基于UPLC-Q-TOF-MS 的龍牡清心合劑成分鑒定及其治療注意缺陷多動障礙的物質基礎研究

李雪軍，姜之炎，肖 臻，陳秀峰，王淑敏，張奕星，蒲文焱

（上海中醫藥大學附屬龍華醫院兒科，上海 200032）

注意缺陷多動障礙以多動/沖動、注意力不集中、學習困難為核心癥狀，且發病率逐年升高，已成為長期困擾兒童身心健康的重大威脅［1］。哌醋甲酯為該病的一線用藥，但存在限制生長、睡眠障礙、誘發抑郁等不良反應，使其在兒科中使用受限［2］。中醫藥以整體調理和辨證論治的優勢在治療本病中取得顯著成效。

中醫認為小兒“脾不足” 而“肝有余”，“脾虛不藏意”，又無以化生氣血，先天失充，土虛木乘或水不涵木，肝魂妄動，故現多動諸癥。龍牡清心合劑針對此病機而設，以黃芪、當歸首調脾之運化； 龍骨、牡蠣、珍珠母、磁石、鉤藤等潛陽斂陰； 甘草、大棗、小麥養心安神； 黃芩、黃柏瀉心火，以求脾土得運、肝陽得潛、心安神寧。前期研究表明該方可顯著改善注意缺陷多動障礙模型小鼠的學習記憶能力，并能減緩腦組織多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE） 含量下降［3］； 臨床上則能顯著控制注意缺陷多動障礙的核心癥狀［4］，但其發揮藥效的物質基礎尚不明確。本研究將采用超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜技術（UPLC-QTOF-MS） 在正、負離子模式下對龍牡清心合劑化學成分進行定性分析，并根據鑒定結果對該方治療注意缺陷多動障礙的物質基礎進行分析，以期為該方的物質基礎研究、質量標準建立提供依據。

1 材料

Waters H-Class 超高效液相色譜儀 （美國Waters 公司）； AB Sciex Triple TOF ? 4600 高分辨質譜（美國SCIEX 公司）； KQ-300 BD 超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）； SIGMA 3K15 高速離心機（美國Sigma 公司）。

龍牡清心合劑為上海中醫藥大學附屬龍華醫院制劑，滬藥制備字Z20210023000，批號2206001，組方黃芪135 g、當歸81 g、煅龍骨270 g、煅牡蠣270 g、珍珠母270 g、磁石270 g、鉤藤135 g、炙甘草50.4 g、大棗270 g、浮小麥135 g、白芍270 g、五味子50.4 g、夜交藤135 g、黃芩81 g、黃柏81 g，上述藥材均購自上海中醫藥大學附屬龍華醫院中藥房，經龍華醫院藥劑科楊銘主任藥師鑒定為正品。取以上15 味藥材，煅龍骨、煅牡蠣、珍珠母、磁石先加水煎煮2 次，每次2 h，再加入當歸等11 味藥，第1 次加5 倍量水煎煮1 h，第2次加4 倍量水煎煮1 h，合并煎液，濾過，靜置36 h，取上清液80 ℃減壓濃縮至2 500 mL，靜置36 h，取上清液80 ℃減壓濃縮至900 mL，加入蔗糖200 g、苯甲酸鈉3 g、羥苯乙酯0.25 g，攪勻、煮沸、過濾，濾液加水定容至1 000 mL，混勻，灌裝，500 mL/瓶，即得。乙腈、甲醇（質譜純，批號I1133829105、I1139035113，美國Merck 公司）；純凈水（批號20220415C，廣州屈臣氏食品飲料有限公司）； 甲酸（質譜純，批號Y6170039，德國CNW 公司）。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 取龍牡清心合劑樣品1 mL，用20%甲醇稀釋2 倍，混勻，12 000 r/min離心5 min，取上清液，即得。

