幾種植物醇提物對血耳木霉病原菌抑菌試驗(yàn)

程 旭 隋 哲 田朋姣 劉興樂 楊 青 王文建 張 舒 王佐乾* 余海忠*

（1 襄陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北襄陽 441053；2 湖北文理學(xué)院，湖北襄陽 441053；3 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北武漢 430064）

食用菌產(chǎn)業(yè)已成為繼糧、油、果、菜后的第五大產(chǎn)業(yè)，是我國重要的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)之一，已成為鄉(xiāng)村振興尤其是偏遠(yuǎn)山區(qū)農(nóng)民增收致富的重要途徑[1]。2021年全國食用菌總量達(dá)4 133.94萬t，總產(chǎn)值達(dá)3 475.63億元，中國食用菌占全球食用菌總產(chǎn)量的85%以上[2]。血耳（Tremella sanguinea）隸屬銀耳屬（Tremella），是一種珍稀食用菌，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值，深受消費(fèi)者歡迎。目前血耳人工段木栽培的技術(shù)剛實(shí)現(xiàn)突破，產(chǎn)地主要集中在湖北省保康縣，2021年栽培總量約5萬棒段木，年產(chǎn)值約500萬元，并呈現(xiàn)逐年遞增的態(tài)勢，“保康血耳”也獲中國地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。

但是，目前血耳生產(chǎn)中出現(xiàn)的木霉病害，已成為制約其規(guī)模化生產(chǎn)的主要因素之一。木霉病害是一種典型的競爭性病害，會造成母種、原種、栽培種、段木菌棒、栽培袋的污染，常見的木霉病害至少有6種[3-4]。木霉（Trichodermasp.）可侵染平菇、茶樹菇、香菇、銀耳、杏鮑菇、毛木耳、靈芝等多種食用菌的培養(yǎng)料、菌絲和子實(shí)體，是食用菌生產(chǎn)中的第一大污染菌[5]。不同產(chǎn)地食用菌感染的木霉種類各有不同，其中綠色木霉與哈茨木霉是優(yōu)勢菌種。木霉侵染主要表現(xiàn)為產(chǎn)生綠色、青綠色或者黃綠色霉層，它不僅污染菌種和培養(yǎng)料，造成菌種或菌袋報廢，同時還可寄生在食用菌菌絲和子實(shí)體上引起寄生性病害[6]。據(jù)報道，由木霉造成的食用菌病害每年平均發(fā)病率為8%，食用菌損失率40%～50%，有時高達(dá)80%，甚至導(dǎo)致絕收[7]。

試驗(yàn)以血耳生產(chǎn)中最常見的綠色木霉（Trichoderma viride）為靶標(biāo)病原物，以鄂西北地區(qū)常見的四種植物60%乙醇提取物為供試藥液，考察其對為害血耳的木霉病害抑制效果，以期開發(fā)出綠色無公害的木霉病害專用植物源殺菌劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試植物：襄麥冬（L.spicatavar.prolifera）須根采自襄陽市歐廟鎮(zhèn)，魚腥草（H.cordata）、貓眼草（E.lunulata）、五香菜（H.moslae）全草，采自襄陽市臥龍鎮(zhèn)。按以下步驟對上述樣品進(jìn)行處理：自來水沖洗，蒸餾水潤洗，晾干，65 ℃烘干后，150目粉碎，密封，置于4 ℃保存待用。

（2）供試菌株：綠色木霉（T.viride）菌株，從血耳段木上分離提純。

（3）耗材與設(shè)備：60%乙醇，葡萄糖，瓊脂粉，生理鹽水；FZ-102微型植物粉碎機(jī)；GZX-9030-MBE電熱恒溫干燥箱；YSQ-LS-30SII壓力蒸汽滅菌器；RE-52 AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；AL204電子天平；熱電微量移液器；KQ-100B型超聲波清洗器；HZ-9211K振蕩器；XB-K-25血細(xì)胞計數(shù)板；SA3000型顯微鏡。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 初始藥液的配制

