

（二）精液采集與處理

1.采精

選擇6 頭2～3 歲柯基種公犬，每周采精一次，2023 年5 ～6 月共采精7 次，合計42 頭次。用濕紙巾擦凈陰莖外部，按摩法采精，用漏斗和15mL 離心管收集精液，只保留第二段富含精子部分。精液采集后迅速送至實驗室，按照1∶1 加入35℃預熱的冷凍I 液，然后將盛裝稀釋后精液的離心管置于裝有150mL35℃水的250mL 燒杯中，將燒杯置于冰箱冷藏室降溫平衡3h。然后用4℃預冷的含甘油的II 液進行1∶1 稀釋。稀釋好的精液分出2/3 在4℃條件下使用全自動灌裝封口一體機進行灌裝封口，劑型為0.25mL 細管。剩下1/3 用于顆粒冷凍。

2.冷凍

灌裝好的細管精液，一半用程序冷凍儀冷凍，冷凍程序為5℃～-10℃，-3℃/min；-10℃～-100℃，-40℃/min；-100 ～-140℃，-20℃/min；-140℃恒溫5min，然后投入液氮。另一半用泡沫箱熏蒸，熏蒸高度為5cm，熏蒸時間20min，然后投入液氮。

顆粒冷凍程序參考張江等的方法，并根據具體情況有所改變：將鋁飯盒在液氮面2cm 處預冷至-120℃，然后用配7 號針頭的2.5mL 注射器將稀釋好的精液滴在鋁飯盒上，每滴約50μL，熏蒸3 ～5min，待顆粒凍結后沉入液氮，并收集在凍存管中，每個凍存管放10 粒。

3.解凍

細管凍精采用37℃水浴解凍40s。顆粒凍精采用干式解凍法，將10mL干潔玻璃試管在37℃水中預熱，然后將一個凍存管中的10 粒顆粒凍精全部倒入玻璃試管中，并不停晃動試管，直到所有顆粒均融化完全，繼續恒溫至少1min。

（三）精液質量檢測

1.密度和運動參數

精子密度，前向運動精子比例（PM），運動精子比例（TM）以及其他運動參數均由CASA 完成。檢測條件為10X 物鏡，負相差模式。程序冷凍組和熏蒸組每次取2支解凍混合，顆粒冷凍組取10 粒，每個樣滴檢測4 個視野，取平均值。所有檢測均要求在解凍后10min 內完成。各運動參數含義見表1。

表1 精子運動參數表

2.畸形率和頂體完整率

采用瑞氏吉姆薩染液對精子進行染色，染色方法按照試劑說明書進行操作。簡單來說，即將染色液約500μL 滴到甲醇固定好的精子涂片上1min，然后滴加等量磷酸鹽緩沖液，輕輕晃動玻片，使染液與緩沖液混勻，繼續染色3 ～5min，然后用流水輕輕沖走染色液。在40X 物鏡下觀察畸形率，100X 油鏡下觀察頂體完整率，每個樣品涂2 張片子，每個片子至少數200 條精子，并且兩張片子誤差不能超過5%，否則重新涂片染色。

3.質膜完整性

采用低滲腫脹實驗（HOST）檢測質膜完整性。配制75mmol/L 果糖和25mmol/L 檸檬酸的低滲透壓水溶液(100mmol/L)。取20μL 解凍精液用低滲液稀釋10 倍，在37℃水浴15min 后在400X 下觀察至少200 條精子，每個樣品觀察2 次。尾部卷曲的精子為質膜完整精子，質膜完整的精子所占比例即為質膜完整率。

（四）數據處理與分析

所有數據使用WPS Excel 匯總整理，使用SPSS 23.0 進行多變量雙因素方差分析（固定效應為犬號、冷凍方法，只考慮主效應），事后使用LSD 法對不同冷凍方法進行兩兩比較。顯著水平設為0.05。所有結果表示為“平均值±標準誤”，上角標不同字母表示差異顯著。

二、實驗結果

（一）不同冷凍方法對解凍PM 和TM 的影響

如表2 所示，程序冷凍組解凍PM 為48.98±0.58，顯著高于液氮熏蒸組45.53±0.53 和顆粒冷凍組46.62±0.57，顆粒冷凍組高于液氮熏蒸組，但差異不顯著。程序冷凍組TM 為70.42±0.79，顯著高于液氮熏蒸組的68.11±0.72，但兩組均與顆粒冷凍組68.83±0.95 差異不顯著。

