重樓皂苷Ⅶ通過p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路對肝癌細胞惡性生物學行為的影響

朱征全，王松，郭宏志，陳海洋

作者單位：南陽市第一人民醫院肝膽胰脾外科，河南 南陽 473000

肝癌是臨床最常見的消化系統惡性腫瘤之一，常發于40 歲以上男性人群，以病情進展快、預后不佳為主要特征，可并發自發性低血糖癥、肝性腦病、紅細胞增多癥、肝腎衰竭及其他伴癌重癥，危及病人生命安全，現已成為全球第二大癌癥相關致死性疾病［1］。臨床治療肝癌以根治性切除術為首選方案，配合放化療可顯著提升早期病人生存率，但對于中晚期病人來說，因其復發率高、轉移性強的特點，治療效果并不理想［2］。重樓是常見中藥，具有清熱解毒、消腫止痛及涼肝定驚之功效，皂苷是其主要活性成分，主要苷元為薯蕷皂苷元（重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ）及偏諾皂苷元（重樓皂苷Ⅵ、Ⅶ）。重樓皂苷Ⅶ是判定中藥重樓質量的重要指標之一，具有抗菌、抗氧化、免疫調節、止血等多種藥理活性。以往研究多集中在重樓皂苷Ⅰ、Ⅵ上，關于重樓皂苷Ⅶ的研究較少。近年來有研究認為，重樓皂苷Ⅶ可顯著抑制結直腸癌細胞增殖，誘導細胞周期停滯及細胞凋亡，表現出潛在的抗腫瘤作用［3］。本研究于2021年6 月至2022 年6 月采用重樓皂苷Ⅶ干預肝癌細胞，觀察其對該細胞惡性生物學行為的影響，并探討可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系人肝癌HepG2細胞系，購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物、主要試劑、儀器重樓皂苷Ⅶ（純度：99%）、p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信號通路抑制劑SB203580（上海易恩化學技術有限公司），噻唑藍比色法試劑盒、膜聯蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）/碘化丙啶（PI）雙染凋亡檢測試劑盒［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］，兔抗人p38MAPK、磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38MAPK）、細胞外信號調節激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）、磷酸化細胞外信號調節激酶1/2（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK1/2）一抗［艾比瑪特醫藥科技（上海）有限公司］。

Synergy-HT 酶標儀（美國BioTek 公司），SZX16顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.3 細胞培養取HepG2 細胞系在DMEM 高糖培養基（含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素），培養箱內標準條件（37 ℃，5%二氧化碳）下體外培養，每天半量更換培養液，待細胞融合至貼壁，胰酶消化傳代，取對數期細胞進行下一步實驗。

1.4 噻唑藍法檢測重樓皂苷Ⅶ細胞毒性取對數期HepG2 細胞，緩沖液清洗，胰酶消化、重懸，調整細胞密度為1×105個/毫升接種至96 孔板，待細胞融合至貼壁，分別加入終濃度為（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L）的重樓皂苷Ⅶ DMEM 高糖混合培養液，48 h 后加入新備制噻唑藍溶液20 μL，2 h 后吸棄上清，加入二甲基亞砜（DMSO）后搖床振蕩至晶體完全溶解，酶標儀測定490 nm 波長處吸光度［D（λ）490nm］，計算各干預孔細胞增殖抑制率（%）=（1-干預孔細胞D（λ）490nm/對照孔細胞D（λ）490nm）×100%，繪制折線圖計算重樓皂苷Ⅶ對HepG2 細胞的半抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）。

1.5 干預與分組取對數期HepG2細胞，胰酶消化重懸，待其融合至貼壁，分為對照組、重樓皂苷Ⅶ組、SB203580組、聯合組，對照組置于DMEM 高糖培養基常規培養，重樓皂苷Ⅶ組培養基內加入重樓皂苷Ⅶ（終濃度0.8 μmol/L 溶于DMSO），SB203580 組培養基內加入SB203580（終濃度10 μmol/L 溶于DMSO）［4］，聯合組培養基內加入重樓皂苷Ⅶ（0.8 μmol/L）、SB203580（10 μmol/L）。干預48 h 用于下一步實驗。

