肺炎克雷伯菌肝膿腫患者的臨床表現(xiàn)及菌株微生物學(xué)特征研究

劉英健 王瑞靜 常建華

肺炎克雷伯菌可引起多種感染性疾病,包括尿路感染、菌血癥和肝膿腫[1]。目前,肺炎克雷伯菌肝膿腫(KPLA)已成為一種危害全球人類(lèi)生命健康的疾病[2]。肺炎克雷伯菌分為高黏液性肺炎克雷伯菌和經(jīng)典型肺炎克雷伯菌,高黏液性肺炎克雷伯菌表現(xiàn)出高黏性、獨(dú)特的莢膜血清型、毒力基因、序列型(ST)和耐藥譜,其誘導(dǎo)的肝膿腫可能導(dǎo)致肝外并發(fā)癥,如眼內(nèi)炎、腦膜炎和壞死性筋膜炎等[3,4]。因此,對(duì)KPLA,尤其是高黏液性肺炎克雷伯菌肝膿腫患者的臨床和微生物學(xué)特征進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查是非常必要的。本研究對(duì)KPLA患者的臨床、微生物學(xué)和分子流行病學(xué)進(jìn)行分析。

資料與方法

一、 病例來(lái)源

納入2020年6月至2022年10月北京市平谷區(qū)中醫(yī)醫(yī)院診斷KPLA的患者67例。診斷標(biāo)準(zhǔn):①臨床特征;②影像證據(jù);③血液或膿液培養(yǎng)中存在肺炎克雷伯菌;④經(jīng)皮穿刺術(shù)或手術(shù)治療的證據(jù);⑤排除阿米巴、結(jié)核性肝膿腫[5]。

二、 研究方法

細(xì)菌鑒定采用BD Phoenix 100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(美國(guó)BD公司),同時(shí)進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)。大腸桿菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603為質(zhì)控菌株。根據(jù)The Clinical &Laboratory Standards Institute進(jìn)行結(jié)果判定[6]。將肺炎克雷伯菌接種于5%羊血的瓊脂板,37 ℃培養(yǎng)24 h。若菌落粘液絲長(zhǎng)度>5 mm則為高黏液性菌株。莢膜血清型基因和毒力基因引物序列信息參考文獻(xiàn)[7],PCR檢測(cè)莢膜血清分型基因及相關(guān)毒力基因。尋找肺炎克雷伯菌基因組7個(gè)管家基因信息及序列(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella.html),PCR擴(kuò)增并測(cè)序。分析測(cè)序結(jié)果,確定菌株ST。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 24.0軟件及Graphpad Prism3.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25,P75)表示,比較采用曼-惠特尼U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(%)表示,比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、臨床特征

67例肺炎克雷伯菌肝膿腫患者住院時(shí)間為18(12～24) d。有基礎(chǔ)疾病16例,其中糖尿病11例,慢性肺病5例;有外傷手術(shù)史3例;肝膽疾病10例。8例患者出現(xiàn)菌血癥,1例死亡。67例患者中,高黏液性肺炎克雷伯菌感染27例,經(jīng)典型肺炎克雷伯菌感染40例,兩組在性別、年齡、實(shí)驗(yàn)室檢查、基礎(chǔ)疾病、外傷手術(shù)史等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而高黏液性肺炎克雷伯菌組肝膽疾病、菌血癥例數(shù)均高于經(jīng)典型肺炎克雷伯菌組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 高黏液性、經(jīng)典肺炎克雷伯菌感染患者臨床特征比較

二、高黏液性、經(jīng)典肺炎克雷伯菌對(duì)抗菌藥物的敏感度比較

如表2所述,除頭孢西丁、氨曲南及左氧氟沙星藥物外,高黏液性肺炎克雷伯菌對(duì)其他常用抗菌藥物敏感度均高于經(jīng)典型肺炎克雷伯菌。

表2 高黏液性肺炎克雷伯菌和經(jīng)典肺炎克雷伯菌對(duì)常用抗菌藥物敏感度[株(%)]

三、高黏液性、經(jīng)典肺炎克雷伯菌病原分子特征

結(jié)果顯示rmpA和aero同時(shí)存在于高黏液性肺炎克雷伯菌和經(jīng)典型肺炎克雷伯菌中。高黏液性表型與高毒力基因rmpA和aero呈高度相關(guān)性。27株高黏液性肺炎克雷伯菌中,74%的菌株具有rmpA和aero基因;40株經(jīng)典型肺炎克雷伯菌中,7.6%的菌株具有rmpA和aero基因。2組其他毒力基因檢出率并無(wú)明顯差異。2組均未檢出非K1和K2莢膜血清型,高黏液性肺炎克雷伯菌中,血清型K1及K2比例均高于經(jīng)典型肺炎克雷伯菌,見(jiàn)表3。

表3 高黏液性肺炎克雷伯菌和經(jīng)典肺炎克雷伯莢膜血清型及毒力基因分析[株(%)]

