基于網絡藥理學及分子對接技術探討金匱腎氣丸“異病同治”多囊卵巢綜合征和甲狀腺功能減退的作用機制

何佳寧，趙偉博，王佩娟

作者單位：1南京中醫藥大學研究生院，江蘇 南京 210023；2無錫市中醫醫院婦產科，江蘇 無錫 214000；3江蘇省中西醫結合醫院婦產科，江蘇 南京 210028

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是女性常見的婦科內分泌疾病，病人多有月經失調，同時伴有痤瘡、多毛、脫發、肥胖等臨床癥狀，國內育齡期女性PCOS 發病率為6%～10%，其中不孕者達30%～60%，嚴重影響著女性的生理心理健康及家庭幸福［1-2］。甲狀腺功能減退（簡稱“甲減”）也是常見的內分泌系統疾病，病人以乏力、情緒低落、皮膚干燥、水腫、記憶力下降等臨床表現為主，目前我國甲減發病率約為1.1%，而亞臨床甲減病人高達16.7%［3］。目前已有相關研究表明PCOS 與甲減的發生有一定的關聯性，且長期發展皆易引起高血壓、冠心病等疾病的發生［4-5］。

金匱腎氣丸出自醫圣張仲景《傷寒雜病論》雜病病篇，擅溫腎益精，專治腎精、腎陽虧虛之虛勞、痰飲之病，其組方脾腎同調，益精填髓，補中寓瀉，陰中求陽。祖國醫學并無PCOS、甲減等病名，根據其臨床表現PCOS 可歸屬于“月經稀發”“不孕”范疇，甲減歸屬于“虛勞”“癭病”范疇。中醫認為“足少陰腎經起于足小趾端下……其直者：從腎，上貫肝、膈，入肺中，循喉嚨”“任脈起于胞中……沿胸腹正中直上至咽喉”“沖脈起于胞中……一支挾臍上行，與足少陰經相并，散布于胸中，再向上行，經咽喉”，認為胞宮、腎及甲狀腺通過經絡的絡屬相互聯系溝通，所以認為PCOS、甲減的發生多與腎相關。同時“腎者主蟄，封藏之本，精之處也”，腎精，主人體生長發育及生殖，同時也是機體的原動力；腎陰腎陽為一身陰陽之根本，又如《景岳全書·命門敘》中所云：“命門為精血之海……五臟之陰氣，非此不能滋；五臟之陽氣，非此不能發”。所以在病理狀態下，腎精不足則經水化源不足，影響天癸泌至；腎氣不得充養，則命門相火無以生發元氣，進而影響生長發育出現呆小、善忘等。若腎陽氣不足則溫煦推動失職，脾陽失于腎陽溫煦易形成痰濕，進而導致困倦、乏力、肥胖、水腫等，同時胞宮氣血受寒凝，瘀血阻滯，經脈不通，月經不能按時下泄。所以腎精虧虛、腎陽不足多易導致PCOS、甲減的發生，治療上以益腎填精，溫補腎陽為基本大法，這也就符合中醫上“異病同治”的理念，即對于不同的疾病若病因、病機相同時則可采取相同的治法。

網絡藥理學是基于“疾病、基因、靶點、藥物”相互作用網絡的基礎上，通過網絡分析，系統綜合地探討藥物治療疾病的相關機制，雖然現代藥理研究及臨床試驗證實，金匱腎氣丸在治療內分泌相關疾病方面有確切的療效［6-9］，但研究多針對單一疾病展開，所以本研究自2022 年3—10 月從“異病同治”角度入手，結合網絡藥理學方法，探討藥物的作用機制，以期為臨床用藥提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 金匱腎氣丸活性成分及靶點的獲取通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）以熟地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮、桂枝、附子為關鍵詞進行檢索，再利用口服生物利用度≥30%以及類藥性≥0.18 進一步篩選，獲取各藥中的潛在活性成分。同時通過TCMSP數據庫收集其蛋白靶點，借助UniProt數據庫篩選與人相關蛋白靶點對其名稱進行規范。

1.2 疾病靶點的獲取通過The Human Gene Database（GeneCards）數據庫（https：//www.genecards.org/）以及DRUGBANK 數據庫（https：//go.drugbank.com/）檢索與PCOS、甲減相關的靶點，通過微生信在線工具（http：//www.bioinformatics.com.cn）繪制藥物和疾病靶點的韋恩圖并取交集。