采用超聲波醇提法，提取供試植物醇提物：分別稱取粉碎物10 g左右，加入500 mL 60%乙醇浸泡24 h，再經(jīng)超聲波提取30 min，抽濾。濾渣分別用150 mL 60%乙醇浸泡48 h、72 h后，再經(jīng)超聲波各處理30 min，抽濾，合并三次濾液，減壓濃縮得浸膏，置4 ℃?zhèn)溆谩o菌條件下，將上述4種浸膏分別用60%乙醇配成初始體積質(zhì)量濃度為0.3 g/mL、0.15 g/mL、0.075 g/mL、0.035 g/mL、0.017 5 g/mL的初始藥液。

1.2.2 木霉菌絲生長速度測定[8]

無菌條件下，用滅菌后的打孔器（直徑=7 mm）打出一定數(shù)量的綠色木霉菌餅，備用。PDA培養(yǎng)基滅菌后，晾至45 ℃左右取9 mL培養(yǎng)基，分別與1 mL上述初始藥液或60%乙醇（CK）混勻，然后倒平板，使得上述醇提物的藥液終濃度為0.03 g/mL、0.015 g/mL、0.007 5 g/mL、0.003 5 g/mL、0.001 75 g/mL。將綠色木霉菌餅分別放置在處理組和對照組平板上，菌絲一面向下，每皿接3餅，置于28 ℃培養(yǎng)。待對照組菌絲長至平板一半長度時，后采用十字交叉法測量菌落直徑，分別計算藥液對菌落的生長抑制率。

1.2.3 孢子懸浮液測定[9]

無菌條件，用生理鹽水沖洗長滿綠色木霉孢子的平板，過濾，得孢子懸浮液。取6個裝有8 mL PDA液體培養(yǎng)基的錐形瓶，分別加入1 mL孢子懸浮液，再分別加入1 mL不同體積質(zhì)量濃度的初始藥液或60%乙醇（CK），使得上述醇提物的藥液終濃度達(dá)到0.03 g/mL、0.015 g/mL、0.007 5 g/mL、0.003 5 g/mL、0.001 75 g/mL，置28 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)。

對照組孢子萌發(fā)（孢子芽管長度大于孢子短半徑者為萌發(fā)）后，用無菌水稀釋到適當(dāng)倍數(shù)（10×10低倍鏡下，每個視野30～40個孢子為宜）[10]，移至血細(xì)胞計數(shù)板上，在10×10倍顯微鏡下觀測，計算藥液對孢子萌發(fā)的抑制率：

孢子萌發(fā)抑制率（%）=（對照萌發(fā)數(shù)-處理萌發(fā)數(shù)）/對照萌發(fā)數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理供試綠色木霉菌株的生長菌絲情況

由圖1可知，總體上，雖然襄麥冬醇提物對試驗(yàn)綠色木霉菌株菌絲生長有一定的抑制作用，但抑制效果有限：在觀察的前22 h內(nèi)，處理組菌落直徑增長基本上同對照組（CK），尤其是在菌絲培養(yǎng)14～18 h的菌落直徑基本呈線性增長。此外，在菌絲培養(yǎng)18～22 h，處理組菌落的增長速度呈前期突然升高（曲線斜率突然增大）而后期降低的趨勢。分析其可能的原因?yàn)橄妍湺继嵛镏械囊恍┗钚猿煞直痪G色木霉代謝后將其利用，起到營養(yǎng)增效作用。因此出現(xiàn)菌絲生長加速現(xiàn)象，但是后階段由于培養(yǎng)基的水分、營養(yǎng)等物質(zhì)逐漸被消耗掉，所以菌落增長變緩。

圖1 襄麥冬醇提物作用下綠色木霉菌株的菌落增長情況

由圖2可知，魚腥草醇提物對供試綠色木霉菌株的抑制活性較強(qiáng)，對照組的菌落增長速度較處理組的要快，且不同體積質(zhì)量濃度藥液對綠色木霉的抑制作用差異較大。同襄麥冬醇提物處理一樣，在綠色木霉菌絲培養(yǎng)20 h之后，無論是處理組還是對照組，由于培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，菌落增長速度均開始變緩。

圖2 魚腥草醇提物作用下綠色木霉菌株的菌落增長情況

由圖3可知，總體上，貓眼草醇提物處理組的綠色木霉菌落的增長速度，比襄麥冬醇提物處理組慢，但是比魚腥草醇提物處理的菌落增長快，這反映了其對供試綠色木霉菌株的菌絲生長抑制活性介于襄麥冬醇提物與魚腥草醇提物之間。同樣，在綠色木霉菌絲培養(yǎng)14 h～18 h內(nèi)，其菌落基本屬于線性增長，在20 h以后菌落增長速度變緩。

