一株野生硫黃鱗傘的分離純化及菌絲培養(yǎng)條件優(yōu)化

高戀戀 王新童 張 浩 涂 鏡 曾糧斌 魏寶陽*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2 沅江市蘆小妹食品有限公司，湖南沅江 413100；3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南長(zhǎng)沙 410205）

硫黃鱗傘（Pholiota conissans）隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、蘑菇綱Agaricomycetes、蘑菇目（Agaricales）、球蓋菇科（Strophariaceae）、鱗傘屬（Pholiota），是一種食藥兼用的小型真菌。鱗傘屬分布廣泛，全球約150種[1]，國(guó)內(nèi)已知的鱗傘屬真菌有68種[2-4]，如多脂鱗傘（P.adiposa）[5]、白鱗傘（P.destruens）[6]、翹鱗傘（P.squarrosa）[7]和檸檬鱗傘（P.limonella）[8]等，廣泛分布我國(guó)27個(gè)省區(qū)[9]，其中多數(shù)物種為木腐型真菌。鱗傘屬真菌中富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)[10-11]，具有抗癌、抗腫瘤和抗氧化等作用[12-13]，因此，硫黃鱗傘是深受人們喜愛和青睞的“一條腿”保健食物。

筆者對(duì)采自湖南省沅江市天下第一蘆葦蕩的一株野生菌株進(jìn)行分離、純化及鑒定，最終確定其分類學(xué)地位；同時(shí)通過單因素試驗(yàn)探究其菌絲在固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，以此了解硫黃鱗傘菌絲固體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件。羊晨等[14]研究發(fā)現(xiàn)，附加基質(zhì)可促進(jìn)肺形側(cè)耳菌絲體的生長(zhǎng)并增強(qiáng)菌株抗木霉污染能力，因此，筆者在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加5種附加基質(zhì)粉末，探究附加基質(zhì)對(duì)硫黃鱗傘液體菌絲生物量的影響，以期為硫黃鱗傘開發(fā)利用、液體發(fā)酵和活性物質(zhì)的提取等提供理論指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）供試菌株：野生菌株采自沅江市天下第一蘆葦蕩，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離、純化，該菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所保藏，編號(hào)為Y1。

（2）供試附加碳源基質(zhì)：選用干燥無霉變的蘆葦、稻草、木屑、玉米芯、麩皮等原料，粉碎，并過40目篩（孔徑0.45 mm），取粉末干燥備用。

（3）供試培養(yǎng)基：①PDA培養(yǎng)基為馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂1.5%，pH自然，蒸餾水1 000 mL。②碳源培養(yǎng)基為碳源20 g、酵母粉2 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、瓊脂18 g，pH自然，水1 000 mL[15]。③氮源培養(yǎng)基為碳源20 g、氮源2 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、瓊脂18 g，水1 000 mL，pH自然。④基礎(chǔ)發(fā)酵液體培養(yǎng)基為葡萄糖3%、酵母粉0.3%、磷酸二氫鉀0.4%、硫酸鎂0.2%、維生素B10.02%，加水定容至1 000 mL，pH自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離與純化

用自來水沖洗幼嫩供試菌株子實(shí)體表面以及菌柄處的泥土，將其放入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中浸泡5 min后取出，用無菌解剖刀自菌柄處切開少許，然后掰開子實(shí)體。在菌蓋、菌蓋與菌柄交界處切取米粒大小的菌肉，置于涂布100 μL質(zhì)量濃度為50 mg/mL硫酸鏈霉素的PDA平板上，用封口膜封口后，于25 ℃生化恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，待菌絲塊長(zhǎng)至直徑2～3 cm轉(zhuǎn)接、純化，獲得純種菌絲，置4 ℃冰箱保藏備用。

1.2.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

觀察野生菌株生長(zhǎng)環(huán)境，子實(shí)體形態(tài)、大小、顏色，孢子形態(tài)，孢子印顏色，菌絲顏色以及菌柄著生方式等特征并拍照，結(jié)合《中國(guó)大型菌物資源圖鑒》（李玉2015）進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。