1.6 噻唑藍法檢測肝癌細胞增殖能力取干預后各組細胞，清洗、重懸、接種同“1.4”，加入完全培養液常規培養，分別于培養第24、48、72 h 加入新備制噻唑藍溶液，2 h后吸棄上清，加入DMSO 搖床振蕩，酶標儀測定490 nm波長處各組細胞吸光度值。

1.7 Annexin Ⅴ/PI 雙染法檢測肝癌細胞凋亡率取干預后各組細胞，清洗、重懸，調整細胞密度為1×105個/毫升接種至6孔板，DMEM 高糖培養液常規培養，48 h 后磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗，離心吸棄上清，binding buffer 液重懸并標記細胞，加入AnnexinⅤ-FITC液染色，PI液雙染，冷藏避光孵育20 min，經流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.8 劃痕實驗檢測肝癌細胞遷移能力取干預后各組細胞，清洗、重懸，調整細胞密度為1×106個/毫升接種至6孔板，DMEM 高糖培養液常規培養，待貼壁后吸棄培養液，利用移液槍頭垂直均勻在板面沿孔中心畫出一直線劃痕，PBS沖洗掉邊緣細胞，無血清培養液繼續培養24 h。光鏡下拍照測量計算0 h及24 h 劃痕面積，計算細胞遷移率=（1-24 h 劃痕面積/0 h劃痕面積）×100%。

1.9 小室實驗檢測肝癌細胞侵襲能力人工基膜膠經預冷無血清培養基稀釋，以40 微升/孔鋪于Transwell 小室底部，取干預后各組細胞，清洗、重懸，調整細胞密度為4×105個/毫升接種于小室中，下層加入完全培養基（含10%胎牛血清），培養24 h 后取出杯底濾膜，PBS 沖洗，甲醇固定，結晶紫染色，PBS 沖洗、風干，置于光鏡下觀察，選取5 個不相鄰視野，拍照記錄侵襲細胞數，取均值。

1.10 蛋白質印跡法檢測肝癌細胞p38 MAPK、pp38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達取干預后各組細胞，PBS 清洗，加入放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液裂解細胞，注入離心管內，低溫離心15 min（10 000 r/min，r=10 cm），棄上清，BCA 法定量蛋白。取40 μg待測樣本，按1∶5體積比與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白電泳試劑混勻，金屬浴沸騰變性蛋白，電壓80 V 行上樣電泳分離，跑膠后濕轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，BSA 溶液封閉2 h，加入兔抗人p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2（稀釋濃度1∶500），4 ℃冷藏過夜，洗膜后加入二抗（稀釋濃度1∶2 000），室溫孵育2 h，常規洗膜、發光、顯影，經成像分析儀分析各蛋白條帶灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參蛋白，分析p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達水平，計算p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2。

1.11 統計學方法數據資料的分析、處理采用統計學軟件SPSS 25.0。計量資料以服從正態分布以表示，方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，不同時間點樣本資料采用重復測量方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各劑量重樓皂苷Ⅶ對肝癌HepG2 細胞的增殖抑制率經終濃度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L）重樓皂苷Ⅶ干預后，其對HepG2 細胞增殖抑制率逐漸升高，IC50位于0.6～0.8 μmol/L，故后續實驗采用0.8 μmol/L 作為重樓皂苷Ⅶ干預劑量。詳情見圖1。

圖1 各劑量重樓皂苷Ⅶ對HepG2細胞的增殖抑制率

2.2 各劑量SB203580 對肝癌HepG2 細胞的增殖抑制率經終濃度（1、2.5、5、10、20、40 μmol/L）SB203580干預后，其對HepG2細胞增殖抑制率逐漸升高，IC50位于5～10 μmol/L，故后續實驗采用10 μmol/L作為SB203580干預劑量。見圖2。