圖3 貓眼草醇提物作用下綠色木霉菌株的菌落增長情況

由圖4可知，雖然五香菜醇提物對供試綠色木霉菌株菌絲生長有一定的抑制，但是抑制作用不顯著，在菌絲培養(yǎng)前20 h內(nèi)，菌落的直徑增長速度較快，基本上屬于線性增長。

圖4 五香菜醇提物作用下綠色木霉菌株的菌落增長情況

2.2 不同植物醇提物對供試綠色木霉菌株的菌絲生長抑制活性比較

真菌菌絲在培養(yǎng)基上的生長與時間變化是非線性的，分析所用數(shù)據(jù)最好選擇線性生長階段采集的數(shù)據(jù)[11]。由于供試綠色木霉菌株在培養(yǎng)14～18 h內(nèi)菌絲生長速度比較平穩(wěn)，再考慮到其營養(yǎng)狀況（每個平板只含有9 mL的PDA培養(yǎng)基，隨觀測時間延長，會出現(xiàn)菌株?duì)I養(yǎng)不良老化現(xiàn)象），以及供試藥液的藥效活性隨觀測時間延長，可能存在熱分解、光分解現(xiàn)象[12-13]。因此，在統(tǒng)計不同植物醇提物平均抑制率時，只采用培養(yǎng)18～20 h的數(shù)據(jù)。

由表1可知，當(dāng)醇提物體積質(zhì)量濃度不低于0.015 g/mL時，魚腥草、貓眼草醇提物對供試綠色木霉菌株的菌絲生長抑制率均超過30%，且在最高體積質(zhì)量濃度0.03 g/mL時分別達(dá)47.23%、35.97%。襄麥冬和五香菜醇提物對供試綠色木霉菌株的菌絲生長抑制活性較弱，在最高體積質(zhì)量濃度0.03 g/mL時僅為23.89%、23.12%。

表1 不同植物醇提取對綠色木霉菌菌絲生長抑制作用比較

2.3 不同植物醇提物對供試綠色木霉菌株的孢子萌發(fā)抑制活性比較

由表2可知，不同植物醇提物對供試綠色木霉菌株孢子萌發(fā)的抑制作用均隨藥液體積質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。在最高體積質(zhì)量濃度0.03 g/mL時，4種植物醇提取物的抑制活性均超過54%，其中魚腥草的抑制率最高，為78.57%，貓眼草次之，為72.89%，五香菜、襄麥冬的抑制率分別為59.70%、54.07%。在最低體積質(zhì)量濃度為0.001 75 g/mL時，魚腥草、貓眼草對孢子萌發(fā)的抑制率仍超過20%。總體上，4種植物醇提物對供試綠色木霉菌株的孢子萌發(fā)抑制活性，與其對應(yīng)的菌絲生長抑制活性的結(jié)果相一致。

表2 不同植物醇提取對綠色木霉菌株的孢子萌發(fā)抑制作用比較

3 小結(jié)

襄麥冬、魚腥草、貓眼草和五香菜均為鄂西北地區(qū)常見植物種。有報道稱襄麥冬提取物對灰葡萄孢菌、終極腐霉、立枯絲核菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)有較好的抑制作用[14]。此外，研究也發(fā)現(xiàn)魚腥草癸酰（Decanoylacetaldehyde）[15]、貓眼草七葉內(nèi)酯（Aesculetin）及貓眼草素（Maoyancaosu）[16]以及五香菜揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗菌活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，無論是襄麥冬、魚腥草、貓眼草還是五香菜，其醇提物對供試綠色木霉菌株的菌絲生長和孢子萌發(fā)均具有一定的抑制作用，且抑制活性與醇提物的體積質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，均隨藥液濃度的升高而增強(qiáng)。魚腥草、貓眼草的抑制作用最強(qiáng)，在最高體積質(zhì)量濃度（0.03 g/mL），對菌絲生長的抑制率分別達(dá)47.23%、35.97%，對孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)78.57%、72.89%。整體來看襄麥冬醇提物對供試菌株的抑制活性最弱，在最高體積質(zhì)量濃度（0.03 g/mL）對菌絲生長抑制率僅為23.89%，對孢子抑制率為54.07%，顯著低于其他處理組。