S-100/CKpan免疫組化雙染技術在結直腸癌周圍神經侵犯診斷中的應用

張瑋琦,陳燦燦

近年我國結直腸癌的發病率和病死率呈逐年上升趨勢[1]。在結直腸癌的診斷中,周圍神經侵犯與不良預后密切相關,是影響結直腸癌患者預后的獨立危險因素,也是相關病理結果中不可或缺的一環[2]。目前結直腸癌周圍神經侵犯的診斷主要依賴病理醫師對病理標本HE染色和相應免疫組化結果的判讀。本實驗將重點介紹一種有助于結直腸癌周圍神經侵犯診斷的S-100/CKpan雙染技術,該雙染技術與傳統HE染色結合免疫組化單染法的診斷結果高度一致,且其染色結果更加清晰直觀,可于一張玻片內同時呈現多種染色信息。該技術可大幅減少病理醫師在閱片過程中尋找并對比不同玻片可疑區域所花費的時間,極大地提升病理醫師的診斷效率。該雙染技術已在我科通過長期驗證并取得極佳效果,現將該技術介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年1月～2022年12月中山大學附屬第一醫院病理科確診的存在周圍神經侵犯和不存在周圍神經侵犯的結直腸癌標本各10例。

1.2 試劑與儀器CKpan(AE1/AE3)(稀釋比1 ∶100)一抗試劑購自福州邁新公司;S-100(兔多克隆抗體)一抗購自Dako公司,即用型。免疫組化染色采用羅氏Ventana BenchMark ULTRA全自動免疫組化染色儀,HRP標記二抗試劑盒(OptiView DAB IHC Detection Kit),AP標記二抗試劑盒(Ultra View Universal Alkaline phosphatase Red Detection Kit),染色機配套染色緩沖液等試劑均購自上海羅氏公司。

1.3 制片與染色將選取好的蠟塊3 μm厚切片,每個蠟塊切片4張,分別用于HE染色、S-100染色、CKpan染色和S-100/CKpan雙染。S-100的染色條件:Ultra CC1修復液100 ℃修復24 min,S-100一抗36 ℃孵育24 min,HRP標記的二抗孵育8 min,H2O2與DAB顯色8 min,蘇木精染色12 min,返藍液孵育4 min。CKpan的染色條件:Ultra CC1修復液100 ℃修復32 min,CKpan一抗36 ℃孵育32 min,HRP標記的二抗孵育8 min,H2O2和DAB顯色8 min,蘇木精染色12 min,返藍液孵育4 min。S-100/CKpan雙染的條件:Ultra CC1修復液100 ℃修復64 min,S-100一抗36 ℃孵育32 min,HRP標記的二抗孵育8 min,H2O2和DAB顯色8 min,緩沖液沖洗干凈后,CKpan一抗36 ℃孵育1 h,AP標記的二抗孵育12 min,增強4 min,Fast Red A/B孵育8 min,蘇木精染色12 min,返藍液孵育4 min。所有染色片染色結束后常規脫水透明,中性樹脂封固,鏡下觀察。

1.4 結果判讀由兩名主治及以上病理醫師獨立判讀,當腫瘤細胞沿神經纖維方向生長并包繞神經纖維周長33.3%以上,或腫瘤細胞浸潤神經纖維的神經鞘進入神經束膜內被判定為周圍神經侵犯[3]。兩位醫師分別反饋染色質量與判讀結果,記錄并比較HE染色結合S-100、CKpan單染法及S-100/CKpan雙染法的判讀準確度與判讀時間。