圖2 各劑量SB203580對肝癌HepG2細胞的增殖抑制率

2.3 各組細胞增殖能力與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ組24、48、72 h 吸光度值降低（P＜0.05），SB203580組24、48、72 h 吸光度值升高（P＜0.05）；與重樓皂苷Ⅶ組比較，聯合組24、48、72 h 吸光度值升高（P＜0.05）；與SB203580 組比較，聯合組24、48、72 h 吸光度值降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組HepG2細胞吸光度值D（λ）490 nm比較/

表1 各組HepG2細胞吸光度值D（λ）490 nm比較/

注：①與對照組比較，P＜0.05。②與重樓皂苷Ⅶ組比較，P＜0.05。③與SB203580組比較，P＜0.05。

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2.4 各組細胞凋亡率對照組、重樓皂苷Ⅶ組、SB203580 組、聯合組細胞凋亡率分別為（3.25±0.78）% 、（39.87±8.94）% 、（1.05±0.15）% 、（11.30±2.80）%（F=72.38，P＜0.001）；與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ組凋亡率升高，SB203580 組凋亡率降低（P＜0.05）；聯合組凋亡率低于重樓皂苷Ⅶ組，高于SB203580組（P＜0.05）。

2.5 各組細胞遷移能力對照組、重樓皂苷Ⅶ組、SB203580 組、聯合組細胞遷移率分別為（74.33±9.37）%、（11.21±3.35）%、（89.30±14.56）%、（40.52±8.18）%（F=64.78，P＜0.001）；與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ組遷移率降低（P＜0.05），SB203580 組遷移率升高（P＜0.05）；聯合組遷移率高于重樓皂苷Ⅶ組，低于SB203580組（P＜0.05）。

2.6 各組細胞侵襲能力對照組、重樓皂苷Ⅶ組、SB203580 組、聯合組侵襲細胞數分別為（364.92±47.99）個、（54.84±7.41）個、（617.04±75.34）個、（141.36±16.75）個（F=152.25，P＜0.001）；與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ組侵襲細胞數減少（P＜0.05），SB203580 組侵襲細胞數增加（P＜0.05）；與比較，聯合組侵襲細胞數高于重樓皂苷Ⅶ組，低于SB203580組（P＜0.05）。

2.7 各組細胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2升高（P＜0.05），SB203580 組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 降低（P＜0.05）；與重樓皂苷Ⅶ組比較，聯合組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 降低（P＜0.05）；與SB203580組比較，聯合組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 升高（P＜0.05）。見表2；圖3。

表2 各組HepG2細胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2比較/

表2 各組HepG2細胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2比較/

注：p-p38 MAPK 為磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶，p38 MAPK為p38 絲裂原活化蛋白激酶，p-ERK1/2 為磷酸化細胞外信號調節激酶1/2，ERK1/2為細胞外信號調節激酶1/2。①與對照組比較，P＜0.05。②與重樓皂苷Ⅶ組比較，P＜0.05。③與SB203580組比較，P＜0.05。

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圖3 蛋白質印跡法檢測各組HepG2細胞p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達量

3 討論

肝癌是源自肝細胞及肝內膽管上皮細胞的原發性癌癥，其發病可能與持續性肝損傷有關，乙型肝炎及丙型肝炎病毒感染、飲酒、吸煙、黃曲霉毒素及慢性代謝疾病均與其具有顯著相關性，大多數病人依次發展為肝炎、肝纖維化、肝硬化，最終發展為肝癌［5-7］。因早期缺乏特異性癥狀，超過60%的病人被確診時已處于晚期，此時肝癌細胞多已出現轉移，僅能采用放化療及免疫靶向藥物，但其高惡性的特點，極大縮短了病人生存期［8］。因此臨床上亟待開發抑制其高惡性的治療新藥物。中醫治療肝癌由來已久，具有減少放化療毒副作用、提升機體免疫、多效能、多靶點等多重優勢。隨著現代提取工藝的進步，從中藥中提取單體成分為肝癌治療帶來了新的希望。

