高濃度柴油降解菌的篩選、鑒定及降解特性研究

王朝輝，曹 青，李 懌，李 磊，王飛龍，白正偉，賈 苒

(1.中石化煉化工程(集團)股份有限公司洛陽技術研發中心，河南 洛陽 471003；2.河南科技大學基礎醫學與法醫學院)

石油被譽為“工業血液”,在人類生活和社會發展中扮演著重要的角色。然而在石油開采、煉化、貯存、運輸、使用過程中經常會發生原油及各類油品的泄漏,導致土壤、地表水和地下水的污染[1-4]。石油烴污染物具有疏水性、遷移能力強和難生物降解等特征,進入土壤后很難被快速清除,將長期存在于土壤與地下水中,對微生物、動物、植物構成危害,并隨著食物鏈進入人體,損害人類健康[5-6]。因此,亟需對石油烴污染的土壤和地下水開展修復。

石油烴污染場地的修復技術主要有物理修復、化學修復、生物修復以及聯合修復等[7-9]。其中微生物修復技術具有成本低、操作簡便、無二次污染、對污染場地土壤擾動小、工程量小等優點,引起了廣泛的關注[10-11]。能降解石油類物質的微生物種類繁多、數量龐大,但其中有關鮑特氏菌屬(Bordetella)的報道相對較少,且大多只針對鹵代烴、多環芳烴類污染物進行了研究。Wang Fang等[12]發現了兩株鮑特氏菌,其能夠在以1,2,4-三氯苯為唯一碳源的培養基中快速生長并起到良好的降解作用。Abo-State等[13]發現禽鮑特氏菌能夠有效地將萘降解為鄰苯二甲酸、1-壬烯-3-醇以及環氧乙烷等生物毒性較低的中間產物。Patel等[14]發現,通過將鮑特氏菌和假單胞菌、固氮弧菌等構建成降解菌群,對萘、菲、氟蒽和芘等多環芳烴表現出了良好的降解能力。

現有研究大多只報道了鮑特氏菌對氯代烴和多環芳烴的降解能力,對柴油類石油烴的降解研究鮮有報道,因此針對鮑特氏菌進行柴油降解研究可為該菌屬應用于石油烴污染土壤和水體的生物修復提供有力支撐。本研究從某石油化工退役場地石油烴污染土壤中篩選得到一株對柴油具有降解性能的鮑特氏菌,將其命名為Bordetellasp.T3(簡稱T3)。對T3菌株進行鑒定和形態結構表征,考察菌株的生長特性及以對柴油污染物耐受程度和降解特性,確定最適的降解條件,以期為高濃度柴油污染的生物修復和工業化菌劑的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌 種

從某石油化工退役場地的石油烴污染土壤中篩選分離得到。

1.2 原料與試劑

NH4Cl,分析純,天津市風船化學試劑科技有限公司產品;FeSO4·7H2O,分析純,南京化學試劑股份有限公司產品;NaCl,分析純,西隴科學股份有限公司產品;CaCl2,分析純,天津市天達凈化材料精細化工廠產品;K2HPO4和KH2PO4,均為優級純,天津市大茂化學試劑廠產品;瓊脂,生物試劑,德國Biofroxx生物試劑公司產品;胰蛋白胨和酵母浸粉,均為生物試劑,OXOID公司產品;正己烷,分析純,美國Fisher Chemical公司產品。

0號國Ⅵ車用柴油(簡稱0號柴油),購自中國石化銷售股份有限公司貴州貴陽石油分公司。

1.3 培養基

無機鹽培養基:NH4Cl 1 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,NaCl 2 g,CaCl20.1 g,K2HPO41 g,KH2PO41 g,去離子水1 L,pH 7.0。

柴油平板培養基:在無機鹽培養基的基礎上添加20 g/L瓊脂和2 mL 0號柴油。

柴油培養基:若無特別說明,均為無機鹽培養基中添加體積分數1%的0號柴油。

LB培養基:胰蛋白胨10 g,NaCl 10 g,酵母浸粉5 g,去離子水1 L,pH 7.0。

1.4 柴油降解菌的分離純化

從某石油化工退役場地采集石油烴污染土壤作為菌株篩選材料,稱取污染土壤10 g,放入錐形瓶中,加入90 mL無菌水制備成水土混合液,置于30 ℃搖床中以160 r/min的轉速振蕩1 h使土樣中的細菌分散于水中,靜置30 min,上層清液即稀釋倍數為10的菌懸液。取稀釋倍數10的菌懸液,先分別稀釋至倍數為102,103,104倍,然后分別吸取50 μL稀釋倍數為102,103,104的菌液均勻涂布于柴油平板培養基中,37 ℃培養3～5 d,挑取不同菌落形態的單菌落分別接種于LB培養基中振蕩培養[15]。連續培養3次后吸取50 μL菌液接種到柴油培養基中,接種量(φ)為0.1%,7 d后測定柴油的降解率,降解率最高(初始柴油降解率為36.91%)的菌株為T3。以T3進行后續試驗。

