紅景天苷對類風濕關節炎小鼠缺氧及炎性反應的作用機制

張文廣,李 琴,星 媛

(青海省中醫院風濕科,青海 西寧 810001)

類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)屬于中醫學“痹證”范疇,以邪氣痹阻經脈而致氣血虧虛、肝腎不足、筋骨失養為主要病機[1]。《臨證指南醫案》中對于“痹證”的闡述提示瘀血與痰濁互結貫穿RA整個病程,因此通過治瘀能夠控制RA病情發展[2]。中醫實施個體化的辨證論治,已運用多種重要有效成分和復方湯劑治療RA并在阻止病情發展上取得較大優勢。雷公藤、姜黃素等有效成分已被作為RA治療的重要藥物[3-4]。復方湯劑中生地苦參湯可以協同艾拉莫德緩解RA患者的炎性癥狀,桂枝芍藥知母湯能夠有效改善RA患者關節腫痛,均表現出中醫治療RA的安全性和有效性[5-6]。

紅景天苷是從藥用植物紅景天中提取出的有效藥物成分,具有補腎、行氣養血、扶正固本的療效,而且紅景天苷抗腫瘤、抗疲勞、均衡調節中樞神經、抗應激、抗缺氧功效較好[7]。本研究旨在通過RA模型小鼠探究紅景天苷緩解RA炎癥的分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物基本情況與飼養條件:40只C57BL/6雄性小鼠6～8周齡,體重20～24 g,平均(22±2)g,購自青海生物藥品廠有限公司,許可證號SYXK(青)2023-0002。所有小鼠均在無病原菌的干凈籠子中喂養,籠內添加墊料,給予充足飼料和飲水,保證小鼠能夠自由走動與攝食,所有飲用水和食物均進行了高壓滅菌。飼養環境溫度20～25 ℃、濕度(55±5)%,12 h晝夜循環照明,適應性飼養1周。

1.1.2 主要實驗試劑:紅景天苷(貨號10338-51-9),弗氏完全佐劑(貨號7009),弗氏不完全佐劑(貨號7002),TRIzol(貨號15596-026),cDNA合成試劑盒(貨號6110A),定量PCR反轉錄試劑(貨號RR036Q)。腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA檢測試劑盒(貨號MTA00B),白介素-6(Interleukin-6,IL-6)ELISA檢測試劑盒(貨號M6000B),蘇木素伊紅染液(貨號C0105S),蛋白酶抑制劑PMSF(貨號ST505),蛋白質裂解液RIPA(貨號P0013B),BCA試劑盒(貨號P0009)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模方法與評價:構建膠原蛋白誘導的關節炎(Collagen-induced arthritis,CIA)模型小鼠。2 mg/ml牛Ⅱ型膠原5 ml與等體積的弗氏完全佐劑混合后反復抽吸乳化,向小鼠尾基部皮內注射200 μl弗氏完全佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原進行免疫后,在第21天于尾基部另一部位皮內注射200 μl弗氏不完全佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原加強免疫。按照文獻描述[8]對小鼠關節炎進行評分分級,最高等級為16分。基本標準設定為每只爪子從0～4分表示關節炎嚴重程度:0分為正常關節;1分為輕微腫脹或拇指紅斑;2分為腳部皮膚發紅,輕微腫脹;3分為中度腫脹和紅斑;4分為累及整個后爪或全身的嚴重腫脹和紅斑。將評分超過6分的小鼠判定為造模成功。

1.2.2 分組方法與給藥:隨機抽取10只僅正常攝食飲水而不做任何處理的小鼠作為空白組。30只CIA模型構建成功的小鼠被隨機分成模型組、對照組、實驗組,各組10只。模型組不進行藥物注射僅正常攝食飲水;對照組以5 g/(kg·d)的0.9%氯化鈉溶液灌胃;將25 mg紅景天苷粉末溶解于無菌PBS中配制成5 mg/ml工作液,實驗組使用紅景天苷工作液以5 g/(kg·d)劑量胃內給藥。各組小鼠在第一次免疫后第70天用戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射,進行安樂死,從小鼠身上收集膝關節滑膜組織。