2.2 色譜條件 Waters CORTECS ? UPLC ? T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）； 流動相乙腈（A） -0.1% 甲酸水溶液 （B），梯度洗脫 （0 ～3 min，100% B； 3 ～8 min，100% ～95% B； 8～10 min，95% ～90% B； 10 ～13 min，90% B； 13～15 min，90% ～85% B； 15 ～30 min，85% ～60% B；30～35 min，60% ～40% B； 35 ～38 min，40% ～5%B； 38～41 min，5% B； 41 ～41.1 min，5% ～100%B； 41.1～45 min，100% B）； 柱溫30 ℃，進樣體積2 μL； 體積流量0.3 mL/min； 檢測波長190 ～400 nm。

2.3 質譜條件 采用ESI-Negative/Positive ion mode 質譜檢測模式。TOF 掃描范圍m/z50～1 700；離子源氣體1 ∶50 psi； 離子源氣體2 ∶50 psi； 氣簾氣35 psi； 離子噴涂電壓浮動－4 500/5 000 V；離子源溫度500 ℃； 去簇電壓100 V； 碰撞能10 eV。MS/MS 掃描范圍m/z50 ～1 250； 去簇電壓100 V； 碰撞能±40 eV； 碰撞能量擴散20 eV； 離子釋放延遲30 ms； 離子釋放寬度15 ms。

2.4 數據分析 數據采集軟件為Analyst TF 1.7.1，數據處理軟件為Peakview 1.2。鑒定時優先將質譜數據與 Natural Products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 數據庫（收載了三千多種標準品的多級質譜圖，包括不同采集模式、不同加合離子、不同碰撞能量等） 進行匹配，根據各色譜峰得分信息對化合物進行初步篩選，根據各色譜峰一級、二級信息等對化合物進行進一步確認。數據庫中未收載的化合物，則根據文獻報道、質譜裂解規律等進行鑒定。

3 龍牡清心合劑化學成分鑒定結果

質譜圖見圖1 ～2，采用UPLC-Q-TOF-MS 從龍牡清心合劑中鑒定出40 種化學成分，包括黃酮類11 種、單萜苷類6 種、三萜皂苷類4 種、酚酸類3種、生物堿類6 種以及核苷類、核苷衍生物類、木脂素、二苯乙烯苷類、苯乙酮類、蒽醌、檸檬苦素類各1 種。其中4 種來源于君藥黃芪，4 種來源于當歸，10 種來源于白芍，8 種來源于黃芩，5 種來源于黃柏，6 種來源于甘草，3 種來源于大棗，3種來源于鉤藤，3 種來源于首烏藤，3 種來源于五味子。各成分鑒定結果和藥材歸屬結果見表1。

表1 龍牡清心合劑化學成分鑒定結果Tab.1 Results of chemical composition identification of Longmu Qingxin Mixture

圖1 龍牡清心合劑基峰離子流圖（正離子模式）Fig.1 Base peak ion flow diagram of Longmu Qingxin Mixture （Positive ion mode）

圖2 龍牡清心合劑基峰離子流圖（負離子模式）Fig.2 Base peak ion flow diagram of Longmu Qingxin Mixture （negative ion mode）

3.1 黃酮類 從龍牡清心合劑鑒定出11 種黃酮類化合物，主要來自黃芪、黃芩和甘草。黃酮類化合物具有C6-C3-C6的基本骨架，質譜裂解規律大多相似，主要通過糖苷鍵斷裂、C 環逆狄爾斯-阿爾德（RDA） 裂解重排、脫去中性碎片、丟失羰基、糖環裂解等方式裂解，負離子模式下響應較好［18］。如化合物19 在負離子模式下（tR＝22.13 min） 測得準分子離子m/z445.076 4 ［M－H］－，預測分子式為C21H18O11，二級質譜掃描得到碎片離子m/z269.045 6，比準分子離子峰少176，是準分子離子丟失C6H8O6后形成的碎片，對比數據庫并結合文獻［12］ 報道，鑒定該化合物為黃芩苷，二級質譜圖及可能的裂解方式見圖3。

圖3 黃芩苷MS2 圖譜（A） 及可能的裂解途徑（B）Fig.3 MS2 map （ A） and possible fragmentation pathway （B） of baicalin

