血清長鏈非編碼RNA肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1水平與鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄病人左心室功能的相關(guān)性研究

許國磊，吳寶，吳欣芳，王吉元，姜北，侯瑋瓊

作者單位：中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)內(nèi)一科，北京 102600

鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄（CAS）是繼冠狀動(dòng)脈疾病和高血壓之后心血管疾病的第三大原因。CAS特征為瓣葉緩慢進(jìn)行性纖維鈣化重塑，導(dǎo)致血流阻塞［1］。CAS發(fā)病率與年齡相關(guān)，由于老齡化現(xiàn)狀，CAS發(fā)病率將增加，導(dǎo)致全球CAS 疾病負(fù)擔(dān)加重［2］。CAS 需要及時(shí)有效診斷和治療，若治療不及時(shí)將導(dǎo)致心臟肥大，并將進(jìn)展為心力衰竭。臨床上治療重度狹窄者依賴于主動(dòng)脈瓣置換術(shù)，但該方式需要永久使用抗凝劑，且人工瓣膜使用壽命有限仍面臨再次手術(shù)問題，且由于病人多為高齡，并多有合并癥，導(dǎo)致晚期CAS預(yù)后仍較差［3］。因此，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）保留的CAS病人心臟病變情況，對(duì)左心室功能評(píng)價(jià)、制定治療策略以及評(píng)估預(yù)后有重要意義。目前，已有研究證實(shí)長鏈非編碼RNA（lncRNA）中的長鏈非編碼RNA 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）、lncRNA HOX 轉(zhuǎn)錄反義（HOTAIR）與CAS 進(jìn)展中的主動(dòng)脈瓣鈣化相關(guān)［4］。lncRNA 肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1（AFAP1-AS1）是一種反義lncRNA，位于人4 號(hào)染色體，有6 810 個(gè)核苷酸，并已證實(shí)在多種惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用［5］。近期研究顯示，lncRNA AFAP1-AS1 在鈣化的主動(dòng)脈瓣中和人瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（VIC）的成骨誘導(dǎo)后表達(dá)水平增加；lncRNA AFAP1-AS1 的過表達(dá)或敲除可分別促進(jìn)或抑制VIC 的成骨分化［6］。從機(jī)制上講，lncRNA AFAP1-AS1 通過海綿化微RNA（miR）-155上調(diào)SMAD 家族成員5（SMAD5）表達(dá)，最終導(dǎo)致VIC的成骨分化［7］。此外，VIC 的成骨分化與主動(dòng)脈瓣鈣化密切相關(guān)［8］。但目前針對(duì)lncRNA AFAP1-AS1與CAS 病人左心室收縮及舒張功能研究尚不清楚。因此本研究分析了lncRNA AFAP1-AS1 與CAS 病人臨床參數(shù)以及左心室收縮及舒張功能指標(biāo)相關(guān)性，以期為CAS 病人臨床診斷以及左心室損傷功能機(jī)制分析提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2020 年1 月至2021 年12 月因CAS 就診于中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院的129 例病人作為CAS 組（LVEF≥50%），其中男、女分別為73、56 例，年齡（65.16±6.82）歲，身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）（22.59±2.30）kg/m2。同期該院健康志愿者130 例作為對(duì)照組，排除心臟疾病，均為竇性心律，其中男、女分別為65、65 例，年齡（64.49±6.25）歲，BMI（22.16±2.08）kg/m2。本研究經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)2019-01-76）。

根據(jù)2014 年美國心臟病學(xué)會(huì)（ACC）/美國心臟協(xié)會(huì)（AHA）中［9］建議，結(jié)合主動(dòng)脈瓣口面積（AVA）、主動(dòng)脈瓣峰值流速（Vmax）、主動(dòng)脈瓣平均壓差（PGmean）將CAS 病人分為：輕度狹窄病人（42 例）：AVA＞1.5 cm2、Vmax 2.6～2.9 m/s、PGmean＜20 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），中度狹窄病人（48 例）：AVA 1.0～1.5 cm2、Vmax 3.0～4.0 m/s、PGmean 20～40 mmHg，重度狹窄病人（39例）：AVA＜1.0 cm2、Vmax≥4.0 m/s、PGmean≥4.0 mmHg。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)常規(guī)超聲心動(dòng)圖證實(shí)主動(dòng)脈瓣狹窄（AS）程度為輕度及以上；（2）入組者均簽署知情同意書；（3）LVEF≥50%；（4）竇性心律；（5）甲狀腺功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）冠心病、感染性心內(nèi)膜炎、肺源性心臟病、急性心肌梗死、主動(dòng)脈瘤、心律失常、糖尿病、主動(dòng)脈夾層、馬方綜合征、風(fēng)濕性AS、痛風(fēng)、高脂血癥等；（2）腎功能不全；（3）經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖聲窗不佳；（4）瓣膜置換史；（5）合并惡性腫瘤；（6）急性或慢性炎癥性疾病。

