氟苯尼考可溶性粉含量測(cè)定的不確定度分析

翟宏旭,王曉晨,劉 艷

(遼寧國(guó)托檢測(cè)有限公司,遼寧大連 116000)

氟苯尼考(Florfenicol),又稱氟洛芬、氟甲砜霉素。作為一種獸醫(yī)專用的酰胺醇類抗菌藥物[1],具有高效、低毒、抗菌譜廣、體內(nèi)吸收性好等特點(diǎn),對(duì)大多數(shù)酰胺醇類藥物、土霉素等耐藥的菌株仍然敏感,且抗菌活性優(yōu)于其他酰胺醇類藥物[2]。主要用于治療敏感細(xì)菌引起的豬、雞、魚的細(xì)菌性疾病及支原體感染,對(duì)呼吸系統(tǒng)感染和腸道感染的治療具有顯著效果,在獸醫(yī)臨床具有廣闊應(yīng)用前景[3]。

質(zhì)量安全和有效性是研發(fā)及評(píng)價(jià)一款獸藥產(chǎn)品的基本準(zhǔn)則,而質(zhì)量控制是保證產(chǎn)品安全有效的前提基礎(chǔ)。在獸藥檢驗(yàn)中,含量測(cè)定是判斷獸藥質(zhì)量是否合格及安全有效的主要依據(jù),其檢測(cè)過(guò)程涉及的每一環(huán)節(jié)都會(huì)引起誤差產(chǎn)生,從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[4]。能夠正確的表達(dá)含有誤差的檢測(cè)結(jié)果并對(duì)結(jié)果的可信度作出評(píng)價(jià),可提高檢測(cè)結(jié)果及結(jié)論的準(zhǔn)確性、科學(xué)性。試驗(yàn)結(jié)果和誤差分析采用測(cè)量不確定度表示,可克服傳統(tǒng)誤差理論的弊端,更全面、科學(xué)地反映檢測(cè)結(jié)果可信度[5-6]。

測(cè)量不確定度是根據(jù)所獲信息,表征賦予被測(cè)量值分散性的非負(fù)參數(shù),由若干分量組成,其大小說(shuō)明賦予被測(cè)量的值的可信程度[7]。測(cè)量不確定度在檢測(cè)結(jié)果臨界值的判斷、檢測(cè)方法的確認(rèn)和測(cè)量結(jié)果與國(guó)際接軌等方面具有重要意義。本試驗(yàn)根據(jù)CNAS-GL06: 2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》,參考其他相關(guān)規(guī)定,查閱文獻(xiàn),對(duì)氟苯尼考可溶性粉含量測(cè)定(HPLC法)的不確定度進(jìn)行分析評(píng)價(jià),探討其在獸用藥品質(zhì)量檢驗(yàn)中的應(yīng)用,提高檢驗(yàn)結(jié)論的準(zhǔn)確性和科學(xué)性[8-10]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(LC-40);電子天平(FA2004);100 mL單標(biāo)線容量瓶(A級(jí));50 mL單標(biāo)線容量瓶(A級(jí));10 mL單標(biāo)線容量瓶(A級(jí));5 mL單標(biāo)線移液管(A級(jí))。

乙腈(色譜純,歐普森色譜試劑);冰醋酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠);水(一級(jí)水);氟苯尼考對(duì)照品(99.1%,批號(hào):K0301703,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所),氟苯尼考可溶性粉(山東魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)有限公司,規(guī)格30%)。

1.2 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):224 nm;流動(dòng)相:乙腈-水-冰醋酸(100∶197∶3);流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。

1.3 溶液配制 對(duì)照品溶液:稱取10 mg氟苯尼考對(duì)照品,置于100 mL容量瓶,加入適量的流動(dòng)相使其溶解,定容至刻度,搖勻,制得濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密量取5 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液,置于10 mL容量瓶,加流動(dòng)相定量稀釋至刻度,制成每1 mL中約含氟苯尼考50 μg的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