1.5 降解菌的形態學及分子生物學鑒定

采用16S rRNA序列分析方法鑒定T3菌株,由華大基因生物科技有限公司完成。

菌落的生長狀況以及形態特征測試按照《常見細菌系統鑒定手冊》進行初步判定,并采用掃描電子顯微鏡(型號Hitachi S3400N)在10 000倍下觀察,測序結果用NCBI Blast程序將拼接后的序列文件NCBI中的已知序列進行同源性比對,利用MEGA11.0軟件構建系統發育樹。菌株保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC),保藏號為CCTCC M 20211642。

1.6 柴油降解率的測定

以正己烷為萃取劑,采用液液萃取的方法,萃取柴油培養基中的柴油,萃取后柴油含量通過氣相色譜儀(型號Agilent 6890N)進行測定。采用Agilent HP-5色譜柱,規格為30 m×0.25 mm×0.25 μm。儀器設置條件為:進樣口溫度320 ℃,不分流進樣;柱箱初始溫度50 ℃,保持2 min,以40 ℃/min的速率升至230 ℃,以20 ℃/min的速率升至320 ℃,保持20 min。載氣為氦氣,氣體流速為2.0 L/min:氫火焰離子化(FID)檢測器;進樣量1 μL。

式中:ρ0是未接種菌的柴油培養基中柴油的質量濃度,mg/L;ρ1是接種菌后柴油培養基中柴油的質量濃度,mg/L。

1.7 降解菌生長曲線的測定

以LB培養基為參比,利用紫外分光光度計在光波波長為600 nm條件下測定菌懸液的吸光度(OD600),通過測定的OD600間接反映T3的生長量。

將T3以接種量(φ)為0.1%接種在LB培養基中,30 ℃、160 r/min震蕩培養。0～20 h,每隔2 h取樣;20 h后,每隔4 h取樣,連續取到40 h。以LB培養基為參比測定OD600值,即可得到降解菌在該條件下的生長曲線。

1.8 影響柴油降解因素試驗

1.8.1接種量

將在LB培養基中培養24 h的T3菌液以接種量(φ)分別為0.5%,1.0%,2.0%,5.0%,10.0%接種于柴油培養基中,在30 ℃、160 r/min條件下振蕩培養7 d,以不接種菌的柴油培養基為對照,測定降解菌的OD600及柴油降解率。

1.8.2環境條件

將T3以接種量(φ)為2%接種至柴油培養基中,考察溫度(20,25,30,35,40 ℃)、體系初始pH(4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0)、外加氮源(氯化銨、尿素、蛋白胨、硝酸鈉,投加質量濃度均為1.0 g/L)、柴油體積分數(0.5%,1%,2%,5%,10%)等因素對降解菌生長和降解效果的影響。所有試驗組的降解條件均為30 ℃、160 r/min振蕩培養7 d,以不接種菌的柴油培養基作為空白對照,測定菌株的OD600及柴油降解率。

2 結果與討論

2.1 降解菌的分離與鑒定

通過柴油平板培養基篩選和分離得到一株柴油高效降解菌T3,其菌落形態和掃描電子顯微鏡照片如圖1所示。由圖1可知:菌落形態為圓形,白色,表面濕滑不透明,邊緣整齊;降解菌為短棒狀結構。

圖1 降解菌T3的形態

以菌株T3的DNA為模板,利用通用引物擴增得到1 039 bp的16S rRNA基因片段。通過在基因序列數據庫中比對分析,發現其與Bordetellapetriistrain DSM 12804的同源性達99.03%。將菌株T3與鮑特氏菌進行系統發育分析(如圖2所示),菌株T3的16S rRNA基因序列GenBank登錄號為OM149383。

圖2 降解菌T3基于16S rRNA基因序列的系統發育分析形態

2.2 降解菌的生長特性

T3在LB培養基中的生長情況如圖3所示。由圖3可以看出:在0～6 h內,T3處于延滯期,生長緩慢,需要經過一段時間才能在培養基中生長繁殖;6～24 h為對數增長期,細胞代謝活力最強,合成新細胞物質的速率最高,T3數量快速增加,24 h達到最大值的時期;24～32 h為穩定期,此時培養基營養成分濃度降低,同時代謝產物的大量積累對菌體本身產生毒害,這些因素對其生長不利,因此T3的生長趨于穩定;32～40 h為衰亡期,培養基的營養物質大量耗盡,T3開始出現死亡、自溶,細菌生長受到抑制,死亡速率大于生長速率,總細胞數呈負增長。因此后續降解試驗均采用在LB培養基中生長24 h左右的菌液。