（二）不同冷凍方法對運動參數的影響

如表3 所示，程序冷凍組VSL 為36.94±0.32μm/s， 顯著高于液氮熏蒸 組35.80±0.28μm/s， 顆粒冷凍組36.53±0.29μm/s 與程序冷凍組和液氮熏蒸組差異均不顯著；程序冷凍組VCL 為83.73±1.32μm/s，顯著高于液氮熏蒸組79.58±1.07μm/s，但這兩組均與顆粒冷凍組80.82±1.24μm/s 差異不顯著；程序冷凍組ALH 為5.53±0.06μm，顯著高于液氮熏蒸組5.30±0.06μm，但與顆粒冷凍組5.39±0.06μm 差異均不顯著；程序冷凍組BCF 為7.80±0.06Hz，顯著高于液氮熏蒸組的7.55±0.05Hz，以及顆粒冷凍組的7.66±0.06Hz；液氮熏蒸組和程序冷凍組MAD 分別為52.52±1.04°、52.09±1.06°，均顯著低于顆粒冷凍組的55.57±1.11°。VAP、STR、LIN 和WOB 等其他指標上三種冷凍方式均無顯著差異。

表3 不同冷凍方法對運動參數的影響

（三）不同冷凍方法對畸形率、頂體完整率和質膜完整率的影響

如表4 所示，不同冷凍方式對畸形率、頂體完整率和質膜完整率均沒有顯著影響。

表4 不同冷凍方法對畸形率、頂體完整率和質膜完整率的影響

表 不同冷凍方法對解凍PM 和TM 的影響

三、討論

影響精液冷凍效果的因素很多，比如犬的個體差異以及營養狀況、氣候等環境因素，但犬的個體差異和環境因素不易控制。盡管如此，也可以通過巧妙的實驗設計將這些難以控制因素的影響減小，比如配對設計或者隨機區組設計等，從而提高實驗精度。就本實驗而言，所有實驗組均使用同一種冷凍液，除了冷凍和解凍方法有差異外，其他處理均完全一致，最大程度實現了條件控制，并且通過將犬的個體納入實驗因素考慮，然后通過雙因素方差分析的方法將其影響剔除，提高了實驗檢驗精度，因此即使程序冷凍組PM 僅比其他組高出2.36 也能達到顯著的水平。

更可控的因素是冷凍液、冷凍方法和解凍方法等冷凍工藝方面的因素。在三種冷凍方式中，程序冷凍的方式對冷凍過程的控制程度最大，但冷凍效果取決于具體的冷凍曲線；顆粒冷凍和液氮熏蒸方式對冷凍過程的控制程度均相對更弱，冷凍過程溫度控制精度更低，因此冷凍效果更容易受到環境溫度、氣流等隨機因素的影響，這可能就是其冷凍效果相對較差的原因之一，這也與吳衍等的結果一致。

顆粒冷凍降溫迅速，可以更快地度過危險的結冰溫區，然而顆粒凍精不易標記，容易污染，使用起來也不如細管凍精方便，因而現在幾乎被細管凍精淘汰。液氮熏蒸法操作簡單，成本低廉，僅需要控制細管到液氮面的距離即可獲得較好的結果，但泡沫箱保溫性能、環境溫度等都會影響液氮面同一高度的溫度，并且該溫度還會隨著時間而變化并不穩定。程序冷凍儀會對降溫曲線進行實時控制，確保冷凍過程不偏離設定。程序冷凍儀價格相對于另外兩種方法昂貴得多，要充分發揮冷凍儀的作用需要研究更適宜的冷凍曲線。相較而言，液氮熏蒸和顆粒冷凍過程，冷凍過程難以精確控制，因此通過改變冷凍曲線提升效果的潛力十分有限；而程序冷凍儀則可以精確控制冷凍的全過程，因而通過改變冷凍曲線提升效果的潛力大得多。本實驗所用冷凍曲線效果較好，但未必是最優的曲線，還應該繼續優化。