3.2 單萜苷類 從龍牡清心合劑得到單萜及其苷類化合物共6 種，均來自白芍，主要為芍藥苷及其衍生物，在質譜裂解中常丟失H2O 和CH2O 分子，或失去糖基分子，受功能基的影響，又常出現丟失苯甲酸的離子碎片［19］。如化合物9，負離子模式下（tR＝16.41 min） 測得加合離子峰為m/z525.162 5 ［M＋FA-H］－，m/z479.155 5 為該化合物的準分子離子峰，預測分子式為C23H28O11，其在裂解過程中丟失1 分子甲醛得到m/z449.144 4碎片離子，繼而失去1 分子苯甲酸形成m/z327.107 4 碎片離子，m/z165.055 5 為蒎烷基本骨架結構的碎片離子，是該類化合物常產生的特征性碎片離子，m/z121.029 1 是蒎烷基本骨架與苯甲酰取代基相連處斷裂所得的碎片離子。根據裂解規律、數據庫對比及文獻［10］ 報道，鑒定該化合物為芍藥苷，二級質譜圖及可能的裂解方式見圖4。

圖4 芍藥苷MS2 圖譜（A） 及可能的裂解途徑（B）Fig.4 MS2 map （A） and possible fragmentation pathway（B） of paeoniflorin

3.3 三萜皂苷類 三萜皂苷類化合物主要有甘草皂苷E2、甘草皂苷G2、黃芪甲苷、甘草酸，主要來源于甘草和黃芪。該類化合物易發生糖苷鍵的斷裂，丟失鼠李糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸 （GlcA）等糖基，在高能量狀態下，常常丟失H2O、CO等中性基團［20］。例如化合物35，負離子模式下（tR＝29.53 min） 檢測到m/z829.458 9 ［M ＋FAH］－的加合離子峰，預測化學式為C41H68O14，二級質譜得到碎片離子m/z783.448 7，為該化合物的準分子離子峰，通過丟失葡萄糖殘基生成碎片離子m/z621.404 7，繼而丟失木糖殘基形成碎片離子m/z489.360 7，為環黃芪醇型皂苷類化合物在負離子模式下的診斷離子［21］。根據以上信息鑒定該化合物為黃芪甲苷，二級質譜圖及可能的裂解方式見圖5。

圖5 黃芪甲苷MS2 圖譜（A） 及可能的裂解途徑（B）Fig.5 MS2 map （ A） and possible fragmentation pathway （B） of astragaloside Ⅳ

3.4 酚酸類 從龍牡清心合劑鑒定出的酚酸類化合物包括沒食子酸、3-O-阿魏酰奎寧酸、阿魏酸。酚酸類化合物基本結構是酚羥基取代的芳香環、丙烯酸、脂類和萜類氨基酸等成分，主要以負離子［M－H］－形式存在，裂解過程中易丟失H2O 和COOH。當化合物結構中含有阿魏酸或沒食子酸時，易發生阿魏酰基或沒食子酸殘基的丟失［22］。例如化合物5，負離子模式下（tR＝12.97 min） 檢測到m/z367.104 9 ［M－H］－的準分子離子峰，預測化學式為C17H20O9，二級質譜檢測到特征性碎片離子m/z193.050 6，為準分子離子峰脫去奎寧酸得到的阿魏酰殘基，隨后碎片離子m/z193.050 6失去COOH 得到到碎片離子m/z134.037 6，對比數據庫，結合碎片離子特征及文獻［9］ 報道，鑒定該化合物為3-O-阿魏酰奎寧酸，二級質譜圖及可能的裂解方式見圖6。

圖6 3-O-阿魏酰奎寧酸MS2 圖譜（A） 及可能的裂解途徑（B）Fig.6 MS2 map （ A） and possible fragmentation pathway （B） of 3-O-feruloylquinic acid

3.5 生物堿類 從龍牡清心合劑共鑒定出6 種生物堿，主要來自黃柏、鉤藤和大棗。此類化合物因結構中含有氮原子，故在正離子模式下易發生裂解。鉤藤堿和異鉤藤堿為鉤藤中重要的四環單萜氧化吲哚生物堿，裂解后形成較穩定的特征性碎片離子m/z160.075 8。如化合物20 在正離子模式下（tR＝22.22 min） 測得準分子離子峰m/z385.213 0［M＋H］＋，預測分子式為C22H28N2O4，在相繼失去CH3OH、C4H5O2及C7H12N 后生成碎片離子m/z353.185 3、m/z269.163 9、m/z160.07 5，與文獻［14］ 報道一致，故推測其為鉤藤堿，二級質譜圖及可能的裂解方式見圖7。

