青年結直腸癌中錯配修復蛋白的表達及意義

黃克強,唐 華,黃秋霞,文亦磊

世界衛生組織國際癌癥研究機構的數據顯示,2020年全球新發結直腸癌193萬例。我國是結直腸癌的高發區,2020年新診斷的結直腸癌人數超過55萬[1]。結直腸癌好發于老年人,青年人亦有發病率增高的趨勢。目前,錯配修復(mismatch repair, MMR)蛋白功能缺失與結直腸癌的關系已有較多報道,但專門針對青年患者MMR蛋白表達的研究極少。本實驗重點分析青年結直腸癌中MMR蛋白的表達及其與臨床病理特征的關系,并通過隨訪數據進行生存分析,以進一步明確MMR蛋白表達在青年患者風險評估、診斷和預后判斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年1月～2021年12月廣西中醫藥大學第一附屬醫院385例結直腸癌患者的臨床資料,其中男性226例(58.7%),女性159例(41.3%);年齡27～92歲,中位年齡64歲,平均(62±13)歲;根據年齡大小將患者分為青年組(≤40歲)和非青年組(>40歲),青年組25例(6.5%),非青年組360例(93.5%)。所有病例均行根治術并經術后病理證實,且均未發現其他器官原發惡性腫瘤。

1.2 試劑與方法鼠抗人MLH1、MSH2、MSH6、PMS2抗體和DAB顯色試劑盒,均購自福州邁新公司,免疫組化染色采用EliVision兩步法或使用Benchmark XT全自動免疫組化染色儀進行;操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3 結果判斷腫瘤組織HE和免疫組化染色切片經2名病理科副主任醫師共同閱片,在內對照(非腫瘤細胞核)著色良好的情況下,只要出現1個及以上癌細胞核呈棕黃色顆粒即為陽性,反之為陰性;錯配修復完整(mismatch repair proficiency, pMMR)定義為4種蛋白均陽性,任意一種蛋白表達缺失則為錯配修復缺陷(different mismatch repair, dMMR)[2-3]。

1.4 統計學分析采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析,組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法,等級資料采用Spearman秩檢驗,Kaplan-Meier法描繪生存曲線并進行Log-rank檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 青年組與非青年組結直腸癌的臨床病理特征對比分析385例結直腸癌中,dMMR組39例(10.1%)(圖1A～C),pMMR組346例(89.9%)(圖2A～C)。青年組中dMMR占36.0%(9/25),非青年組僅占8.3%(30/360),差異有統計學意義(P<0.001);青年組黏液腺癌占20%(5/25),非青年組黏液腺癌占4.4%(16/360),差異有統計學意義(P=0.004);其余的臨床病理特征如性別、部位、腫瘤T分期、淋巴結轉移和遠處轉移在青年組和非青年組間差異均無統計學意義(P>0.05,表1)。

表1 青年組與非青年組結直腸癌臨床病理特征及MMR蛋白表達的比較[n(%)]

圖1 腺癌細胞核中MLH1(A)、PMS2(B)和MSH2(C)蛋白均陰性,EliVision兩步法

2.2 青年結直腸癌MMR蛋白表達與臨床病理特征的關系青年組中MMR蛋白表達與患者性別和組織學類型有關,與發病部位、腫瘤分化程度、T分期和淋巴結轉移無關,男性患者dMMR率高于女性(P=0.041),黏液腺癌中dMMR率高于非黏液腺癌(P=0.040);青年組黏液腺癌中dMMR占80%(4/5),非黏液腺癌dMMR僅占25%(5/20),差異有統計學意義(P=0.040,表2)。

表2 青年組結直腸癌中MMR蛋白表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 MMR蛋白表達與青年組結直腸癌患者預后的關系25例青年組患者均有完整的隨訪資料,由于病例較少,將復發和死亡統一定義為陽性事件,通過Kaplan-Meier法繪制生存曲線并進行Log-rank檢驗,dMMR結直腸癌患者預后好于pMMR結直腸癌患者(χ2=101.451,P<0.001,圖3),在隨訪期內dMMR組無復發或死亡病例;黏液腺癌組預后好于非黏液腺癌組,差異有統計學意義(χ2=70.267,P<0.001)。