1.2.3 RNA提取和實時熒光定量PCR(RT-qPCR):將小鼠膝關節滑膜組織在研缽中碾碎,用TRIzol提取小鼠滑膜組織總RNA。按照cDNA合成試劑盒的說明進行逆轉錄,之后使用引物和定量PCR反轉錄試劑盒進行RT-qPCR,GAPDH作為內參。引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.2.4 HE染色:將從小鼠關節處分離的滑膜組織固定于4%多聚甲醛后包埋于石蠟中,通過石蠟切片機切成厚度為4 μm的均勻切片。將石蠟切片放在60 ℃烤箱中加熱1 h,依次放入二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、95%酒精5 min、75%酒精5 min中進行脫蠟處理,再用蒸餾水洗滌。用蘇木素染液浸染8 min,蒸餾水沖洗,加1%的鹽酸酒精分化數秒后,蒸餾水沖洗,0.6%氨水返藍,流動清水下沖洗。再將切片放入伊紅染液中染色3 min,蒸餾水沖洗后依次放入95%乙醇Ⅰ 5 min、95%酒精Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min中脫水至透明,切片晾干后用中性樹膠封片。

1.2.5 組織病理學評分[9]:用光學顯微鏡觀察HE染色后病理切片,從滑膜細胞增殖、炎癥細胞浸潤和血管翳形成進行分項評分,分值越高表示損傷越嚴重。滑膜細胞增殖評分標準:0分表示無增殖;1分表示2～4層滑膜細胞,輕微增殖;2分表示4層以上滑膜細胞,中度增殖;3分表示滑膜細胞過度增殖,侵蝕軟骨和骨。炎癥細胞浸潤評分標準:0分表示正常;1分可見少數分散的白細胞浸潤;2分可見2個或2個以上白細胞聚集;3分可見白細胞融合,分散浸潤明顯。血管翳形成的評分標準:0分無血管翳形成;1分有2個部位出現血管翳;2分有4個部位出現血管翳;3分有4個以上部位出現血管翳。

1.2.6 酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA):將小鼠膝關節滑膜組織在研缽中碾碎后,使用含有PMSF的蛋白裂解液RIPA進行蛋白質提取,用BCA試劑盒測定蛋白濃度。根據試劑盒制造商的說明,通過ELISA檢測小鼠滑膜組織中TNF-α、IL-6的含量。

2 結 果

2.1 各組CIA小鼠關節炎評分比較 見表2。模型組CIA小鼠關節炎評分均高于空白組,差異有統計學意義(均P<0.05)。對照組與模型組的關節炎評分比較,差異無統計學意義(P>0.05)。實驗組小鼠在紅景天苷治療10 d后關節炎評分開始下降,治療30 d后關節炎評分表現出顯著的下降趨勢,實驗組各時間點的關節炎評分均低于對照組,差異有統計學意義(P<0.01)。

表2 各組CIA小鼠關節炎評分比較(分)

2.2 各組關節炎小鼠滑膜組織病理變化比較 見表3。通過HE染色對小鼠滑膜組織進行病理學評分,類風濕性關節炎小鼠滑膜組織存在明顯的滑膜細胞增殖、炎癥細胞浸潤、血管翳形成等病理表現。從各組評分情況來看,模型組小鼠滑膜組織病理學各項評分均高于空白組小鼠的評分,差異有統計學意義(P<0.01)。模型組相比,實驗組小鼠在紅景天苷治療后,滑膜增生、炎癥細胞浸潤、血管翳形成均得到改善,實驗組各項評分均低于對照組、模型組,差異有統計學意義(P<0.01)。

表3 各組CIA小鼠滑膜組織病理改變程度評分(分)