1.2 方法

1.2.1 血清lncRNA AFAP1-AS1 表達(dá)水平檢測CAS組在入院后次日（對(duì)照組在體檢當(dāng)天）采集空腹外周血，離心取上層血清，利用愛必信公司的RNA提取試劑盒（貨號(hào)abs60276）得到總RNA，然后在超微量分光光度計(jì)（型號(hào)nanodropone/one c，賽默飛公司）上檢測RNA質(zhì)量與濃度，并取RNA質(zhì)檢參數(shù)在1.8～2.0的樣品，按照First-strand cDNA Synthesis Mix With gDNA Remover 試劑盒（貨號(hào)abs601510）得到互補(bǔ)DNA（cDNA）；然后按照定量預(yù)混液（貨號(hào)abs601511）配制反應(yīng)體系，在BIO-Rad 定量儀（型號(hào)CFX96 Touch）上采集信號(hào)。反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 25 s、72 ℃ 30 s 循環(huán)40 次。以2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA AFAP1-AS1相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR檢測血清lncRNA AFAP1-AS1表達(dá)水平引物序列

1.2.2 一般資料收集記錄入院時(shí)病人年齡、性別、體表面積（BSA）、心率、BMI、現(xiàn)病史、舒張壓、吸煙史、飲酒史、收縮壓等；收集實(shí)驗(yàn)室生化檢驗(yàn)指標(biāo)：超敏C 反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、脂蛋白（a）［Lp（a）］、低密度脂蛋白（LDL）、氨基末端B 型利鈉肽原（NT-proBNP）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、總膽固醇（TC）、肌酐。

1.2.3 常規(guī)超聲心動(dòng)圖檢查彩色多普勒超聲診斷儀Aloka Prosound F75，進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，探頭為UST-52105，頻率1.5～5.0 MHz，按照美國超聲心動(dòng)圖協(xié)會(huì)指南標(biāo)準(zhǔn)測量［10］，包括LVEF、Vmax、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左房前后徑（LAD）、二尖瓣口舒張?jiān)缙诩巴砥谘魉俣确逯担‥、A 峰）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、室間隔厚度（IVST）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室后壁厚度（LVPWT）。連續(xù)多普勒測量PGmean、Vmax。連續(xù)性方程法測量主動(dòng)脈瓣口面積AVA［11］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，采用LSD 法對(duì)兩組間差異做進(jìn)一步分析；兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；Pearson 法分析lncRNA AFAP1-AS1 與LVEF、LVPWT 等左心室功能指標(biāo)的相關(guān)性。采用受試者操作特征曲線（ROC 曲線）分析血清lncRNA AFAP1-AS1 診斷CAS的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAS 組與對(duì)照組一般資料及血清lncRNA AFAP1-AS1表達(dá)水平比較CAS組與對(duì)照組年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史、BSA、舒張壓、心率、TC、LDL 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CAS 組收縮壓、hs-CRP、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、NT-proBNP、肌酐、Lp（a）及l(fā)ncRNA AFAP1-AS1 表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 健康志愿者130例與鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄（CAS）129例一般資料及血清lncRNA AFAP1-AS1表達(dá)水平比較

2.2 血清lncRNA AFAP1-AS1 表達(dá)與CAS 組病人臨床參數(shù)關(guān)系結(jié)果顯示，lncRNA AFAP1-AS1 表達(dá)與性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史無關(guān)（P＞0.05），而與狹窄嚴(yán)重程度有關(guān)，其中輕度狹窄病人血清lncRNA AFAP1-AS1 表達(dá)水平低于中、重度狹窄者，而中度狹窄者lncRNA AFAP1-AS1 表達(dá)水平低于重度狹窄者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 血清lncRNA AFAP1-AS1表達(dá)與CAS組病人臨床參數(shù)關(guān)系/