1.3 金匱腎氣丸治療PCOS、甲減“藥物-成分-靶點”網絡的構建將藥物靶點分別與PCOS 疾病靶點、甲減疾病靶點取交集，再將分別得到的交集靶點進行匹配獲得金匱腎氣丸干預兩種疾病的共有靶點，導入Cytoscape 3.7.1構建“藥物-成分-靶點”網絡。

1.4 金匱腎氣丸治療PCOS、甲減蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建將共有靶點輸入STRING 11.5 數據庫（https：//string-db.org/），生物種類“homo sapiens”，置信度“medium confidence（0.4）”，得到的數據導入Cytoscape構建PPI網絡。

1.5 核心靶點篩選基因本體（GO）和京都基因和基因組數據庫（KEGG）富集分析利用R 包cluster-Profiler，org.HS.eg.db，enrichplot 包將基因Ensemble轉化為ID 形式，并對基因進行GO 和KEGG 分析，通過ggplot2 包對結果進行可視化。以P＜0.05 作為富集篩選條件。

1.6 分子對接對度（Degree）值排名前5的藥物分子和前20 的蛋白分子進行分子對接分析。通過Pubchem 網站下載金匱腎氣丸藥物活性成分并保存為mol2 文件格式；Chem3D 19.0 對獲得的藥物化合物進行能量最小化。PDB 數據庫中搜索靶點蛋白PDB ID，保留2D SDF 文件。通過SYBYL-X 2.0 軟件計算對接親和力的總分。親和力總分高于7.0 被認為是高親和力表現，并對結果進行可視化。

2 結果

2.1 金匱腎氣丸活性成分及預測靶點通過檢索TCMSP數據庫篩選收集到金匱腎氣丸中8味中藥所含的活性化學成分共102 個，其中熟地黃2 個、山藥16 個、山茱萸20 個、茯苓15 個、澤瀉10 個、牡丹皮11個、桂枝7個、附子21個，去除重復值后共有92個活性成分，見表1。經UniProt 數據庫標準化注釋并去重后得到196個基因靶點。

2.2 疾病靶點及共有靶點的預測以“Polycystic Ovary Syndrome、Hypothyroidism”為檢索詞利用DRUGBANK 進行檢索分別獲得疾病靶點38、55 個，利用GeneCards（以relevance score，即前50%進行篩選）分別獲得靶點2 510、2 455個。將藥物成分靶點分別與2 種疾病靶點進行匹配，最終得到金匱腎氣丸與PCOS交集靶點101個，金匱腎氣丸與甲減交集靶點82個，三者共有靶點65個，通過Venn圖可視化展示，見圖1。

圖1 金匱腎氣丸“異病同治”多囊卵巢綜合征和甲狀腺功能減退藥物疾病靶點交集圖

2.3 “藥物-疾病-靶點”網絡的構建將金匱腎氣丸相關靶點信息導入Cytoscape 軟件構建“藥物-疾病-靶點”網絡，見圖2。分析結果顯示，網絡圖有114個節點，224 條邊、平均節點度值為15.57。根據度值的大小由高到低進行排序，列出度值排名前5 名的藥物，見表2。為槲皮素、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇和豆甾醇，其度值分別為63、23、18、14、9。

圖2 金匱腎氣丸“異病同治”多囊卵巢綜合征和甲狀腺功能減退“藥物-疾病-靶點”網絡圖

表2 金匱腎氣丸“異病同治”多囊卵巢綜合征和甲狀腺功能減退度值排名前5的活性成分

2.4 PPI 網絡的構建將三者共有靶點通過STRING 數據庫構建PPI 網絡，再導入Cytoscape 軟件進行可視化分析，見圖3。結果顯示，網絡圖有65個節點，918 條邊，平均節電度值為28.25。根據度值大小由高到低進行排序，度值排名前20名的靶點有VEGFA、IL-6、TNF-α、Akt1、CASP-3、TP53、MMP-9、IL-1B、EGF、PPARG、CCL2、EGFR、ESR1、MYC、NOS3、IL-10、SERPINE1、PTEN、IFNG、HMOX1。這20 個靶蛋白是PPI 網絡核心節點，很可能是金匱腎氣丸干預PCOS及甲減的關鍵靶蛋白，見表3。

