結直腸癌中FOXA3的表達及其臨床意義

陳宇晶,汪靜宇,張 琳,王 振

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤[1-3],其發病機制尚未完全闡明。近期研究發現,叉頭框家族蛋白(forkhead box proteins, FOX)亞家族A3(FOXA3)與肺癌、胰腺癌、肝癌、食管癌等腫瘤的發生、發展密切相關[4-5],但目前有關FOXA3在結直腸癌中作用的研究還較少。本實驗通過RNA測序,發現FOXA3在結直腸癌組織中的表達高于癌旁組織,GEPIA數據庫生物信息學分析發現,FOXA3在結直腸癌組織中的表達高于癌旁組織。結果提示,FOXA3可能在結直腸癌的發生、發展中起一定作用。本文通過分析結直腸癌組織中FOXA3的表達及其與臨床病理特征的關系,探討FOXA3在結直腸癌發生、發展中的臨床意義,旨在為結直腸癌的機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年12月～2019年1月浙江省嘉興市第一醫院手術切除的結直腸癌組織和配對癌旁正常組織標本31對(其中男性17例,女性14例)進行mRNA表達檢測。所有標本術后立即放入液氮中冷凍,然后保存于-80 ℃冰箱,直至RNA被提取。另收集2009年1月～2010年12月嘉興市第一醫院手術切除的結直腸癌組織120例(其中男性69例,女性51例)進行免疫組化檢測,標本均經10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋。所有患者術前均未行化療或放療等治療。結直腸癌病理診斷均由兩名病理診斷醫師獨立完成。本研究經嘉興市第一醫院倫理委員會批準(倫理號LS2018-204),患者均知情同意。

1.2 主要試劑組織RNA提取試劑盒(貨號74106,美國QIAGEN公司);RNA逆轉錄試劑盒(貨號RR037A,大連寶生物公司),實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測試劑盒(貨號RR420A,大連寶生物公司);兔抗人FOXA3多克隆抗體(貨號Ab238112,稀釋比1 ∶100,美國Abcam公司);免疫組化檢測試劑盒(貨號K5007,丹麥Dako公司)。

1.3 方法

1.3.1生物信息學分析 使用GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)分析TCGA數據(結腸癌組織275例,配對正常組織349例,直腸癌組織92例,配對正常組織318例)。在Single Gene Analysis模塊中輸入基因名FOXA3,點擊“GoPIA!”,選擇Expression DIY中的Box plot模塊進行分析。“Datasets Selection”框選擇結腸癌和直腸癌,其他選項為默認選項,點擊“Plot”分析數據,下載PDF箱式圖。

1.3.2RT-qPCR 用勻漿機將組織打碎后,采用組織RNA提取試劑盒(QIAGEN公司)提取新鮮結直腸癌組織和癌旁正常組織中的RNA,隨后用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA(逆轉錄反應條件為37 ℃ 45 min,85 ℃ 5 min,4 ℃保存)。用GAPDH基因作為內參照,采用RT-qPCR技術檢測FOXA3基因表達量。GAPDH和FOXA3引物序列來自美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI),引物合成由上海生工公司完成。GAPDH引物序列:上游5′-ACCACAGTC CATGCCATCAC-3′,下游5′-TCCACCACCCTGTT GCTGTA-3′,擴增長度為452 bp。FOXA3引物序列:上游5′-GAGATGCCGAAGGGGTATCG-3′,下游5′-ACCTTGACGAAGCAGTCGTT-3′,擴增長度為224 bp。RT-qPCR檢測使用大連寶生物公司的SYBR熒光試劑盒,反應體系為10 μL,儀器為Stepone plus熒光定量PCR儀(ABI公司),每個樣本均做3個復孔,統計平均值。采用2-ΔΔCt法計算FOXA3基因相對表達量。

1.3.3免疫組化 免疫組化染色采用EnVision兩步法,用PBS代替一抗作為陰性對照。FOXA3表達定位于細胞核。評分根據DAB顯色結果,采用免疫反應分數(immunoreactive scores, IRS)進行評分,IRS以陽性細胞百分比×染色強度分數表示[6]。(1)按陽性細胞百分比評分:無陽性細胞為0分,陽性細胞數<10%為1分,10%～50%為2分,51%～80%為3分,>80%為4分。(2)按染色強度評分:無陽性著色為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。IRS<6分為低表達,≥6分為高表達。