圖7 鉤藤堿MS2 圖譜（A） 及可能的裂解途徑（B）Fig.7 MS2 map （A） and possible fragmentation pathway （B） of rhynchophylline

3.6 其他類 除以上化合物外，還得到核苷及核苷衍生物類、木脂素類、二苯乙烯苷類等化合物。核苷類物質是由堿基及核糖通過糖苷鍵連接而成的小分子化合物，參與DNA 代謝，是生物細胞維持生命活動的基本組成元素，根據堿基的不同分為嘌呤核苷和嘧啶核苷。本實驗得到的核苷及其衍生物主要來源于大棗。化合物2 正離子模式下（tR＝22.22 min） 準分子離子峰為m/z268.103 1 ［M＋H］＋，推測其化學式為C10H13N5O4，二級質譜掃描碎片離子m/z136.061 6、m/z119.035 3，為準分子離子峰相繼失去C5H8O4和NH3所得，對比數據庫和文獻［5］ 報道，鑒定為腺苷，也是所有藥材共有的成分，二級質譜圖及可能的裂解方式見圖8。

圖8 腺苷MS2 圖譜（A） 及可能的裂解途徑（B）Fig.8 MS2 map （ A） and possible fragmentation pathway （B） of adenosine

4 龍牡清心合劑治療注意缺陷多動障礙的物質基礎

4.1 黃酮類 UPLC-Q-TOF-MS 分析表明，黃酮類成分是龍牡清心合劑中的主要化合物，其中，黃芩苷、黃芩素、芒柄花黃素等在治療注意缺陷多動障礙中效果顯著。龍牡清心合劑的黃酮類成分主要來自黃芩、黃芪和甘草； 黃芩起到瀉心火、以防肝火傳心的作用； 黃芪、甘草則益氣健脾和中，三者補瀉結合，以運脾健脾為主，充養先后天之本，以達到減緩多動/沖動、改善學習記憶的目的。

4.1.1 黃芩苷 在負離子模式下 （tR＝22.13 min），根據質譜掃描碎片、裂解規律，鑒定化合物19 為黃芩苷。黃芩苷是唇形科植物黃芩的主要有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌、鎮痛、調節腸道菌群等廣泛的生物活性，也是中樞神經系統領域研究較為廣泛的化合物［23］。研究表明，黃芩苷能夠快速通過血腦屏障，調節大腦前額葉、紋狀體、海馬等區域的DA 系統，維持腦內DA 含量的穩定，進而減輕注意缺陷多動障礙核心癥狀，并呈劑量依賴性［24］。黃芩苷調控DA 系統治療注意缺陷多動障礙的機制是多方面的［25-27］： ①黃芩苷能改善注意缺陷多動障礙模型大鼠腦突觸體ATP 酶、LDH 活性，為DA 合成代謝提供能量； ②通過激活DA 經典下游信號通路——AC/cAMP/PKA 信號通路，上調腦突觸體AC、cAMP、PKA 表達，并抑制多巴胺D2 受體短鏈部分 （D2RS） 對AC/cAMP/PKA 信號通路的抑制作用，反饋性地促進DA 合成； ③黃芩苷能上調注意缺陷多動障礙模型大鼠紋狀體DA 釋放相關因子突觸相關蛋白25（SNAP25）、突觸結合蛋白1α （Synataxin 1α） 及囊泡轉運蛋白Ⅱ型（VMAT2） 蛋白表達，確保DA順利釋放至突觸間隙，并與突觸后膜特異性受體結合完成信號傳遞，這一過程直接決定了突觸間隙DA 濃度； ④黃芩苷還可通過調控鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ） 及細胞外信號調節激酶（ERK1/2） 的表達而調節DA 的釋放及清除。黃芩苷對DA 合成、釋放、傳遞的調節，是治療注意缺陷多動障礙的重要途徑，也是目前研究最廣泛的治療注意缺陷多動障礙黃酮類化合物； 此外，黃芩苷還可減輕注意缺陷多動障礙的神經炎癥反應，是龍牡清心合劑治療注意缺陷多動障礙重要物質基礎之一。