本研究結果顯示，與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ組24、48、72 h 吸光度值，遷移率降低，凋亡率升高，侵襲細胞數減少，提示重樓皂苷Ⅶ可抑制肝癌HepG2 細胞增殖、遷移及侵襲，并誘導凋亡。中醫將肝癌歸屬于“肝積”“黃疸”“肝水”等癥范疇，主要病機為機體失和、病邪亂入，臟腑失調、氣血不通，或情志內傷、宣發無門、肝氣郁結，橫逆犯脾、水不克化、日久生痰、痰瘀互搏、腫塊積聚、發為肝積，故治療應以清肝去火、化瘀排毒為主［9-10］。重樓是中醫治肝常用中草藥，入肝經血分，可化瘀、涼肝、解毒、清熱，重樓皂苷Ⅶ是自其提取的一種甾體皂苷化合物，可通過增加線粒體分裂及活性氧產生，降低線粒體膜電位，從而產生細胞毒性誘導卵巢癌凋亡［11-12］。何昊等［13］進行了一項關于重樓皂苷Ⅶ對胰腺癌細胞影響的研究，結果發現其可抑制胰腺癌PANC-1 細胞增殖、遷移和侵襲，并可能通過下調PD-L1 表達誘導PANC-1 細胞凋亡。此外，Zhang等［14］研究認為，重樓皂苷Ⅶ可顯著抑制斑馬魚腫瘤異種移植癌細胞及肝癌荷瘤小鼠肺轉移，改善轉移引發的肺損傷，降低體外HepG2 細胞血管生成和轉移能力，提示其可作為治療肝癌的潛在候選藥物。

p38 MAPK 信號通路是一條重要的腫瘤相關通路，是MAPK 通路家族成員，在惡性腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡、自噬等過程中扮演重要角色［15］。p38 MAPK、ERK1/2是該通路重要調控因子，二者均屬于絲蛋白/蘇氨酸激酶家族，外界交換因子激活通路上游絲/蘇氨酸蛋白激酶引發MAPK 三級連接反應（MAPKKK-MAPKK-MAPK），p-p38 MAPK 中酪氨酸及蘇氨酸使之激活，進一步磷酸化下游唯一底物蛋白ERK1/2，ERK1/2 進入細胞核后調節多個轉錄因子活性，參與細胞能量、死亡抵抗、免疫逃逸、骨架結構改變及細胞能動性調控，從而發揮其抑癌功效［16，14］。Han 等［17］體外實驗表明，激活p38 MAPK 通路可抑制人肝細胞癌細胞生長，誘導細胞凋亡及G2/M 期阻滯，從而對肝細胞癌荷瘤小時產生治療作用，提示p38 MAPK 通路或可成為肝癌新治療靶點，提升其通路活性可作為肝癌治療未來研究方向之一。Zhang 等［18］在脂多糖刺激的RAW264.7 細胞和多種動物模型中對重樓皂苷Ⅶ的抗炎活性及其潛在機制進行了研究，結果發現，重樓皂苷Ⅶ在多種體外和體內模型中均具有很強的抗炎活性，通過下調MAPK 和核因子-κB（NF-κB）通路發揮抗炎作用，可能是其治療癌癥的機制之一。本研究結果顯示，與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 升高，在重樓皂苷Ⅶ基礎上增用p38 MAPK 通路抑制劑SB203580 可減弱重樓皂苷Ⅶ對肝癌的治療作用，提示重樓皂苷Ⅶ可能通過激活該通路治療肝癌。

綜上所述，重樓皂苷Ⅶ可抑制肝癌HepG2 細胞增殖、遷移及侵襲等惡性生物學行為，并誘導其凋亡，作用機制可能與激活p38 MAPK信號通路相關。