供試品溶液:稱取適量氟苯尼考可溶性粉(約相當(dāng)于氟苯尼考25 mg),置于50 mL容量瓶,加入適量流動(dòng)相使其溶解,定容至刻度,搖勻,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾;精密量取5 mL續(xù)濾液,置于50 mL容量瓶,加流動(dòng)相定量稀釋至刻度,制成每1 mL中約含氟苯尼考50 μg的供試品溶液。

P:供試品中氟苯尼考含量占標(biāo)示量的比(%);AX:供試品溶液中氟苯尼考的峰面積(μV.s);AR:對(duì)照品溶液中氟苯尼考的照品峰面積(μV.s);WR:稱取對(duì)照品的質(zhì)量(g);WX:稱取供試品的質(zhì)量(g);PR:對(duì)照品純度(99.1%);fR:對(duì)照品稀釋倍數(shù);fX:試品稀釋倍數(shù);S:標(biāo)示量(供試品規(guī)格:30%)。

1.5 測(cè)定步驟 按照上述色譜條件,設(shè)置儀器參數(shù),對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行分析,外標(biāo)法定量,根據(jù)公式計(jì)算氟苯尼考含量占標(biāo)示量的比(圖1)。

圖1 氟苯尼考可溶性粉含量測(cè)定步驟Fig 1 The content determination steps of Florfenicol Soluble Powder

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量不確定度的來(lái)源分析 試驗(yàn)過(guò)程的每一環(huán)節(jié)如所用的試劑、對(duì)照品、稱量、定容、人員操作、儀器設(shè)備、環(huán)境等均可引入不確定度。

根據(jù)試驗(yàn)測(cè)定步驟,結(jié)合數(shù)學(xué)模型,分析得出本試驗(yàn)測(cè)定過(guò)程中的不確定度來(lái)源:對(duì)照品純度引起的不確定度(PR);對(duì)照品、供試品稱量過(guò)程引起的不確定度(W);對(duì)照品、供試品溶液稀釋倍數(shù)引起的不確定度(f);對(duì)照品、供試品峰面積測(cè)定過(guò)程引起的不確定度(A)。供試品規(guī)格S(30%)為標(biāo)識(shí)量,無(wú)需考慮其不確定度(圖2)。

圖2 不確定度來(lái)源分析Fig 2 Analysis of uncertainty sources

2.2 不確定度分量的量化

2.2.2 稱量過(guò)程引入的測(cè)量不確定度 稱量過(guò)程采用減重法,稱量對(duì)照品16.5 mg,供試品101.5 mg。因?qū)φ掌放c供試品使用同一天平稱量,天平稱量范圍內(nèi)產(chǎn)生的系統(tǒng)漂移可相互抵消,由天平靈敏度引起的不確定度忽略不計(jì),其標(biāo)準(zhǔn)不確定度由天平校準(zhǔn)誤差和稱量的重復(fù)性引起。

對(duì)照品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

供試品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.2.3 稀釋倍數(shù)引入的測(cè)量不確定度 稀釋倍數(shù)的測(cè)量不確定度主要來(lái)源于溶液配制、稀釋過(guò)程中使用的單標(biāo)線移液管、單標(biāo)線容量瓶的不確定度,其標(biāo)準(zhǔn)不確定度由玻璃量具校準(zhǔn)、重復(fù)讀數(shù)及溫度體積偏差的不確定度引起。

在溶液配制及稀釋過(guò)程中使用到的玻璃量具有100、50、10 mL單標(biāo)線容量瓶,5 mL單標(biāo)線移液管。

容量瓶定容及移液管移取時(shí),因體積讀數(shù)引入的不確定度可根據(jù)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。重復(fù)測(cè)定溶劑定容至刻度線后容量瓶的重量,根據(jù)質(zhì)量密度公式,得出重復(fù)測(cè)定的體積結(jié)果。在試驗(yàn)操作中,容量瓶會(huì)蓋上磨口瓶塞稱重,故與操作人員對(duì)刻度讀數(shù)判斷產(chǎn)生的誤差相比,溶劑揮發(fā)性影響產(chǎn)生的誤差可忽略不計(jì)。溶液配制、稀釋所需溶劑組成多樣,故用水代替溶劑,同一個(gè)容量瓶經(jīng)水定容至刻度或經(jīng)5 mL移液管移取后稱重,測(cè)定10次重復(fù),按照水的密度為1.0 g/mL計(jì)算體積。測(cè)定結(jié)果如表1、表2所示。