4.1.2 黃芩素 化合物31，在負離子模式下（tR＝26.89 min） 測得準分子離子峰為m/z269.045 7 ［M－H］－，推測化學式為C15H10O5，二級質譜掃描得到碎片離子m/z251.033 8、241.049 6、223.038 5、195.065 0，鑒定該化合物為黃芩素［28］。黃芩素為黃芩苷的初級代謝產物，兩者在結構上的區別在于7-位取代基，前者為酚羥基，后者為糖苷。黃芩素具有與黃芩苷相似的藥理活性，也可通過調控AC/cAMP/PKA 信號通路，上調前額葉皮質AC、cAMP、PKA 的表達，從而減少注意缺陷多動障礙模型大鼠的自發性活動及沖動行為，并改善其學習記憶能力［29］。黃芩素可協助黃芩苷發揮治療作用，二者對神經系統的共同保護作用，可能是龍牡清心合劑治療注意缺陷多動障礙的重要作用靶點。

4.1.3 芒柄花黃素 化合物32，負離子模式下（tR＝28.26 min） 測得準分子離子峰m/z267.067 3［M－H］－，推測化學式為C16H12O4，根據特征性碎片離子m/z252.042 8、223.040 6、195.045 2，鑒定該化合物為黃芪的有效成分芒柄花黃素［30］。芒柄花黃素是一種典型的植物雌激素，可通過抗炎、抗氧化、抗凋亡機制發揮神經保護、改善神經認知、增加學習記憶的作用［31］。通過恢復DA 系統和5-羥色胺的失衡狀態，芒柄花黃素可降低單胺類神經遞質代謝產物，從而改善松果體韁微注射鵝膏氨酸（一種神經毒素） 誘導的幼齡期SD 大鼠的多動樣行為［32］。黃芪作為龍牡清心合劑君藥，可改善注意缺陷多動障礙的核心癥狀［33］，其發揮藥效的物質基礎可能與芒柄花黃素有關。

此外，鑒定出的千層紙素A 可拮抗γ-氨基丁酸-A （GABA-A） 受體，增強DA 神經傳遞并抑制體外DA 再攝取而控制注意缺陷多動障礙模型大鼠核心表現［34］。綜上所述，黃酮類成分是龍牡清心合劑中的主要化合物，可能是該方治療注意缺陷多動障礙的主要物質基礎。

4.2 三萜皂苷類 從龍牡清心合劑中鑒定出的三萜皂苷類成分主要來自黃芪和甘草，黃芪作為龍牡清心合劑的君藥，對促進脾胃運化，預防肝病傳脾發揮重要作用； 甘草作為佐使藥，可協助黃芪和中緩急。

負離子模式下（tR＝29.53 min） 鑒定化合物35 為黃芪甲苷，即黃芪皂苷Ⅳ，是黃芪的主要皂苷類成分，在改善注意缺陷多動障礙神經損傷中起重要作用。研究表明黃芪甲苷可抑制星形膠質細胞及小膠質細胞的過度活化，緩解神經炎癥引起的神經元損傷及認知損害； 抑制線粒體氧化應激，保護神經元免于凋亡，并促進神經修復和神經元再生［35］。動物實驗表明黃芪皂苷可減少注意缺陷多動障礙模型大鼠在曠場實驗中的站立次數、理毛次數及運動軌跡，并增加Morris 水迷宮實驗中的穿越平臺次數，其機制與其上調血清中多巴胺D2 受體、去甲腎上腺素、5-HT 水平有關［36］。黃芪甲苷作為龍牡清心合劑君藥黃芪的有效成分，與黃芪黃酮類成分在保護腦、神經元、神經干細胞、膠質細胞的損傷方面發揮著巨大的優勢，可能是龍牡清心合劑治療注意缺陷多動障礙的關鍵物質基礎，但尚需通過體內、體外實驗進一步驗證黃芪甲苷治療注意缺陷多動障礙的關鍵機制。

