門靜脈血栓動(dòng)物模型的建立和應(yīng)用

劉 壯，陳紀(jì)宏，祁興順，許向波，諸葛宇征

1 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科，沈陽 110840

2 中國醫(yī)科大學(xué)研究生院，沈陽 110122

3 大連醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧 大連 116044

4 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化內(nèi)科，南京 210008

門靜脈血栓（portal vein thrombosis，PVT）形成是指在肝外門靜脈主干和/或肝內(nèi)門靜脈分支內(nèi)發(fā)生的血栓栓塞［1］。PVT在總體人群的患病率為1%［2］，在肝硬化患者中可達(dá)14.29%［3］。PVT 是由多種因素共同作用的結(jié)果，可能由Virchow 三聯(lián)征（高凝狀態(tài)、血流緩慢和內(nèi)皮損傷）的一個(gè)或多個(gè)因素引起［4］。高凝狀態(tài)包括局部和全身。其中，局部高凝狀態(tài)主要由腹腔內(nèi)感染、外傷、腹部手術(shù)和腹部惡性腫瘤等因素引發(fā)［5-6］，全身高凝狀態(tài)主要由遺傳性抗凝血酶原、蛋白C和蛋白S缺陷，凝血因子Ⅴ Leiden 突變和凝血酶原G20210A 突變等因素引發(fā)［7-8］。此外，門靜脈血流減慢是肝硬化患者PVT 的主要因素［9］。然而，PVT 的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，使新治療策略的開發(fā)和應(yīng)用受限。通過建立PVT 的動(dòng)物模型可以更深入地研究PVT 發(fā)病機(jī)制并探索新的治療靶點(diǎn)。目前，靜脈血栓的動(dòng)物模型多應(yīng)用于研究下肢深靜脈血栓和肺栓塞的病因、診斷、治療和預(yù)防，但鮮有研究探討PVT。本文將對現(xiàn)有不同種類PVT 動(dòng)物模型的建立方法、原理、優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用情況進(jìn)行綜述。

1 PVT動(dòng)物模型的種類和建模方法

1.1 鼠模型 建立鼠PVT 模型常用的方法包括靜脈完全結(jié)扎和部分結(jié)扎聯(lián)合損傷血管內(nèi)皮［10-13］。門靜脈是肝臟的主要供血血管，血管完全結(jié)扎可能導(dǎo)致肝功能衰竭［14］。因此，血管部分結(jié)扎聯(lián)合損傷血管內(nèi)皮的方法更適用于PVT 模型的建立。該方法是通過結(jié)扎和/或鉗夾門靜脈引起血流淤滯和內(nèi)膜損傷從而誘導(dǎo)PVT 發(fā)生。Wei 等［14］和姚露露等［15］均通過間斷結(jié)扎聯(lián)合鉗夾門靜脈的方法建立PVT模型：將鼠麻醉后，開腹并游離和結(jié)扎門靜脈的近端及遠(yuǎn)端，然后通過無齒鑷子在門靜脈的近端和遠(yuǎn)端進(jìn)行鉗夾，同時(shí)結(jié)扎20 min后松開結(jié)扎線，允許門靜脈血液流動(dòng)10 min；使用彩色多普勒超聲觀察PVT的形成情況，但上述兩項(xiàng)研究均未報(bào)道造模成功率。李威威等［16］通過比較3 種誘導(dǎo)PVT 的不同方法（間斷結(jié)扎門靜脈、無水乙醇破壞血管內(nèi)膜和二者聯(lián)合），發(fā)現(xiàn)3 種方法術(shù)后即刻PVT 的發(fā)生率分別為12.5%、87.5%和100%。間斷結(jié)扎門靜脈和無水乙醇破壞血管內(nèi)膜誘導(dǎo)的血栓在術(shù)后1天消失，因此這兩種建模方法并不穩(wěn)定；相比之下，二者聯(lián)合誘導(dǎo)的血栓在術(shù)后1 天仍可穩(wěn)定存在，建模更穩(wěn)定。張津瑜等［17］發(fā)現(xiàn)單純門靜脈間斷結(jié)扎也可建立PVT 模型，建模成功率為75.56%，動(dòng)物死亡率為11.11%。此外，在鼠肝硬化模型中，可通過脾切除術(shù)建立PVT 模型，建模成功率為43.75%［18］。另有一項(xiàng)研究［19］報(bào)道脾臟皮下轉(zhuǎn)位術(shù)聯(lián)合肝外門靜脈結(jié)扎也可誘導(dǎo)PVT發(fā)生。

以上建模方法中，門靜脈間斷結(jié)扎和/或鉗夾的方法具有技術(shù)要求低、操作簡單和可重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)，而脾切除和脾皮下轉(zhuǎn)位術(shù)的方法較復(fù)雜，技術(shù)要求高，不適用于PVT模型的常規(guī)制備。

1.2 兔模型 何謙等［20］和Ide 等［21］利用大腸桿菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)PVT，這與兔下肢深靜脈血栓模型常用的介入手術(shù)、靜脈部分結(jié)扎和短暫阻塞方法并不相同［22-23］。Ide等向門靜脈注射含有大腸桿菌內(nèi)毒素和超液化碘油的乳劑誘導(dǎo)PVT：將兔麻醉并開腹后，將一根針直接插入肝左前葉門靜脈分支并注射超液化碘油的乳劑，通過HE 染色在門靜脈觀察到纖維蛋白血栓，但該研究并未報(bào)道建模的成功率。何謙等發(fā)現(xiàn)慢性膽道感染可引起門靜脈局部高凝狀態(tài)從而誘導(dǎo)PVT：將兔膽囊部分切除并留置膽囊管后，經(jīng)膽囊管向兔體內(nèi)注射大腸桿菌以形成慢性膽道感染來誘導(dǎo)PVT，PVT 造模成功率為41.7%。這兩項(xiàng)研究所使用方法的原理相似；當(dāng)大腸桿菌內(nèi)毒素進(jìn)入門靜脈可引起血管內(nèi)皮損傷并激活凝血系統(tǒng)，從而導(dǎo)致PVT。雖然注射大腸桿菌或內(nèi)毒素的方法易引發(fā)血管內(nèi)皮損傷和局部高凝，但其所誘導(dǎo)的門靜脈血栓微小、血栓形成速度慢、動(dòng)物體型小穿刺困難、造模成功率低，故不適用于PVT模型的常規(guī)制備。