四、肺炎克雷伯菌MLST分型

MLST顯示在67株肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了10種序列類(lèi)型。以ST23為主(32.8%,22/67),其次為ST30(7.5%,5/67)、ST65(14.9%,10/67)、ST217(7.5%,5/67)、ST367(7.5%,5/67)和其他ST。高黏液性肺炎克雷伯菌共7種序列表現(xiàn)(ST23、ST30、ST217、ST420、ST680、ST774及ST2460),表明其可能是多克隆傳播,ST23所占比例最大(37.3%,10/27)。經(jīng)典型肺炎克雷伯菌有8種序列表現(xiàn),包括ST23、ST30、ST65、ST367、ST420、ST660、ST680及ST774,其ST23所占比例最大(30,12/40)。2者共同擁有的ST表型為ST23、ST30、ST680和ST774。

討 論

肺炎克雷伯菌是一種強(qiáng)致病菌,嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命,特別是高黏液性肺炎克雷伯菌致病性更強(qiáng)[7-9]。本研究中,高黏液性肺炎克雷伯菌的檢出率與之前的報(bào)道接近[10]。文獻(xiàn)報(bào)道,糖尿病是KPLA的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素,如果血糖控制不佳會(huì)損傷中性粒細(xì)胞的吞噬功能,促進(jìn)病原體在組織中的生長(zhǎng),而代謝紊亂可能會(huì)對(duì)肝臟產(chǎn)生負(fù)面影響。本研究中,男性、糖尿病、肝膽疾病和外傷史是發(fā)生KPLA的因素,這與流行病學(xué)趨勢(shì)相似[11,12]。因此,對(duì)KP-PLA患者應(yīng)嚴(yán)格監(jiān)測(cè)和控制血糖水平。目前關(guān)于伴有肝膽疾病或外傷手術(shù)史的KPLA患者并不少見(jiàn),一種可能的解釋是肺炎克雷伯菌容易通過(guò)直接傳播、門(mén)脈循環(huán)或穿過(guò)腸道屏障進(jìn)入肝臟,引起KPLA和嚴(yán)重的肺炎克雷伯菌感染[13-15]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),高黏液性肺炎克雷伯肝膿腫患者發(fā)生肝膽疾病及菌血癥的概率大于經(jīng)典型肺炎克雷伯菌肝膿腫,這表明高黏液性肺炎克雷伯菌的致病性要高于經(jīng)典型肺炎克雷伯菌。

研究表明,高粘滯性和超強(qiáng)毒力之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系是可變的,因此需要對(duì)來(lái)自KPLA的分離株的毒力應(yīng)結(jié)合基因型和臨床特征進(jìn)行評(píng)估[16]。目前已知肺炎克雷伯菌有77種莢膜血清K抗原,其中K1和K2血清型能合成細(xì)胞莢膜,具有很強(qiáng)的抗細(xì)胞吞噬能力,對(duì)機(jī)體殺傷的能力遠(yuǎn)大于非KI和K2型[17]。在本研究中,K1和K2的流行率分別為44.5%和33.4%,這表明來(lái)自KPLA的大部分分離物是超強(qiáng)毒力的。67株肺炎克雷伯菌含有不同的毒力基因,反映大部分肺炎克雷伯菌都表現(xiàn)出超強(qiáng)毒力和較強(qiáng)的致病力。同時(shí),非K1/K2分離株也在KPLA中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,這些分離株也可能是超強(qiáng)毒力。其中,rmpA是細(xì)胞外莢膜多糖合成過(guò)程中的一個(gè)重要基因,其是超強(qiáng)毒力最重要的基因。rmpA的去除可能導(dǎo)致包膜的丟失或變薄,從而削弱逃避免疫反應(yīng)的能力,從而使肺炎克雷伯菌的毒力顯著降低。aero通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)獲取宿主組織中的鐵以增強(qiáng)其存活能力。有文獻(xiàn)報(bào)道,在動(dòng)物模型中 aero可增加肺炎克雷伯菌的毒力[18]。在本研究中,高黏液性肺炎克雷伯肝膿腫分離株中的rmpA與 aero基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于經(jīng)典型肺炎克雷伯菌分離株。從微生物學(xué)的角度來(lái)看,不應(yīng)忽視毒力因子在KPLA分離株中的檢測(cè)價(jià)值,特別是在結(jié)合抗生素耐藥性的情況下。同時(shí)對(duì)毒力因子的探索可能為hvKp感染提供新的治療靶點(diǎn)和開(kāi)發(fā)新的疫苗,而不僅僅局限于KPLA的管理[19]。有研究表明高黏液性菌株對(duì)抗生素耐藥比較罕見(jiàn)[20],本研究中hvKP對(duì)大多數(shù)抗生素的敏感度高于cKP。此外,從KPLA分離的肺炎克雷伯菌對(duì)幾乎所有抗菌藥物都高度敏感,這可能與KPLA中豐富的hvKp有關(guān)。在67株菌株中,一共鑒定出10種ST型,其中ST23型和ST65型最普遍。高黏液性菌株和經(jīng)典菌株有共同的ST型別,表明這兩種類(lèi)型的肺炎克雷伯菌具有相同的遺傳背景。

綜上所述,患者感染 hvKP更容易并發(fā)菌血癥。臨床檢測(cè)應(yīng)注意肺炎克雷伯菌的黏液性狀、莢膜血清型和抗菌藥物敏感性,從而幫助臨床醫(yī)師迅速有效診斷及治療。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。