2 結果

2.1 結直腸癌和癌旁正常組織中FOXA3 mRNA的表達(1)RNA測序分析:將3對結直腸癌組織和配對癌旁正常組織進行FOXA3 mRNA測序,結果顯示結直腸癌組織中FOXA3 mRNA的表達明顯高于癌旁正常組織(表1)。(2)生物信息學分析:GEPIA數據庫分析顯示,FOXA3在結腸癌和直腸癌中的表達均高于癌旁正常組織(圖1)。(3)PCR驗證:RT-qPCR檢測結果顯示,31例結直腸癌組織中FOXA3 mRNA表達顯著高于癌旁正常組織(t=2.952,P=0.006 1,圖2)。

圖1 生物信息學分析結直腸癌組織和癌旁正常組織中FOXA3 mRNA的表達,*P<0.05

圖2 結直腸癌組織和癌旁正常組織中FOXA3 mRNA的表達

表1 3對結直腸癌組織和癌旁正常組織中FOXA3 mRNA測序分析

2.2 FOXA3蛋白表達與結直腸癌臨床病理特征的關系采用免疫組化法檢測120例結直腸癌組織中FOXA3蛋白表達(圖3),統計分析顯示,FOXA3表達與淋巴結轉移呈正相關,高表達FOXA3的患者易發生淋巴結轉移(P=0.002)。FOXA3表達與組織分化程度呈負相關,高表達FOXA3的患者組織分化程度低(P=0.006)。FOXA3表達與患者性別、年齡、發病部位、腫瘤大小和組織類型均無關(表2)。

AB

表2 FOXA3蛋白表達與結直腸癌臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 FOXA3表達與結直腸癌患者預后的關系單因素生存分析顯示,淋巴結轉移、分化程度和FOXA3表達與預后相關(表3),有淋巴結轉移者預后差(P<0.000 1),腫瘤分化程度低的患者預后差(P=0.049),高表達FOXA3的患者預后差(P=0.001)。Kaplan-Meier生存分析顯示,FOXA3低表達患者總生存期高于FOXA3高表達患者(圖4)。

圖4 Kaplan-Meier生存曲線分析FOXA3表達與結直腸癌患者預后的關系

表3 Cox回歸模型分析結直腸癌預后危險因素

將Cox單因素生存分析有統計學意義的淋巴結轉移、分化程度以及FOXA3表達等指標納入Cox多因素分析,同時將性別、年齡作為校正因素納入分析,結果顯示,FOXA3表達是結直腸癌的獨立預后因素(HR=0.453,95%CI=0.209～0.982,P=0.045,表3)。

3 討論

叉頭框家族蛋白擁有一段保守的110個氨基酸組成的DNA結構域[7],包含19個亞家族,由100多個成員組成,分別以FOXA-FOXS命名。FOX家族中FOXA是作用最廣泛、研究最深入的一個亞家族,廣泛存在于真菌和動物體內,該家族蛋白在胚胎發育、細胞分化、能量代謝以及免疫調節等均發揮重要的生理作用。FOXA由FOXA1、FOXA2和FOXA3三個成員組成,FOXA3也叫FKHH3、HNF3G或TCF3G,人類FOXA3定位于染色體19q13.32。

近年,FOXA3在癌癥中作用的研究越來越受到重視。研究表明,FOXA3在肝癌、食管癌、肺癌、子宮內膜癌等癌癥的發生、發展中均起到一定作用[8-19]。Zhou等[11]研究發現,FOXA3在肝癌組織中的表達顯著降低,FOXA3降低可能是由甲基轉移酶METTL14介導的m6A甲基化修飾所調控。FOXA3高表達患者總生存率高。另有研究團隊[12-13]也得到類似的結果,他們發現FOXA3可與HNF1A、HNF4A協同作用,使肝癌細胞喪失惡性特征,從而抑制肝癌細胞的生長。Wang等[14]研究發現,lncRNA DACT3-AS1可通過促進FOXA3和HDAC2相互作用,使FOXA3去乙酰化,降低FOXA3的表達,導致FOXA3抑制PKM2的作用降低,促進肝癌的發生和轉移。但也有研究發現[15],FOXA3可以通過上調AFP和HNF1A/MYC和下調ZFHX3的表達,促進肝母細胞瘤的發生、發展。上述研究提示,FOXA3在肝癌的發生、發展中可能通過不同調控機制在抑癌和促癌中起雙重作用。