表3 血清lncRNA AFAP1-AS1表達(dá)與CAS組病人臨床參數(shù)關(guān)系/

注：lncRNA AFAP1-AS1為長鏈非編碼RNA肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1，CAS為鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄，BMI為身體質(zhì)量指數(shù)。

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2.3 血清lncRNA AFAP1-AS1 診斷CAS 的ROC曲線ROC 結(jié)果顯示，血清lncRNA AFAP1-AS1 診斷CAS 的曲線下面積（AUC）為0.86［95%CI：（0.82，0.91）］，靈敏度為79.10%，特異度為81.50%，最大約登指數(shù)為0.606，截?cái)嘀禐?.26。血清lncRNA AFAP1-AS1 診斷重度狹窄的AUC 為0.88［95%CI：（0.82，0.94）］，靈敏度為89.70%，特異度為70.00%，最大約登指數(shù)為0.597，截?cái)嘀禐?.54。

2.4 CAS 組與對(duì)照組超聲資料比較CAS 組LVEDD、LVEDV、IVST、LVPWT、LAD、PGmean、Vmax水平高于對(duì)照組（P＜0.05），AVA水平低于對(duì)照組（P＜0.05）；兩組間LVEF、LVESD、E 峰、A 峰水平相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 健康志愿者130例與鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄（CAS）129例常規(guī)超聲心動(dòng)圖參數(shù)比較/

表4 健康志愿者130例與鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄（CAS）129例常規(guī)超聲心動(dòng)圖參數(shù)比較/

注：LVEF 為左心室射血分?jǐn)?shù)，LVEDD 為左室舒張末期內(nèi)徑，LVESD 為左室收縮末期內(nèi)徑，LVEDV 為左室舒張末期容積，IVST 為室間隔厚度，LVPWT 為左室后壁厚度，LAD 為左房前后徑，E峰為二尖瓣口舒張?jiān)缙谘魉俣确逯?，A 峰為二尖瓣口舒張晚期血流速度峰值，PGmean 為主動(dòng)脈瓣平均壓差，AVA 為主動(dòng)脈瓣口面積，Vmax為主動(dòng)脈瓣峰值流速。

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2.5 血清lncRNA AFAP1-AS1 表達(dá)與超聲指標(biāo)的相關(guān)性分析相關(guān)性分析顯示，血清lncRNA AFAP1-AS1 與LVEDD、LVEDV、LVESD、E 峰、A 峰、PGmean、Vmax 呈正相關(guān)，與LVEF、AVA 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表5。

表5 鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄129例血清lncRNA AFAP1-AS1表達(dá)與超聲指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

CAS 是一種與年齡增長相關(guān)的進(jìn)行性疾病，其特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣葉初始增厚，并在進(jìn)展階段有鈣化沉積［12-13］。CAS 病情較輕時(shí)無明顯癥狀，病人難以察覺，隨病變進(jìn)展，將影響瓣膜口的啟閉，導(dǎo)致AS，同時(shí)病人還會(huì)伴有暈厥、呼吸困難等臨床癥狀［14］。目前，CAS尚無有效治療藥物，臨床上依賴于瓣膜置換術(shù)，然而經(jīng)導(dǎo)管主動(dòng)脈置換術(shù)及外科主動(dòng)脈瓣置換術(shù)均伴隨較高的不良事件風(fēng)險(xiǎn)［3，15］。研究顯示，VIC 是主動(dòng)脈瓣膜中最豐富的細(xì)胞類型，它會(huì)積極促進(jìn)鈣化形成［16-17］。研究證實(shí)，部分lncRNA 家族成員與主動(dòng)脈瓣鈣化過程中的成骨細(xì)胞分化相關(guān)［4，18］。因此，需要探索CAS 的左心室功能異常相關(guān)分子機(jī)制，對(duì)于尋找早期病情診斷血清標(biāo)志物以及藥物研發(fā)有重要意義。