4.3 生物堿類 本研究中鑒定的生物堿主要來自鉤藤，包括異鉤藤堿、鉤藤堿、小檗堿、育亨賓堿，具有神經保護、抗抑郁、降壓、保護心肌、抗炎、平喘、殺菌、抗病毒、改善糖脂代謝等作用［37］。鉤藤是龍牡清心合劑中平肝熄風之要藥，又可鎮靜安神，常用于注意缺陷多動障礙等“肝風” 疾病的治療。

正離子模式下（tR＝22.22 min），鑒定化合物20 為鉤藤堿，是鉤藤中含量最豐富的生物堿。鉤藤堿對神經細胞的修復功能已使其廣泛用于神經退行性疾病（阿爾茲海默病、帕金森）、神經發育障礙性疾病（注意缺陷多動障礙、抽動穢語綜合征）的治療。體外研究表明，鉤藤堿可促進DAT 敲除小鼠神經元細胞培養液中單胺氧化酶活性，從而促進DA 代謝并升高腦源性神經營養因子（BDNF）的表達而達到治療注意缺陷多動障礙的作用［38］，也是龍牡清心合劑的主要物質基礎之一。

綜上所述，龍牡清心合劑治療注意缺陷多動障礙的物質基礎主要集中于黃酮類、三萜皂苷類和生物堿類，其中，黃芩苷、黃芩素、芒柄花黃素、黃芪甲苷、鉤藤堿在減輕注意缺陷多動障礙神經損傷方面優勢顯著； 其他成分，如芍藥苷、阿魏酸、五味子醇甲、二苯乙烯苷的神經保護作用均已得到證實，未來的研究可能需重點關注這些成分在防治注意缺陷多動障礙中的價值。

5 討論與結論

龍牡清心合劑療效顯著，副作用可控，但成分復雜。本研究首次對該方的化學成分進行鑒定分析，共鑒定出40 種化合物，以黃酮類成分最為豐富，其次為單萜苷類和生物堿類，這些成分通過調控與DA 合成、釋放、清除等相關通路，維持腦組織DA 含量穩定，進而緩解注意缺陷多動障礙核心癥狀，可能是龍牡清心合劑的主要物質基礎。作為本方的君藥，黃芪通過清除自由基、抗氧化、調控DA 系統等發揮對神經元、神經干細胞和膠質細胞的保護作用［34］，其有效成分黃芪皂苷在控制注意缺陷多動障礙異常行為表現方面作用突出，作為皂苷類成分之一，黃芪甲苷的藥理學研究將是下一步研究的重點方向。

綜上所述，本實驗明確了龍牡清心合劑的化學成分，分析了其治療注意缺陷多動障礙可能的物質基礎，為該方的臨床應用提供了科學依據，有望為開展大樣本、多中心臨床隨機對照研究提供基礎，進一步證實中藥在防治注意缺陷多動障礙中的安全性和有效性，從而減少兒童使用神經興奮類制劑的不良反應，也為下一步拆方和單體藥理學研究提供了依據； 物質基礎的鑒定也提示可將黃芪甲苷、黃芩苷、鉤藤堿等作為龍牡清心合劑質量控制和優化的參考標準，這較以往單純以黃芪甲苷為該合劑的質量控制標準更嚴謹、更精確，進一步體現了中藥多成分、多靶點的特點。

本實驗尚有不足之處，作為本方潛鎮肝陽的主要物質，龍骨、牡蠣等礦物質成分未能檢測出，可能與其難溶于水、無法達到最低檢測限有關。但從中藥性能而言，此類礦石性寒涼，可減緩黃芪、當歸等滋補之品助陽化熱，加劇“陽有余” 的病理狀態； 又因其質地沉重、味澀平、歸肝經，可使全方藥力趨下，深到病灶，收斂肝性，制其偏亢。故而考慮礦石類制品的藥性與其本身性質相關，而不在于成分含量檢測。