1.2.3 菌株分子鑒定

采用內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔（Internal Transcribed Spacer，ITS）鑒定法。菌絲體總DNA提取采用真菌DNA提取試劑盒。PCR擴(kuò)增采用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4[16]，PCR反應(yīng)體系為25 μL，每份體系包含12.5 μL 2×Es Taq MasterMix，ITS1和ITS4（100 μmol/L）各1 μL，1 μL DNA模板，9.5 μL ddH2O。PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并測(cè)序，將獲得的ITS序列輸入NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取與菌株Y1近緣關(guān)系不同的菌株ITS序列，利用MEGA 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行同源性分析。

1.2.4 菌株活化

將貯存在4 ℃的硫黃鱗傘菌株取出，在超凈工作臺(tái)上將其接種于PDA培養(yǎng)基上，置25 ℃恒溫箱中暗培養(yǎng)，備用。

1.2.5 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.5.1 光照試驗(yàn)

挑取活化后的硫黃鱗傘直徑為4 mm菌絲塊接于PDA中，置光照氣候箱中25 ℃培養(yǎng)7 d。通過調(diào)整包裹平板的遮光紙，設(shè)5個(gè)光照強(qiáng)度，分別為0 lx、500 lx、1 000 lx、1 500 lx、2 000 lx。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

1.2.5.2 溫度試驗(yàn)

挑取4 mm活化后的硫黃鱗傘菌絲塊接于PDA中，然后分別置19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

1.2.5.3 碳源試驗(yàn)

采用碳源培養(yǎng)基，分別添加碳源為葡萄糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖，接種同1.2.5.2。然后置25 ℃恒溫暗培養(yǎng)7 d。

1.2.5.4 氮源試驗(yàn)

采用氮源培養(yǎng)基，分別添加氮源為酵母粉、尿素、蛋白胨、硫酸銨、牛肉膏，接種、培養(yǎng)同1.2.5.3。

1.2.5.5 無機(jī)鹽試驗(yàn)

采用最優(yōu)碳源和氮源培養(yǎng)基，分別添加磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鉀，接種、培養(yǎng)同1.2.5.3。

1.2.5.6 pH試驗(yàn)

采用最優(yōu)碳源、氮源、無機(jī)鹽培養(yǎng)基，將其pH調(diào)至5、6、7、8、9，接種、培養(yǎng)同1.2.5.3。

1.2.6 附加基質(zhì)對(duì)供試菌株液體菌絲生長(zhǎng)影響

采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加0.3%的稻草、蘆葦、木屑、玉米芯、麩皮5種附加基質(zhì)，接種后，于25 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)7 d。以不添加附加基質(zhì)處理為對(duì)照。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

（1）菌落直徑測(cè)定。觀察并記錄固體培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

（2）菌絲生物量的測(cè)定。液體發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液用無菌紗布過濾，所得沉淀物為硫黃鱗傘菌絲體與培養(yǎng)基混合物，將其烘干至恒重，即為培養(yǎng)基混合物與菌絲體干質(zhì)量。稱取等量的附加基質(zhì)于配置好的液體培養(yǎng)基中，直接離心取沉淀烘干，即為培養(yǎng)基混合物干質(zhì)量。兩者之差即為發(fā)酵菌絲體生物量[mg/（100 mL）]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2021軟件、Word 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，PowerPoint 2021進(jìn)行圖片處理，IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、差異顯著性分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生態(tài)環(huán)境調(diào)查及形態(tài)學(xué)鑒定

供試野生菌株采自于湖南省沅江市天下第一蘆葦蕩（圖1），子實(shí)體長(zhǎng)于蘆葦?shù)刂校瑢儆诟靖瑓采瑹o菌環(huán)無菌托，體積較小，菌蓋直徑1～3 cm，呈傘形，菌蓋淺黃褐至銹黃色，中間略凸起，表面較光滑有黏液。該菌菌柄中央生，中空?qǐng)A柱狀，略彎，長(zhǎng)2～5 cm，直徑為1.5～3.5 mm，菌柄的顏色為黃白色，比菌蓋顏色略淡。該菌孢子印為褐色。初步認(rèn)定該菌株隸屬于擔(dān)子菌門、蘑菇綱、蘑菇目、球蓋菇科、鱗傘屬，是一種可食用的大型真菌。該菌株經(jīng)PDA純化培養(yǎng)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)潔白且濃密，菌落邊緣整齊，質(zhì)地松軟、無色素產(chǎn)生（圖1c）。菌株Y1的顯微特征與吳芳等[17]探究的鱗傘特征一致。菌株Y1菌絲體為無色，有隔且隔間距不等，有鎖狀聯(lián)合，可分叉出新的菌絲，孢子呈無色，橢圓形，表面無棱角，無凸起（圖2）。