2.3 各組關節炎小鼠促炎因子比較 見表4。通過ELISA測定滑膜組織中促炎因子TNF-α、IL-6表達。與空白組比較,模型組、對照組、實驗組CIA模型小鼠滑膜組織中促炎因子TNF-α、IL-6的水平均高于空白組,差異有統計學意義(P<0.05)。模型組CIA模型小鼠滑膜組織中促炎因子TNF-α、IL-6的水平高于對照組、實驗組,差異有統計學意義(P<0.05)。實驗組小鼠通過紅景天苷干預后抑制了TNF-α、IL-6的過度產生,實驗組TNF-α、IL-6水平均低于對照組、模型組,差異有統計學意義(P<0.01)。

表4 各組小鼠滑膜組織中炎癥因子水平比較

2.4 各組CIA小鼠缺氧狀態比較 見表5。RA滑膜組織中的病理特征是缺氧。缺氧誘導因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和核因子E2相關因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)是缺氧適應反應中的主要調節因子。通過RT-qPCR檢測CIA小鼠缺氧情況,見表5。CIA小鼠滑膜組織中HIF-1α mRNA顯著上調,Nrf2 mRNA則降低,表明造模后小鼠滑膜組織存在缺氧狀態。實驗組小鼠在紅景天苷干預后HIF-1α mRNA降低而Nrf2 mRNA升高,且與對照組、模型組比較,差異有統計學意義(P<0.01)。

表5 各組CIA小鼠缺氧相關因子mRNA比較

2.5 各組CIA小鼠PHD2、PP2A、MAPK的mRNA比較 見表6。CIA小鼠模型中PHD2、PP2A和MAPK的mRNA水平顯著上調,模型組與空白組比較,差異有統計學意義(P<0.01),表明RA誘導小鼠滑膜組織中PHD2/PP2A/MAPK信號的過度激活。實驗組小鼠在紅景天苷干預后滑膜組織中PHD2、PP2A、MAPK的mRNA水平均降低,且與模型組、對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05)。

表6 各組CIA小鼠PHD2、PP2A、MAPK的mRNA比較

3 討 論

類風濕性關節炎作為病因不明的慢性侵襲性自身免疫性疾病,基本病理變化為關節滑膜的慢性炎癥、血管翳形成[10]。全身炎癥反應導致的疼痛、關節腫脹和僵硬則大大降低患者生活質量,由于目前缺乏治愈方案,緩解癥狀是治療RA的首要任務,因此減輕臨床癥狀且耐受性較好的治療方案至關重要。

滑膜成纖維細胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)增殖和新生血管生成是RA病情發展的重要環節。缺氧是RA滑膜炎癥發展的重要因素。有研究表明,由于缺氧誘導HIF-1α在滑膜組織中高表達,有助于滑膜中炎癥基因表達和細胞存活[11-12]。鑒于缺氧環境下RA關節滑膜中浸潤的免疫細胞會上調HIF-1α并誘導活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成而加劇滑膜炎癥,因此氧化應激藥物有助于緩解RA炎性癥狀[13]。紅景天為多年生草本植物,主要生長在高海拔的嚴寒、缺氧、晝夜溫差大地區,紅景天苷為其主要有效成分[14]。多項研究證明,減輕缺氧誘導的疾病癥狀可通過抑制氧化應激實現,如應用于糖尿病大鼠視網膜病變的治療[15-16]。氧化應激藥物通過調節HIF-1α相關信號,抑制膽囊癌細胞增殖[17]。氧化應激藥物通過PI3K、HIF-1途徑保護急性缺氧性神經細胞免受損傷[18-19]。本研究結果證實,紅景天苷能有效緩解CIA模型小鼠的缺氧狀態,緩解RA滑膜組織增生、血管再生和炎性癥狀。