圖3 降解菌T3生長曲線

2.3 接種量對柴油降解率的影響

接種量是影響微生物代謝過程的一個重要因素,影響到微生物的生長速度和延滯期。在柴油體積分數為1%、溫度為30 ℃、體系初始pH為7.0的條件下,考察了接種量對T3降解柴油的影響,結果見表1。由表1可知,隨著接種量逐漸提高,T3降解柴油降解率和OD600呈現出先增加而后降低的趨勢,在接種量(φ)為2%時,對柴油的降解率最高,達到79.04%,OD600也達到0.848。此結果表明,單純提高接種量并不能顯著提升菌株的柴油降解率,接種的微生物過多,使菌體過度繁殖,菌體對培養基中營養物質的相互競爭將造成營養短缺,其代謝活動受到限制,影響微生物對柴油的降解[16]。因此后續試驗均選擇接種量(φ)為2%進行。

表1 接種量對T3降解柴油效果的影響

2.4 環境條件對柴油降解率的影響

在柴油體積分數為1%、T3接種量(φ)為2%、體系初始pH為7.0的條件下,考察溫度對T3降解柴油性能的影響,結果如圖4所示。在柴油體積分數為1%、T3接種量(φ)為2%、溫度30 ℃的條件下,考察了體系初始pH對T3降解柴油性能的影響,結果如圖5所示。

圖4 溫度對T3降解柴油性能的影響

圖5 初始pH 對T3降解柴油性能的影響

由圖4可以看出,在柴油培養基中,T3在30 ℃時的柴油降解率最高,達到79.04%,OD600也達到0.848。微生物對柴油的降解屬于酶促反應,在最適溫度下微生物生長最好,酶活性較高,可促進對柴油的降解,而后溫度的升高或降低均會抑制微生物的代謝活動,從而導致T3的生長和柴油降解能力下降。由5可知,在pH為7.0～9.0范圍內柴油降解率可達到70%以上,其中pH為8.0時降解率最高,為89.79%,說明T3適宜在pH 為7.0～9.0的弱堿性環境中生長代謝。pH為4.0～6.0的酸性條件不利于T3的生長,從而導致柴油降解率降低。

圖6 氮源對柴油降解率的影響

在T3接種量(φ)為2%、溫度為30 ℃、體系初始pH為8.0、以氯化銨作為外加氮源的條件下,考察T3對不同濃度柴油的降解能力,結果如圖7所示。由圖7可以看出,當柴油體積分數為0.5%時,T3生長增殖能力強,柴油降解率達到92.50%。隨著柴油濃度的增加,T3的生長速率和柴油降解能力不斷下降,主要原因是柴油濃度增大后,會在培養接表面形成一層油膜,使得溶解氧濃度降低,此外高濃度柴油具有一定的生物毒性,抑制了微生物的生長代謝,從而降低了對柴油的降解能力[17]。在柴油體積分數為10%(質量濃度為84 000 mg/L)的條件下,其降解率約40%,說明T3對高濃度柴油污染物具有一定的降解能力,展示出了在高濃度柴油類石油烴污染土壤和地下水的應用潛力。主要原因可能是該降解菌長期在高濃度石油烴和多環芳烴污染的土壤中生長,對該環境條件具有較好的耐受能力。

圖7 柴油含量對柴油降解率的影響

2.5 柴油降解機制分析

長期在石油烴、多環芳烴污染土壤中生長使菌株可耐受石油烴污染環境,從此環境中篩選得到的菌株T3也由此具備了良好的石油烴污染環境耐受性與降解能力。在最適宜條件下,采用T3對柴油培養基中體積分數為1%的柴油進行7 d降解,對降解前后的柴油進行氣相色譜分析,二者的氣相色譜圖譜對比見圖8,二者的組分含量對比見表2。由圖8和表2可以看出,降解7 d后,T3對柴油中的主要組分(C10～C22)均具有較好的降解效果,降解前后柴油各單一組分含量均發生了明顯的變化。

表2 柴油降解前后的主要組分含量對比

圖8 柴油降解前后的氣相色譜

3 結 論

(1)從某石油化工退役場地石油烴污染土壤中篩選得到鮑特氏菌Bordetellasp.T3菌株,其具有良好的高濃度柴油污染物的耐受能力和降解效果。

(2)在柴油體積分數為1%、接種量(φ)為2%、溫度為30 ℃、pH為8.0的條件下,采用T3降解柴油7 d降解率可達89.79%。且T3能夠耐受體積分數為10%(質量濃度為84 000 mg/L)的柴油,具有約40%的降解率,對高濃度柴油污染情況的生物修復具有重要的意義。

(3)T3可降解柴油中主要的碳氫化合物組分(C10～C22),在柴油等石油烴污染修復領域具有良好的應用價值。