TRAF4和Eg5在卵巢癌組織中的表達及其臨床意義

陳媛琳 羅 婷 彭子萍

卵巢癌是女性生殖道比較致命的惡性腫瘤,可發生在任何年齡段[1]。卵巢癌的發病比較隱匿,早期無明顯的體征和癥狀,一經確診就被診斷為癌癥晚期,其中有65%以上的患者確診時已為Ⅲ期或Ⅳ期,癌灶已經在腹腔內彌散轉移,而且晚期卵巢癌患者的5年生存率只為20%[2],預后較差,是威脅女性健康的主要腫瘤。TRAF4屬于腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAFs)家族的一員,是一類重要的胞漿銜接蛋白[3]。TRAF4早期在乳腺癌的轉移淋巴結中被發現,后發現在多種腫瘤組織中高表達,能夠促進腫瘤的發生和發展,在腫瘤細胞的生物學行為中發揮著至關重要的作用[4]。Eg5 是驅蛋白家族 kinesin-5之一,相關研究表明,Eg5也在多種腫瘤組織中高表達,與腫瘤的發生和預后關系密切[5]。目前,尚未發現關于TRAF4和Eg5在卵巢癌中的相關報道,因此本研究探討TRAF4和Eg5在卵巢癌中的表達以及與臨床病理特征和預后的相關性,為卵巢癌的早期診斷和預后提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2017年5月至2020年6月本院收治的行手術治療的卵巢癌患者術后石蠟包埋組織標本65例。納入標準:有完整的臨床資料;均經過病理學診斷為卵巢癌患者;術前均未進行放療、化療、免疫治療等;均為原發性腫瘤,并為首次手術治療。排除標準:合并心腦血管疾病以及其他惡性腫瘤的患者;卵巢癌轉移的患者;合并急慢性疾病感染和免疫性疾病的患者;存在認知障礙和精神疾病的患者。并選取同期入本院接受手術治療的卵巢上皮性良性病變腫瘤組織36例和因子宮肌瘤行全子宮及附件切除術的正常卵巢組織36例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法 將石蠟標本切成厚度為4 μm的切片,烤片、脫蠟、水化和檸檬酸抗原修復,并加入100 μl的H2O2液,靜止15 min后,采用PBS沖洗后,滴加50 μl的TRAF4和Eg5抗體(福州邁新生物技術開發有限公司),恒溫放置24 h,取出切片,PBS沖洗,二抗和辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液溫孵育30 min,PBS沖洗,二氨基聯苯胺顯色,蘇木精復染,脫水、透明及封片,放置在鏡下觀察。每張切片由2名病理學家進行獨立評估對陽性細胞占比和染色強度進行評分,陽性細胞占比:0%為0分,1%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,76%～100%為4分;染色強度:無著色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分,陽性細胞占比和染色強度相乘分數≥ 4分為陽性表達。

1.2.2 實時熒光定量PCR法 將石蠟標本烤片、脫蠟,加入1 ml Trizol提取總RNA,用紫外分光光度儀測定RNA濃度,使用逆轉錄試劑盒(南京邁克沃德生物科技有限公司)將RNA逆轉錄合成cDNA,進行實時熒光定量PCR反應,TRAF4正向引物序列為5'-TTCACTCT GCTATCTTCATCTGC-3'; 反向引物序列為5'-ATATCGCGCCGCTGTCGCTGCT-3';Eg5正向引物序列為5'-AAATCTTGCCTCCGAGGTG-3'; 反向引物序列為5'-TGGTGCG GTAGATGTCG-3'; PCR總反應體系為20 μl,PCR反應條件:95 ℃,15 min,起始模板變性,95 ℃,10 s,PCR循環模板變性,58 ℃,30 s,退火,72 ℃,30 s,延伸,40個循環。用2-△△Ct法計算TRAF4和Eg5 mRNA相應的數值。TRAF4以1.36為截斷值進行分組,>1.365為TRAF4高表達組(n=34),≤1.36為TRAF4低表達組(n=31);Eg5以1.48為截斷值進行分組,>1.48為Eg5高表達組(n=35),≤1.48為Eg5低表達組(n=30)。