圖1 菌株Y1的子實(shí)體及平板菌絲菌落

圖2 顯微鏡下菌株Y1菌絲及孢子

2.2 野生菌株分子鑒定結(jié)果

基于ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，經(jīng)北京擎科生物科技有限公司測(cè)序，菌株Y1的序列為

CATTTGGGATGACTTGGTATGATTGTTGCTGGTCCTTTT GGGACATGTGCACATCTGCCATCTTTATATCTCCACCTGTGCA CACTTTGTAGGTCTGGAATAAGTATCTGGGGTAACTCAGTTGT TGGAATTGCTGCTGCAAAGTAGCTTTTCTTGTGATTCTAGATC TATGTTTTCATATACACCATAAAAATGTAACAGAATGTATTAA TGGGTGTTGTACCTATAAACTATATACAACTTTCAGCAACGGA TCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT AAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTG AACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTT TGAGTGTCATTAAATTCTCAATCTTACCATCTTTTATTAGTTG GGAAAGAGTTGGATGTGGGGGGAAATTTTTGAAGGTTTTTCGA AGCCTTCTCCCCTGAAATGCATTAGCTGGATGCTCGCGCGGAC AGTCTATTGGTGTGATAATTATCTATGCCATTAGCTGACTGCC ATTAGTAGCTCTGCTTCTAACTGTCTTTGGACAATTTATGACA ATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCA TATCAATAAAGCCGGAGGAACTTTT

經(jīng)BLAST在線對(duì)比，該序列與Pholiota conissans的相似性為99.38%。使用MEGA 11軟件將所下載序列與菌株Y1序列進(jìn)行對(duì)比分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3。該野生菌株Y1的ITS序列與硫黃鱗傘聚為一支，可以確定其為硫黃鱗傘。

圖3 基于ITS序列的菌株Y1系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 光照強(qiáng)度對(duì)硫黃鱗傘Y1菌絲生長(zhǎng)的影響

由表1可知，光照強(qiáng)度在0～2 000 lx硫黃鱗傘Y1菌絲均能生長(zhǎng)，菌絲較為潔白，但不同光照強(qiáng)度菌落直徑有所差異。無光照下菌落直徑及菌絲長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于其他處理，說明該硫黃鱗傘Y1在菌絲生長(zhǎng)階段不需要光照，過強(qiáng)的光照對(duì)菌絲的生長(zhǎng)具有抑制作用（圖4）。

表1 光照強(qiáng)度對(duì)硫黃鱗傘Y1菌絲生長(zhǎng)的影響

圖4 不同光照強(qiáng)度下硫黃鱗傘Y1菌株菌落形態(tài)

2.3.2 培養(yǎng)溫度對(duì)硫黃鱗傘Y1菌絲生長(zhǎng)的影響

由表2可知，供試硫黃鱗傘菌株在19～31 ℃均可生長(zhǎng)，19～28 ℃菌絲生長(zhǎng)逐漸加快，31 ℃菌絲生長(zhǎng)緩慢，25 ℃、28 ℃菌落直徑明顯大于其他處理，其中28 ℃菌落直徑最大，但25 ℃的菌絲長(zhǎng)勢(shì)較28 ℃更為濃密且粗壯（圖5）。

表2 溫度對(duì)硫黃鱗傘Y1菌絲生長(zhǎng)的影響

表3 不同碳源對(duì)硫黃鱗傘Y1菌絲生長(zhǎng)的影響

圖5 不同溫度下硫黃鱗傘Y1菌株菌落形態(tài)

2.3.3 不同碳源對(duì)硫黃鱗傘Y1菌絲生長(zhǎng)的影響

由表4可知，供試硫黃鱗傘菌株在5種供試碳源培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，碳源為蔗糖培養(yǎng)基的菌落平均直徑最大，顯著大于甘油、葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉培養(yǎng)基（圖6），因此確定蔗糖為最適碳源。