圖3 金匱腎氣丸“異病同治”多囊卵巢綜合征和甲狀腺功能減退藥物疾病靶點交集圖

表3 金匱腎氣丸“異病同治”多囊卵巢綜合征和甲狀腺功能減退核心靶點蛋白信息

2.5 GO 與KEGG 富集生物分析將65 個共有靶點利用R語言進行GO富集分析得到生物過程2 126個，其中包括對激素的反應、腺體發育、蛋白質磷酸化的正調節等；分子功能120個，其中包括細胞因子受體結合、核受體活性等；細胞組成40個，其中包括膜筏、囊泡腔、內質網腔等。根據-lgP值，對富集結果前20 條進行可視化處理，見圖4A～4C。在KEGG富集分析結果中顯示篩選得到153 條信號通路，其中包括PI3K-Akt 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、胰島素抵抗、JAK-STAT 信號通路等，根據每條通路的P值將排名前20 位的進行可視化處理，見圖4D。同時分別研究金匱腎氣丸治療PCOS 與甲減的單獨作用通路，結果見表4。“異病同治”的關鍵通路富集到的基因，結果見表5。

圖4 金匱腎氣丸“異病同治”多囊卵巢綜合征和甲狀腺功能減退富集生物分析信息：A為生物過程基因本體（GO）結果；B為細胞組成GO結果；C為分子功能GO結果；D為京都基因和基因組數據庫（KEGG）結果

表4 金匱腎氣丸“異病同治”多囊卵巢綜合征和甲狀腺功能減退靶點的KEGG分析

表5 金匱腎氣丸“異病同治”多囊卵巢綜合征和甲狀腺功能減退關鍵通路的富集基因

2.6 分子對接選取核心靶點VEGFA、IL-6、TNFα、Akt1、CASP-3、TP53、MMP-9、IL-1B、EGF、PPARG與化合物分子槲皮素、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇進行分子對接，結果見表6。通常情況下，配體與受體之間的結合能越低，二者之間越有可能發生作用，結合能＜-20.929 3 kJ/mol 表示化合物與蛋白結合較好。分子對接結果顯示，IL-6 與β-谷甾醇結合效果最好，IFNG 與β-谷甾醇結合效果次之，IFNG與豆甾醇結合效果較好。關鍵化合物與核心靶蛋白分子對接模式圖，見圖5。

圖5 金匱腎氣丸“異病同治”多囊卵巢綜合征和甲狀腺功能減退關鍵化合物與核心靶蛋白分子對接模式圖

表6 金匱腎氣丸“異病同治”多囊卵巢綜合征和甲狀腺功能減退關鍵化合物與核心靶蛋白分子對接表

3 討論

近年來PCOS、甲減的發病率逐年上升，其均有病程遷延、反復發作，且遠期并發癥多的發病特點，不僅影響病人身體健康，而且也加重了家庭及社會的負擔。現代醫學多通過替代療法等維持人體內分泌水平穩定或調整月經周期，但長期使用存在一定的依賴性及并發癥。通過中醫辨證論治的理論，認為兩者在病因病機上均與腎精虧虛、腎陽不足有關，且金匱腎氣丸是中醫經典名方，全方諸藥合用共奏補腎益精、陰中求陽的功效。所以本研究基于“異病同治”理論，結合網絡藥理學方法，從金匱腎氣丸治療PCOS、甲減的有效成分及共同靶點出發，初步探討其發揮作用的機制。

研究通過網絡藥理學方法篩選得到金匱腎氣丸有效活性成分92 種，其中靶點較多的有槲皮素、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇，其中槲皮素是一種在植物中廣泛存在的黃酮類化合物，其具有抗氧化、抗炎、免疫調節等多種藥理活性［10-12］，王針織［13］研究發現槲皮素可以增加PCOS 模型大鼠正常卵泡及黃體的數量，同時改善卵巢局部微環境以達到治療PCOS 的作用，槲皮素也可以上調小鼠血漿3，5，3′-三碘甲腺原氨酸（T3）及甲狀腺素（T4）水平，并下調促甲狀腺素水平。山柰酚有抗氧化、抗炎、抑制脂肪生成［14］和促進胰腺β 細胞［15］的作用。研究發現，其可以通過介導胰島素受體底物-1（IRS-1）、IkB激酶α（IKKα）和IkB 激酶β（IKKβ）的磷酸化，來改善胰島素抵抗導致的胰島素信號缺陷［16］。β-谷甾醇主要發揮抗炎、抗氧化、降脂、調節免疫、抗衰老等作用。研究發現β-谷甾醇可能通過PI3K/Akt 信號通路來調節顆粒細胞增殖，抑制凋亡，進而促進雌激素的分泌［17］，β-谷甾醇、豆甾醇作為甾醇成分也可通過與膽固醇競爭結合位點［18］，也可以減少膽固醇、脂質的吸收與再吸收［19］，減少代謝綜合征的發生，豆甾醇也同時具有抗分解代謝特性，能夠改善甲減病人脂代謝等功能。