RA的疾病進程不外乎因痰瘀致虛,痰瘀膠著關節,閉阻經絡,中醫辨證認為需以化痰通絡、祛除風寒濕邪為主要治療目的[20]。血瘀而致氣虛,在某種程度上可認為是滑膜微血管中氧灌注量減少的表現,免疫炎癥細胞代償性激活炎癥信號以實現適應性生存,導致滑膜的炎性侵襲及代謝減弱。紅景天苷因抗缺氧功效和抗炎功能發揮通經舒絡、活血益氣功效,是緩解RA癥狀的有效藥物。

本實驗構建了膠原蛋白誘導的RA小鼠模型,通過對比模型組和空白組的關節炎評分差異,確定膠原誘導的CIA模型構建成功。再用紅景天苷對CIA模型小鼠進行治療,通過關節炎評分差異證明紅景天對緩解CIA小鼠關節炎癥狀有明顯改善效果。滑膜血管翳形成是RA的核心病理變化,血管新生是產生血管翳的必要條件,內皮細胞的增殖和游走形成新的血管,在RA的早期,炎癥細胞向關節腔遷移和侵襲,滑膜絨毛增生并伴隨著新生血管的形成滑膜增生和炎癥造成關節腔內缺氧狀態,致使HIF-1α激活。接著通過HE染色對比紅景天苷治療與否的CIA小鼠滑膜組織的病理程度改變,結果顯示紅景天苷能顯著減輕CIA小鼠滑膜組織中細胞增殖、炎癥細胞浸潤、血管翳形成,通過ELISA驗證了紅景天苷治療能顯著降低滑膜組織中促炎因子TNF-α、IL-6的表達,進一步實驗結果證實紅景天苷能下調HIF-1α水平,表現為有效緩解CIA模型小鼠的缺氧狀態。因此紅景天苷通過緩解RA滑膜組織增生、血管再生、炎性癥狀和改善缺氧達到治療RA的作用。滑膜組織中FLS缺氧是RA疾病進展的重要因素,缺氧誘導的HIF-1α信號通路上調對于疾病發展起著重要調節作用,因此以HIF-1α信號為靶點的藥物對RA癥狀有明顯改善效果。本研究結果表明,紅景天對HIF-1αmRNA水平有顯著抑制作用,于是之后對其中的分子機制進行探究。

脯氨酰羥化酶結構域蛋白(Prolyl hydroxylase domain proteins,PHD)是利用氧靶向HIF-1、HIF-2的α亞基進行蛋白酶體降解的酶,缺氧誘導PHD活性下降從而實現HIF蛋白穩定性,啟動包括血管生成、ROS清除等適應性反應[21]。已有證據表明,PHD2活化是由蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A,PP2A)介導,在血管生成中發揮重要作用[22]。PP2A在細胞凋亡、增殖等多種細胞過程中具有調節作用,涉及的途徑包括抑制MAPK途徑調節足細胞的上皮-間充質轉化、PP2A可以與MAPK相互作用調節促進心臟干細胞遷移[23-24]。紅景天苷可提高高原環境下機體的血氧飽和度,增強機體對高原低氧環境的耐受能力,并可抑制氧化應激,調節PHD2/HIF-1α水平[25]。本研究測定了紅景天苷干預后CIA模型小鼠HIF-1α水平變化,結果顯示HIF-1α降低,說明紅景天苷對缺氧的改善效果較好。基于PHD2對HIF-1α轉錄調控[26],本研究進一步驗證了紅景天苷對PHD2/PP2A/MAPK信號通路的抑制作用,且通過體內研究數據結果表明,部分通過PHD2/PP2A/MAPK信號通路調節。

綜上所述,紅景天苷在緩解CIA模型小鼠關節炎癥和滑膜組織增生中效果較好,其中的分子涉及PHD2/PP2A/MAPK信號通路調節。本研究尚未明確紅景天苷抑制PHD2/PP2A/MAPK信號通路的具體分子機制以及對缺氧相關因子的調控是否為通路;紅景天苷是否可以通過其他信號緩解RA炎性癥狀、改善缺氧狀態,這些都需要進一步研究。