1.2.3 隨訪 以電話或者門診的形式進行隨訪,隨訪的截至日期為2022年7月,計算術后5年總生存率和生存時間,并進行記錄。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 TRAF4和Eg5在卵巢癌組織中的陽性表達

卵巢癌組織中TRAF4和Eg5的陽性表達率明顯高于良性病變組織和正常卵巢組織(P<0.001),良性病變組織中TRAF4和Eg5的陽性表達率明顯高于正常卵巢組織(P<0.001),見表1。

表1 卵巢癌、良性腫瘤及正常卵巢組織中TRAF4和Eg5的表達比較(例,%)

2.2 TRAF4和Eg5 mRNA在各組織中的表達

卵巢癌組織中TRAF4和Eg5 mRNA表達率明顯高于良性病變組織和正常卵巢組織(P<0.001),良性病變組織中TRAF4和Eg5mRNA表達率明顯高于正常卵巢組織(P<0.001),見表2。

表2 卵巢癌、良性腫瘤及正常卵巢組織中TRAF4和Eg5mRNA的表達比較

2.3 TRAF4和Eg5 mRNA水平與卵巢癌臨床病理特征的相關性

不同年齡、組織學類型、腫瘤大小、分化程度的TRAF4和Eg5 mRNA水平對比,差異均無統計學意義(P均>0.05),有淋巴結轉移者TRAF4和Eg5 mRNA水平明顯高于無淋巴結轉移者(P<0.001),FIGO 分期中Ⅲ～Ⅳ期的TRAF4和Eg5 mRNA水平明顯高于Ⅲ～Ⅳ期(P<0.001),浸潤程度T3～T4期TRAF4和Eg5 mRNA水平顯著高于T1～T2期(P<0.001),見表3。

表3 TRAF4和Eg5 mRNA水平與卵巢癌臨床病理特征的關系

2.4 TRAF4與Eg5表達的相關性

Person相關性分析結果顯示,TRAF4與Eg5表達水平呈正相關性(γ=0.326,P<0.001)。

2.5 TRAF4和Eg5對卵巢癌早期診斷效能

繪制TRAF4和Eg5檢測的ROC曲線用于卵巢癌的早期診斷,結果顯示,TRAF4的ROC曲線面積為0.837(95%CI:0.765～0.908,P<0.001),截斷值為1.36時,靈敏度為73.85%,特異度為81.54%;Eg5的ROC曲線面積為0.913(95%CI:0.864～0.961,P<0.001),截斷值為1.48時,靈敏度為87.69%,特異度為81.54%,見圖1。

2.6 TRAF4和Eg5 mRNA對卵巢癌預后的影響

本組病例共隨訪25～60個月,中位隨訪時間為49個月,總生存率為56.92%。Kaplan-Meier曲線分析顯示,TRAF4高表達組患者5年總生存率為47.06%,明顯低于TRAF4低表達組患者(67.74%),差異具有統計學意義(P<0.05);Eg5高表達組患者5年總生存率為42.86%,明顯低于Eg5低表達組患者(73.33%),差異具有統計學意義(P<0.05),見圖2。

圖2 不同TRAF4和Eg5 mRNA水平卵巢癌患者的生存曲線

3 討論

卵巢癌發病率約占女性全身惡性腫瘤的4%,發病率列居第三位,僅次于宮頸癌和宮體癌[6]。另外該病的死亡率也比較高,據不完全統計報道,卵巢癌占全球女性死亡數的4.7%,對女性的生命造成了嚴重的威脅[7]。由于卵巢癌解剖位置處于盆腔的深部,與其他的婦科惡性腫瘤相比,卵巢癌早期癥狀難以發現,而且惡性程度較高,進展快,一經診斷大部分患者已經為臨床晚期,已擴散到子宮雙側附件,大網膜及盆腔各器官,經過治療后復發率較高。因此,尋找新的潛在有效的靶向基因及生物標志物是卵巢癌診斷和治療的關鍵。