PPI 網絡分析顯示金匱腎氣丸通過復雜網絡調控疾病，其中IL-6 是一種常見的炎癥因子，與人類的生殖生理密切相關，Salvi 等［20］證實，甲狀腺細胞表面含有IL-6 受體（IL-6R），研究發現IL-6、白細胞介素-8（IL-8）等可能參與亞臨床甲減的病理生理過程［21］，同時在PCOS 病人顆粒細胞中IL-6 的表達也會明顯升高［22］。TNF-α 也是一種炎癥介質，在原發性甲減病人外周血中TNF-α 表達明顯升高，且與疾病嚴重程度有關［23］，研究也發現在PCOS病人TNF-α基因rs4645843位點CC 基因型和C等位基因頻率明顯上升［24］，同時在大鼠模型中也發現血清TNF-α 水平和血清睪酮水平呈正相關。MMP-9 是MMP 家族的一員，可以通過降解、重塑細胞內外基質中的多種成分，研究發現PCOS 病人血清中MMP-9 水平與雄激素、黃體生成素呈正相關，這多與卵巢皮質分解增多有關；同時也發現MMP-9 通過破壞基底膜、促進新生血管生成等，致卵巢、甲狀腺腫瘤浸潤及發生腺外侵犯。EGF 是表皮生長因子家族成員，在甲狀腺濾泡表皮細胞中有所分布，不僅介導調節甲狀腺組織增殖，也影響著胚泡著床，研究還發現PCOS 病人血HB-EGF 表達水平高于卵巢囊腫組［25］。PPARG 是一種重要的代謝性核受體轉錄因子，參與并調控脂肪細胞分化和脂代謝，研究發現甲減病人脂質代謝障礙會更嚴重，同時通過臨床研究發現PCOS 病人中肥胖或超重的比例明顯增加，且PPARG 基因rs3856806 位點在相加模型條件下與PCOS的發生有關聯［26］。

KEGG 通路分析結果得知，金匱腎氣丸對機體多條信號通路都具有調控作用。其中AGE-RAGE信號通路參與氧化應激和炎癥反應，研究發現PCOS婦女的血清AGEs水平明顯高于非PCOS，AGEs也而會干擾各種細胞的胰島素受體信號通路［27］，誘導胰島素抵抗的發生，同時也有研究顯示胰島素抵抗會進一步導致甲狀腺組織增生［28］。PI3K-Akt 信號通路參與細胞的生長發育、葡萄糖轉運等過程，控制各種癌癥發生與進展，其中甲狀腺濾泡上皮細胞的存活率的與甲減的發生密切相關，康春嵋等［29］研究發現艾灸通過激活PI3K-Akt 通路，改善甲狀腺濾泡上皮細胞的凋亡，從而對甲減起到了治療作用，同時下丘腦PI3K 異常是PCOS 病人胰島素抵抗及排卵減少的重要機制，沈凌宇等［30］研究發現針灸通過調節下丘腦PI3K通路來改善局部微炎癥，從而對PCOS 合并胰島素抵抗大鼠起到治療作用。JAKSTAT信號通路是細胞生長、分化和凋亡等一系列生理反應的關鍵環節，研究發現在甲狀腺癌及卵巢癌中均有STAT3、STAT5 持續性激活誘導的相應蛋白高表達［31-32］。PPAR 信號通路主要涉及血脂、血糖的代謝，其中以PPAR-α 分布最為廣泛［33］，通過調節脂蛋白的水平、介導細胞內膽固醇的代謝等過程來促進脂質代謝，從而減少代謝綜合征的發生。

綜上所述，金匱腎氣丸通過抑制炎癥反應、調控細胞凋亡、胰島素抵抗等多靶點、多途徑發揮“異病同治”的作用，對既往文獻整理發現金匱腎氣丸治療PCOS、甲減的療效確切，相關機制研究結果與本次網絡藥理學預測結果相似，進一步說明了預測的可靠性，為后續實驗研究提供思路和依據。

（本文圖1～3見插圖3-1，圖4，5見插圖3-2）