lncRNA AFAP1-AS1 是lncRNA 中重要一員，屬于促癌因子，已證實(shí)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移等惡性活動(dòng)［19］。近期研究證實(shí)，lncRNA AFAP1-AS1與主動(dòng)脈瓣鈣化有關(guān)。過表達(dá)lncRNA AFAP1-AS1會(huì)促進(jìn)脂多糖和干擾素處理的THP-1 細(xì)胞中M1 極化，但抑制M2 極化，并增強(qiáng)VIC 成骨分化；而沉默lncRNA AFAP1-AS1 則導(dǎo)致M2 極化增加，并抑制VIC 成骨分化［6］。這說明lncRNA AFAP1-AS1 可以促進(jìn)M1 巨噬細(xì)胞極化，從而加劇VIC 成骨分化，在主動(dòng)脈瓣鈣化中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CAS 組lncRNA AFAP1-AS1 表達(dá)水平明顯升高，提示lncRNA AFAP1-AS1 表達(dá)水平上調(diào)可能與CAS病理過程中的VIC成骨分化異常相關(guān)。另有研究顯示，退行性鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病病人鈣化主動(dòng)脈瓣和人VIC 成骨誘導(dǎo)后lncRNA AFAP1-AS1表達(dá)水平均增加，lncRNA AFAP1-AS1 通過海綿miR-155，間接誘導(dǎo)SMAD5 水平增加，促進(jìn)VIC 成骨分化［7］。推測lncRNA AFAP1-AS1 通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞，或靶向miRNA/mRNA 表達(dá)，誘導(dǎo)VIC 成骨分化，導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣鈣化，進(jìn)而推動(dòng)CAS。

本研究結(jié)果顯示，血清lncRNA AFAP1-AS1 表達(dá)水平與性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史無關(guān)，而與狹窄嚴(yán)重程度有關(guān)，其中輕度狹窄病人血清lncRNA AFAP1-AS1 表達(dá)水平顯著低于中、重度狹窄者，中度又低于重度狹窄者，說明血清lncRNA AFAP1-AS1 與CAS 狹窄程度密切相關(guān)，其持續(xù)異常高表達(dá)將大量誘導(dǎo)VIC成骨分化，推動(dòng)鈣化形成，促進(jìn)病情進(jìn)展。因而這提示可以通過檢測CAS 病人血清lncRNA AFAP1-AS1 水平變化為CAS 診斷和病情嚴(yán)重程度評(píng)估提供依據(jù)。ROC 結(jié)果顯示，血清lncRNA AFAP1-AS1 診斷CAS 的AUC 為0.86，靈敏度為79.10%，特異度為81.50%；其診斷重度狹窄的AUC為0.88，靈敏度為89.70%，特異度為70.00%，提示可以將血清lncRNA AFAP1-AS1 作為臨床診斷CAS 及區(qū)分病人病情的輔助指標(biāo)，以便于盡早制定治療策略，但后續(xù)應(yīng)納入更大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

超聲資料比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CAS 組與對(duì)照組LVEF、LVESD、E峰、A峰水平比較差異無顯著性，而CAS 組LVEDD、LVEDV、IVST、LVPWT、LAD 水平較高，這與張計(jì)青等［20］研究一致，說明CAS 病人心肌舒張、收縮功能均損傷。經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析，血清lncRNA AFAP1-AS1與LVEF呈負(fù)相關(guān)，與LVESD呈正相關(guān)，說明其可以反映CAS 病人左心室收縮功能；血清lncRNA AFAP1-AS1 與LVEDD、LVEDV、E峰、A 峰呈正相關(guān)，說明lncRNA AFAP1-AS1 與CAS病人的左心室舒張功能有關(guān)；血清lncRNA AFAP1-AS1與PGmean、Vmax、AVA 存在明顯相關(guān)性，再次證實(shí)血清lncRNA AFAP1-AS1 能夠用來評(píng)估CAS 嚴(yán)重程度。以上結(jié)果說明CAS病人血清lncRNA AFAP1-AS1水平變化與超聲心動(dòng)圖相關(guān)參數(shù)具有一定相關(guān)性，說明lncRNA AFAP1-AS1與左心室功能及CAS病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，但尚不能證實(shí)lncRNA AFAP1-AS1與以上指標(biāo)具有因果關(guān)系，同時(shí)仍未明確lncRNA AFAP1-AS1在CAS左心室功能變化中的具體機(jī)制，接下來我們將通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等探究lncRNA AFAP1-AS1參與左心室功能調(diào)節(jié)的具體機(jī)制，以期為臨床治療提供依據(jù)。

綜上所述，CAS 血清lncRNA AFAP1-AS1 表達(dá)水平升高，與狹窄嚴(yán)重程度有關(guān)，且其異常程度與左心室舒張、收縮功能有關(guān)，血清lncRNA AFAP1-AS1可能成為診斷CAS 及病情嚴(yán)重程度的潛在生物標(biāo)志物，但具體作用機(jī)制仍有待研究。