表4 不同氮源對(duì)硫黃鱗傘Y1菌絲生長(zhǎng)的影響

圖6 不同碳源培養(yǎng)基上硫黃鱗傘Y1菌落形態(tài)

2.3.4 不同氮源對(duì)硫黃鱗傘Y1菌絲生長(zhǎng)的影響

由表4可知，供試硫黃鱗傘菌株在除尿素以外的4種供試氮源培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)。含蛋白胨培養(yǎng)基中菌落直徑和菌絲長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于其他氮源培養(yǎng)基（圖7），因此蛋白胨為硫黃鱗傘Y1最適氮源。

圖7 不同氮源培養(yǎng)基上硫黃鱗傘Y1菌落形態(tài)

2.3.5 不同無機(jī)鹽對(duì)硫黃鱗傘Y1菌絲生長(zhǎng)的影響

由表5可知，供試硫黃鱗傘菌株在供試無機(jī)鹽培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，氯化鈉和硫酸鉀培養(yǎng)基中硫黃鱗傘Y1的菌落直徑明顯小于硫酸鎂培養(yǎng)基。磷酸二氫鉀、硫酸鎂培養(yǎng)基中硫黃鱗傘Y1的菌落直徑無顯著差異，但菌絲長(zhǎng)勢(shì)不同（圖8）。

表5 不同無機(jī)鹽對(duì)硫黃鱗傘Y1菌絲生長(zhǎng)的影響

2.3.6 pH對(duì)硫黃鱗傘Y1菌絲生長(zhǎng)的影響

由表6可知，硫黃鱗傘Y1在pH為9時(shí)，菌絲不萌發(fā)；在pH為5～8的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其中pH為5、6時(shí)菌落直徑和菌絲長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于其他處理（圖9），因此pH 5～6為最適pH。

表6 不同pH下硫黃鱗傘Y1菌絲生長(zhǎng)情況

圖9 不同pH下硫黃鱗傘Y1菌落形態(tài)

2.4 不同附加基質(zhì)對(duì)硫黃鱗傘Y1液體菌絲生物量的影響

由圖10可知，CK與5種附加基質(zhì)的發(fā)酵液均為黃色且澄清，菌絲均可形成新菌絲球，菌絲球形狀不規(guī)則且呈黃色絨毛狀，界限分明，各處理菌絲球大小差異顯著（P＜0.05）。其中麩皮、玉米和蘆葦發(fā)酵液中菌絲球大小均一，稻草與木屑發(fā)酵液菌絲球不均一。與CK相比，麩皮、蘆葦和玉米芯發(fā)酵液均能提升菌絲生物量，麩皮發(fā)酵液菌絲球密度相對(duì)較大，效果最優(yōu)，菌絲生物量最大，為494 mg（/100 mL）（圖11），而稻草和木屑對(duì)硫黃鱗傘Y1菌絲生長(zhǎng)有抑制作用。各附加基質(zhì)對(duì)硫黃鱗傘Y1菌絲生物量的影響為麩皮＞蘆葦＞玉米芯＞CK＞稻草＞木屑。

圖10 添加附加基質(zhì)后液體培養(yǎng)硫黃鱗傘Y1菌液形態(tài)

圖11 添加附加基質(zhì)后硫黃鱗傘Y1液體菌絲生物量

3 小結(jié)

研究通過結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列對(duì)Y1菌株進(jìn)行分類鑒定，最終確定該野生菌株Y1為硫黃鱗傘（Pholiota conissans）。

硫黃鱗傘Y1菌絲在無光照條件下生長(zhǎng)最佳，固體培養(yǎng)基培養(yǎng)最優(yōu)條件為培養(yǎng)溫度25 ℃，碳源為蔗糖，氮源為蛋白胨，pH 5，無機(jī)鹽為磷酸二氫鉀和硫酸鎂。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基添加0.3%的麩皮對(duì)硫黃鱗傘Y1菌絲生物量累積有一定的促進(jìn)作用。試驗(yàn)結(jié)果為硫黃鱗傘Y1的開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支撐。