Huang等[16]研究發現,FOXA3在肺癌組織中表達水平升高,且患者總生存率較差。Guo等[4]推測FOXA3可能與突變的KRAS協同誘導侵襲性肺黏液腺癌(invasive mucinous adenocarcinoma, IMA)的發生。這表明FOXA3在肺癌的發生、發展中可能起促癌作用。

FOXA3在食管癌中的作用也有相關研究。Chen等[17]研究發現,與正常組織相比,FOXA3在食管癌和Barrett食管組織中的表達顯著上調,FOXA3上調與腫瘤侵襲和晚期TNM分期顯著相關。進一步體外實驗發現,FOXA3下調能顯著抑制食管癌細胞的遷移和侵襲能力。但張偲昂[18]的研究結果發現FOXA3在食管鱗癌中顯著下調,FOXA3低表達患者與淋巴結轉移密切相關,FOXA3低表達是患者預后不良的獨立危險因素,上調FOXA3的表達,食管鱗狀細胞癌的增殖能力和遷移能力顯著下降。這些研究表明,與肝癌類似,FOXA3可能在食管癌的發生、發展中通過不同機制起促癌和抑癌的雙重作用。

目前,有關FOXA3在結直腸癌中作用的研究報道較少。Li等[20]研究發現,FOXA3在奧沙利鉑治療敏感的結直腸癌患者癌組織中的表達比耐藥患者癌組織中的表達顯著上調。FOXA3表達下調的患者,總生存率或無瘤生存率均較差。FOXA3表達下調可顯著提高結直腸癌細胞的存活和干細胞樣特性。進一步機制研究表明,在結直腸癌中FOXA3對奧沙利鉑化療敏感是通過抑制結腸癌轉移相關基因1(metastasis-associated in colon cancer 1, MACC1)實現的。該研究提示,FOXA3可能在結直腸癌的發生、發展中起抑癌作用。

本研究通過生物信息學分析發現,FOXA3 mRNA在結直腸癌組織中的表達顯著高于癌旁組織。RT-qPCR檢測結果與之一致,提示FOXA3在結直腸癌的發生、發展中可能起到一定的作用。進一步采用免疫組化法檢測FOXA3表達與結直腸癌臨床病理特征的關系,發現FOXA3表達與淋巴結轉移呈正相關,高表達FOXA3的患者易發生淋巴結轉移。FOXA3表達與組織分化程度呈負相關,高表達FOXA3的患者組織分化程度低,而FOXA3表達與患者性別、年齡、發病部位、腫瘤大小和組織類型均無關。Cox單因素生存分析顯示,FOXA3表達與預后相關,高表達FOXA3的結直腸患者預后差,生存期短(P=0.001)。Cox多因素分析顯示,FOXA3表達是結直腸癌患者獨立的預后指標。

研究表明[21],癌癥的發生、發展是多基因、多分子、多通路間錯綜復雜、相互作用的結果,同一基因可能通過參與不同機制在癌癥的發生、發展中起到抑癌和促癌的雙重作用。本研究推測FOXA3在結直腸癌的發生、發展中可能起促癌作用,而上述Li等的研究表明FOXA3可能通過抑制腫瘤干性和增強化療敏感在結直腸癌中起抑制作用,提示其與FOXA3在肝癌、食管癌等消化系統腫瘤中的雙重作用類似,FOXA3在結直腸癌的發生、發展中也可能起抑癌和促癌的雙重作用,這種雙重作用可能與信號通路、腫瘤代謝和免疫微環境等差異相關。總之,FOXA3在結直腸癌發生、發展中的復雜性、確切的功能和機制還需積累更多的研究加以補充和完善。

本研究通過探討FOXA3表達與結直腸癌臨床病理特征的關系,發現FOXA3可能在結直腸癌的發生、發展過程中發揮重要作用。FOXA3高表達可能會促進結直腸癌的轉移,導致預后不良,這些促癌現象的發現是對FOXA3在結直腸癌中的作用有益補充,為進一步研究FOXA3的功能和機制提供了良好的理論基礎和方向,并可能為結直腸癌的早期診斷和個體化靶向治療提供新的靶點,對結直腸癌的防治具有重要意義。