表1 容量瓶重復(fù)量取測(cè)定結(jié)果(n=10)Tab 1 The results of repeated measuring of volumetric flask (n=10)

表2 5 mL移液管重復(fù)量取測(cè)定結(jié)果(n=10)Tab 2 The results of repeated measuring of 5 mL pipette (n=10)

讀數(shù)重復(fù)性根據(jù)A類不確定度評(píng)定方法進(jìn)行評(píng)價(jià),標(biāo)準(zhǔn)偏差可直接用作標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

溫度體積偏差的不確定度按照B類不確定度進(jìn)行評(píng)定。乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3,水的體積膨脹系數(shù)為2.08×10-4,冰醋酸的體積膨脹系數(shù)為1.10×10-3。按照流動(dòng)相條件乙腈-水-冰醋酸=100∶197∶3進(jìn)行計(jì)算,20 ℃時(shí),流動(dòng)相的體積膨脹系數(shù)為6.04×10-4。

根據(jù)溶液配制及稀釋過(guò)程中玻璃量具的使用情況,對(duì)照品及供試品溶液因5 ml單標(biāo)線移液管溫度引起的體積偏差可抵消,故由此引入的不確定度忽略不計(jì)。

將上述分量進(jìn)行合成得100 mL容量瓶的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

50 mL容量瓶的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

10 mL容量瓶的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

5 mL移液管的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

對(duì)照品稀釋倍數(shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

供試品稀釋倍數(shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.2.4 峰面積測(cè)定過(guò)程引入的測(cè)量不確定度 峰面積測(cè)定的不確定度來(lái)源主要有儀器穩(wěn)定性(泵流速、檢測(cè)器響應(yīng)等)、進(jìn)樣重復(fù)性、分離重復(fù)性等。含量測(cè)定試驗(yàn)中被檢測(cè)濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于檢測(cè)限,因此峰面積測(cè)定過(guò)程中只考慮由重復(fù)性引起的不確定度,忽略由儀器等其他因素引入的不確定度,屬于A類不確定度。

分別取對(duì)照品和供試品溶液,依據(jù)1.2中色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣10次,測(cè)定峰面積,應(yīng)用貝塞爾公式法計(jì)算,以峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差表示峰面積測(cè)定重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

峰面積測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.2.5 計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc是由測(cè)量模型中各輸入量的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)不確定度獲得的輸出量的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)不確定度,該值是將所有測(cè)量不確定度分量合成為總體方差的正平方根。將上述所有不確定度分量匯總,具體信息見表3。

表3 不確定度分量表Tab 3 Component Table of Uncertainty

對(duì)各個(gè)分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行合成,得到氟苯尼考可溶性粉含量測(cè)定合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

=1.19×10-2。

根據(jù)計(jì)算公式,測(cè)得氟苯尼考可溶性粉中氟苯尼考含量為:

=97.3%。故氟苯尼考可溶性粉含量測(cè)定合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

uc=urc×P(標(biāo)示量%)=0.0119×97.3%=1.16%。

2.2.6 擴(kuò)展不確定度與測(cè)量不確定度報(bào)告 擴(kuò)展不確定度分為U和Up兩種。在給出測(cè)量結(jié)果時(shí),一般報(bào)告擴(kuò)展不確定度U,U為合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc與包含因子k的乘積,通常測(cè)量中包含因子k取2,對(duì)應(yīng)的置信概率為95%。