2 結果

兩名醫師獨立判讀后得出如下結果:按照上述染色條件進行染色,S-100可標記神經纖維束和散在的樹突狀細胞,陽性定位于細胞核和細胞質,呈中至強陽性染色,CKpan可標記上皮細胞(腫瘤細胞),表達定位于細胞質,呈中至強陽性染色;S-100/CKpan雙染時,S-100用DAB顯色,呈棕色,CKpan用Fast Red顯色,呈紅色,兩者在鏡下可進行有效區分。所有用于對比的切片染色結果清晰,定位準確,均達到優秀的染色標準,可用于疾病的診斷。對比分析發現,使用單一S-100/CKpan雙染片的判讀結果與傳統HE染色結合S-100、CKpan單染的判讀結果高度一致;同時,與傳統方法相比,S-100/CKpan雙染技術可以在同一張切片上更清晰直觀地展現腫瘤細胞對周圍神經的侵犯程度(圖1、2)。更為重要的是,與HE染色結合S-100、CKpan單染方法對周圍神經侵犯的判讀相比,雙染法可以顯著提升病理醫師的判讀效率,特別是在判斷微小侵犯或視野內癌細胞分布雜亂等較難判讀的情況下該優勢尤為明顯。通過統計判讀時間,結果顯示利用雙染法診斷時,平均每張玻片可節省約67%的閱片時間(表1)。證明S-100/CKpan雙染法在確保診斷結果準確性的同時,也節省了病理醫師的閱片、篩片時間。

表1 不同染色方法判讀結果和所需時間

圖1 結腸腺癌可見周圍神經浸潤,方框區域為被腺癌浸潤的周圍神經:A.HE染色結果;B.CKpan免疫組化染色結果,DAB顯色,呈棕色;C.S-100免疫組化染色結果,DAB顯色,呈棕色;D.S-100/CKpan免疫組化雙染結果,S-100用DAB顯色,呈棕褐色,CKpan用Fast Red顯色,呈紅色

3 討論

周圍神經侵犯是影響結直腸癌患者總生存期和預后的獨立危險因素。明確患者是否存在周圍神經侵犯有助于實現個性化治療,明確患者術后治療方案,從而盡可能延長患者的無瘤生存期和總生存期,是結直腸癌病理診斷結果中非常重要的環節[4]。

對于結直腸癌周圍神經侵犯的診斷,主要依賴于病理醫師對病理標本HE染色片的判讀和免疫組化染色技術。利用HE染色并結合S-100、CKpan的單染免疫組化技術可準確判斷出是否存在周圍神經侵犯,從而滿足診斷需求。然而隨著病理技術的發展和病理診斷水平的提升,病理取材標準化的推進以及人們整體醫療意識的提高,各醫院標本數目與蠟塊數量呈逐年增多趨勢。在保證閱片質量的同時,也對病理醫師的閱片速率提出了新的要求。

免疫組化雙染是在同一張玻片上同時顯示兩種不同抗原的技術,該技術多應用于觀察同一組織內兩種標記抗體的相互定位關系[5]。與單染技術相比,雙染技術不僅可以節省醫師的閱片壓力,還可有效減少因連續切片或在染色過程中產生的操作誤差。但在同一張玻片上進行兩種抗體的染色,對技術的要求比單染技術更高,因此在選擇抗體雙染時,要確保所選用的抗體組合分別定位于不同細胞或同一細胞的不同部位,兩者互不干擾。此外,應選擇不同顏色顯色底物的酶標二抗以區分不同的抗體,同時要注意標記抗體間出現交叉反應等多種問題,以避免染色重疊無法進行觀察。

本實驗介紹了一種可用于結直腸癌患者周圍神經侵犯診斷的S-100/CKpan雙染技術,該方法與HE染色配合S-100、CKpan單染的診斷結果高度一致,且其染色結果清晰直觀,紅色與棕褐色染色在藍色背景下對比明顯,極易發現受侵犯的周圍神經。同時,該方法將兩種免疫組化染色結果同時呈現在同一張玻片上,減少了切片數量和對比的誤差,同時也可節省病理醫師耗費在找片、對比分析不同玻片和觀察的時間,從而大幅提升醫師的診斷效率。此外,由于在同一張玻片上染色兩種抗體,可在一定程度上節省患者組織、技術人員工作量和自動染色機的損耗,進而節省成本,該技術值得在日常工作中大力推廣。