TRAF蛋白屬于細胞質調節蛋白家族中的一種,在免疫系統中發揮主要作用[8]。在免疫系統中,TRAF蛋白可調節細胞內NF-kB或者AP-1等信號通路,并激活部分轉錄因子[9]。另外,TRAF4也表達于乳腺癌及轉移病灶的上皮細胞,參與多種信號通路調控和參與細胞的增殖、侵襲和乳腺癌的轉移[10]。TRAF4定位于細胞核,可能是一種轉錄因子。相關研究發現,TRAF4在肺炎癥反應和前列腺癌等癌組織中異常表達[11]。但在卵巢癌中的相關報道較少。本研究結果發現,卵巢癌組織中TRAF4陽性表達率和TRAF4 mRNA明顯高于良性病變組織和正常卵巢組織,有淋巴結轉移的組織中TRAF4 mRNA水平明顯高于無淋巴結轉移的組織,FIGO 分期中Ⅲ～Ⅳ期中TRAF4 mRNA水平明顯高于Ⅲ～Ⅳ期,浸潤度T3-T4期中TRAF4 mRNA水平顯著高于T1-T2期;且對卵巢癌的診斷價值較高,TRAF4高表達組患者的5 年總生存率明顯低于TRAF4低表達組。相關研究表明,TRAF4的基因擴增是TRAF4蛋白在人類腫瘤中高表達的因素之一[12]。從而推斷TRAF4可能在癌癥中的診斷和預后都具有至關重要的作用。

Eg5是一種有絲分裂驅動蛋白,屬驅動蛋白家族成員之一[13]。Eg5基因定位于10q24,E95基因的缺失、突變或者Eg5蛋白的過表達和多種癌癥的發生發展、轉移、浸潤、復發和預后具有一定的相關性[14]。近年來大量的研究發現,Eg5 mRNA的高表達存在于肺癌、直腸癌、乳腺癌和宮頸癌中,這可能與Eg5促進細胞的異常增殖相關[15]。本研究結果發現,卵巢癌組織中Eg5陽性表達率和 Eg5 mRNA明顯高于良性病變組織和正常卵巢組織,有淋巴結轉移的組織中Eg5 mRNA水平明顯高于無淋巴結轉移的組織,FIGO 分期中Ⅲ～Ⅳ期中Eg5 mRNA水平明顯高于Ⅲ～Ⅳ期,浸潤度T3-T4期中Eg5 mRNA水平顯著高于T1-T2期;且對卵巢癌的診斷價值較高,Eg5高表達組患者的5 年總生存率明顯低于Eg5低表達組,說明Eg5也在卵巢癌的診斷和預后中也起著至關重要的作用。相關研究表明,Eg5蛋白在肺癌組織中呈陽性表達;Eg5蛋白高表達與淋巴結轉移密切相關,Eg5陽性提示肺癌患者預后不良。也有研究表明,Eg5在非小細胞肺癌中高表達,高表達與非小細胞肺癌臨床分期及轉移有關,Eg5可預測非小細胞肺癌的淋巴結轉移情況,與本研究結果類似。相關研究通過質譜分析實驗檢測TRAF4可能存在相互作用的待選蛋白,其中包括有絲分裂相關蛋白Eg5[16]。TRAF4在細胞有絲分裂期的表達量高于分裂間期,且在有絲分裂前、中、后、末期均與 Eg5 共定位,干擾 TRAF4的表達,Eg5 蛋白的表達量會降低[17]。本研究進一步通過Person相關性分析驗證了TRAF4和Eg5的相關性,結果表明,TRAF4和Eg5水平呈正相關。但有關TRAF4和Eg5相互作用以及在卵巢癌中的相關機制需要進一步驗證。

綜上所述,TRAF4和Eg5在卵巢癌中高表達,與淋巴結轉移、FIGO 分期和浸潤程度相關,檢測TRAF4和Eg5的表達對于卵巢癌的早期診斷和預后具有一定的診斷價值,有望成為卵巢癌新型藥物治療的靶點。本研究存在一定的不足,關于TRAF4和Eg5相互作用機制未在本研究中進行報道,所以在后續實驗中繼續驗證TRAF4和Eg5相互作用以及在卵巢癌發展中的相關機制。