氟苯尼考可溶性粉含量測(cè)定的擴(kuò)展不確定度為:U=uc×k=0.0116×2=0.0232,測(cè)量結(jié)果使用測(cè)定值±擴(kuò)展不確定度來(lái)表示[13]。故氟苯尼考可溶性粉含量測(cè)定結(jié)果最終可表示為:P=(97.3±2.32)%,k=2。

3 討 論

通過(guò)評(píng)定測(cè)量過(guò)程中的不確定度,掌握測(cè)量過(guò)程中影響結(jié)果準(zhǔn)確度的關(guān)鍵因素,可以為檢測(cè)方法及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性提供參考。引入測(cè)量不確定度后,檢測(cè)結(jié)果不再是單一的數(shù)值,而是被測(cè)值可能分布的區(qū)間范圍,以“檢測(cè)值±擴(kuò)展不確定度(U) ”來(lái)表示。若該值在限值內(nèi),則檢測(cè)結(jié)果判定為合格;若不在限值內(nèi),則判定為不合格;若橫跨在限值兩側(cè),則判定存在不確定性,具有一定風(fēng)險(xiǎn),可選擇更有經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)人員重復(fù)檢驗(yàn),確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)反復(fù)驗(yàn)證后,“檢測(cè)值±U”仍橫跨在限值兩側(cè),可在判定為符合規(guī)定的同時(shí)給出風(fēng)險(xiǎn)提示[14-15]。

本試驗(yàn)根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》2020年版一部,采用高效液相色譜法測(cè)定氟苯尼考可溶性粉中氟苯尼考的含量。根據(jù)CNAS-GL06:2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》及相關(guān)規(guī)定,并參考相關(guān)文獻(xiàn),對(duì)高效液相色譜法測(cè)定氟苯尼考可溶性粉含量的不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)不確定度評(píng)定結(jié)果可知,HPLC法測(cè)定氟苯尼考可溶性粉含量不確定度主要來(lái)源于對(duì)照品純度及稱量、稀釋、峰面積測(cè)定三個(gè)過(guò)程,其中對(duì)照品的稱量及對(duì)照品、供試品稀釋過(guò)程對(duì)測(cè)量不確定度的貢獻(xiàn)較大。為進(jìn)一步提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,應(yīng)該重點(diǎn)控制這幾個(gè)環(huán)節(jié)中的不確定度來(lái)源。

對(duì)照品的稱取量極小,屬于毫克級(jí),該過(guò)程存在較大的誤差,為減小稱量引入的不確定度,可根據(jù)精度和量程范圍選擇適宜的天平,在允許范圍內(nèi),盡可能多的稱取,以減少不確定度的引入。溶液配制過(guò)程中,玻璃器具中量器的體積越小引入的不確定度越大,稀釋頻次越多引入的不確定度越大,因此我們可使試驗(yàn)溫度接近玻璃器具校準(zhǔn)溫度、選用A 級(jí)大容量器具來(lái)減少誤差,以減少此過(guò)程不確定度。除此之外,峰面積測(cè)定過(guò)程中使用自動(dòng)進(jìn)樣,為減少重復(fù)進(jìn)樣引起的不確定度,我們應(yīng)增加對(duì)液相色譜儀的日常保養(yǎng),以確保儀器良好的工作狀態(tài)。試驗(yàn)環(huán)境、人員等方面的因素,均可通過(guò)規(guī)范的操作及環(huán)境監(jiān)控等有效措施來(lái)減少誤差的產(chǎn)生。

不確定度評(píng)定可為評(píng)估測(cè)定結(jié)果的可信度、規(guī)定質(zhì)量控制范圍提供科學(xué)依據(jù),是一份完整藥品檢驗(yàn)報(bào)告書不可或缺的內(nèi)容。本試驗(yàn)為高效液相色譜法測(cè)定氟苯尼考可溶性粉含量不確定度的評(píng)價(jià)提供了可靠方法,并為類似產(chǎn)品的質(zhì)控、含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了參考。