圖3 Kaplan-Meier法分析MMR蛋白表達與青年組結直腸癌患者預后的關系

3 討論

人類DNA錯配修復過程中最重要的基因是MSH2、MSH6、MLH1和PMS2,它們轉錄表達的蛋白主要通過形成異二聚體MutLα(MLH1-PMS2)、MutSα(MSH2-MSH6)和MutSβ(MSH2-MSH3)發揮錯配修復功能,其中MLH1和MSH2起主要作用[4-5]。當各種原因導致MMR基因功能缺陷時則無法修復損傷的DNA,即MMR功能缺陷,導致腫瘤的發生、發展[6]。

研究發現MMR蛋白表達缺失與結直腸癌多種臨床病理特征,如年齡、腫瘤分級、T分期、淋巴結轉移、是否為黏液癌等相關[3]。然而,有關青年結直腸癌患者的MMR蛋白表達研究極少。本研究發現青年組結直腸癌發生dMMR的比例達36%,遠超非青年組的8.3%,結果與文獻報道相符,而且男性比女性患者發生dMMR的比例更高,差異有統計學意義(P=0.041),但MMR蛋白表達與腫瘤分級、T分期、淋巴結轉移無關(P>0.05),可能不同地域和性別人群的基因改變及發病機制不同,尚不能認為MMR蛋白表達缺失與腫瘤持續進展有關。進一步研究發現,青年組黏液腺癌中dMMR占80%(4/5),而非青年組黏液腺癌中dMMR僅占25%(5/20),提示MMR基因的缺陷是青年結直腸腺癌發病的重要原因,尤其是黏液腺癌可能主要從DNA微衛星不穩定途徑的發展而來。檢測青年人腺瘤中MMR蛋白的表達可能具有重要意義,dMMR患者癌變的概率增高,可以通過隨訪進行有效預防。

本文通過Kaplan-Meier法繪制生存曲線并進行Log-rank檢驗分析發現,dMMR組患者的預后好于pMMR組,在隨訪期內dMMR組無復發或死亡病例,與文獻報道的中青年(59歲以下)結直腸dMMR組患者預后較好結果一致[7]。本組青年組黏液腺癌預后好于青年組非黏液腺癌,可能與dMMR主要發生于黏液腺癌有關,進一步提示dMMR患者預后較好,其主要原因可能與腫瘤本身DNA倍體特征和治療反應有關。謝丹等[8]報道MMR蛋白表達缺失的結直腸癌全部是二倍體或近二倍體的腫瘤,二倍體腫瘤惡性度低,這可能是導致該類型腫瘤預后較好的主要原因。Llosa等[9]研究發現,免疫檢查點蛋白程序性死亡因子-配體1(programmed death factor-ligand 1, PD-L1)在微衛星不穩定的腫瘤細胞中表達上調,抑制T細胞活化及其免疫功能,腫瘤細胞得以存活。Le等[10]使用程序性細胞死亡蛋白-1(programmed cell death protein-1, PD-1)抑制劑治療微衛星不穩定的結直腸癌患者取得較好的效果。Cheng等[11]使用PD-1抑制劑治療86例MMR缺陷的腫瘤患者,客觀緩解率和完全緩解率分別達53%和21%。2017年,美國FDA批準免疫檢查點抑制劑應用于任何MMR缺陷的實體腫瘤[12]。dMMR結直腸癌患者可能從免疫治療中獲益。中國結直腸癌診療規范(2020)[13]推薦檢測結直腸癌患者MMR蛋白表達或微衛星不穩定,用于疾病篩查、預后分層和指導免疫治療等。

以往有研究[14-15]認為青年結直腸癌患者有更高的組織學分級、分期、淋巴結和遠處轉移率,預后更差,而本研究發現青年和非青年結直腸癌患者的腫瘤分級、T分期、淋巴結及遠處轉移差異均無統計學意義(P>0.05),而且青年組發生dMMR比非青年組的比例高,隨訪數據顯示青年dMMR組的患者預后極好,因此并不能認為非青年患者預后更差,并推測dMMR可作為青年結直腸癌預后良好的預測因子。

綜上所述,MMR蛋白表達缺失可能在青年結直腸癌的發病中起重要作用,尤其可能是青年黏液腺癌患者的主要致病因素;檢測青年人腺瘤中MMR蛋白的表達可能具有重要意義,對于存在MMR蛋白表達缺失的患者可以通過腸鏡隨訪等手段在尚未發生癌變時及時發現;青年組黏液腺癌+dMMR組患者預后較好。由于本組病例數較少,后續需要積累大樣本進行深入探究。