1.3 犬模型 已有的犬PVT 模型建立方法與犬深靜脈血栓建模方法相似，均采用介入手術(shù)的方法［24-25］。羅東陽［26］和Deng等［27］通過門靜脈留置導(dǎo)管向門靜脈注射自體血栓建立犬PVT 模型：通過穿刺門靜脈將導(dǎo)管插入并留置于門靜脈主干，然后從留置導(dǎo)管中提取門靜脈血液，將血液與凝血酶混合制作自體血栓，最后通過留置導(dǎo)管向門靜脈注射自體血栓和凝血酶混合物誘導(dǎo)PVT，血管造影進(jìn)一步驗(yàn)證PVT的發(fā)生；該方法的成功率為70%，動(dòng)物死亡率為30%。彭長鐵等［28］通過相近的方法，即皮下埋植門靜脈導(dǎo)管再將自體血栓混合凝血酶注入門靜脈，成功誘導(dǎo)PVT。以上模型的原理是通過門靜脈置管刺激門靜脈血管內(nèi)膜造成血管內(nèi)膜損傷，再通過自體血栓和凝血酶的注入引起血流減少和血液黏度增加，從而誘導(dǎo)血栓的發(fā)生。該方法有血栓形成快、成功率高等優(yōu)點(diǎn)，但也存在導(dǎo)管容易被阻塞、介入技術(shù)要求較高、動(dòng)物管理困難和模型制作成本昂貴等缺點(diǎn)。

1.4 豬模型 豬PVT 模型和深靜脈血栓形成模型多采用介入手術(shù)建立［29-30］。Goldberg等［31］在開發(fā)一種可通過低超聲能量消除靜脈血栓的超聲導(dǎo)管裝置時(shí)建立豬PVT模型：將豬麻醉并開腹后，通過門靜脈穿刺的方法在血管內(nèi)放置一個(gè)鞘，并通過該裝置注射新鮮的自體血栓誘導(dǎo)PVT，最后經(jīng)血管造影證實(shí)PVT的發(fā)生；該方法的建模成功率為100%。有研究［32］在通過向腹腔注射CCl4建立豬肝硬化模型的基礎(chǔ)上，經(jīng)皮穿刺門靜脈，通過導(dǎo)管向門靜脈放置纖維線圈和注射凝血酶誘導(dǎo)PVT；該方法的成功率為66.67%，動(dòng)物的死亡率為22.23%。另有研究［33-36］報(bào)道，可通過經(jīng)皮經(jīng)肝穿刺門靜脈留置球囊導(dǎo)管，向門靜脈內(nèi)注射自體血栓和/或凝血酶建立PVT 模型，建模成功率為50%～66.67%。以上方法的原理與犬PVT 建模方法相似，也是通過損傷血管內(nèi)皮、減緩門靜脈血流和誘導(dǎo)局部高凝進(jìn)而導(dǎo)致PVT，雖有血栓誘導(dǎo)速度快的優(yōu)點(diǎn)，但存在介入技術(shù)要求較高、動(dòng)物管理困難、成本較昂貴等缺點(diǎn)。

此外，有研究［37］報(bào)道在門靜脈主干附近行射頻消融術(shù)可誘導(dǎo)PVT，但未報(bào)道PVT 的發(fā)生率。該方法是通過射頻消融術(shù)引起局部血管損傷從而導(dǎo)致局部高凝狀態(tài)并誘導(dǎo)PVT 形成，但存在技術(shù)要求高、操作困難等缺點(diǎn)，故不適用于PVT模型的常規(guī)制備。

2 不同種類PVT動(dòng)物模型的優(yōu)缺點(diǎn)

鼠和兔具有體型小、管理方便、實(shí)驗(yàn)成本低、技術(shù)相對簡單等優(yōu)點(diǎn)，適用于需要大樣本量的研究，但也因動(dòng)物體型小、穿刺相對困難等缺點(diǎn)，并不適用于介入操作，此外，鼠和兔與人類之間也在血流動(dòng)力學(xué)和血管大小等方面存在差異［38］。與鼠和兔相比，犬、豬等大型動(dòng)物的生理結(jié)構(gòu)更接近人類，且這些動(dòng)物的血管直徑較大，因此穿刺置管難度低，便于介入操作和影像學(xué)檢查，但存在介入操作技術(shù)要求高、動(dòng)物管理困難、建模成本高、耗時(shí)、難以大規(guī)模制備等缺點(diǎn)。

3 PVT動(dòng)物模型的應(yīng)用

已有研究將鼠和兔模型用于探討白藜蘆醇［18］和重組P選擇素糖蛋白配體免疫球蛋白G［14］等藥物治療PVT的效果。此外，由于鼠和兔模型成本低、管理方便和易于大量制備的優(yōu)點(diǎn)，也可用于需收集大量組織樣本分析PVT 發(fā)生機(jī)制的研究。相比之下，犬和豬模型的血管直徑大，適用于介入操作，故可用于評估和開發(fā)新的PVT介入治療技術(shù)，已有研究［31］將犬和豬模型用于建立低超聲能量消除PVT的超聲導(dǎo)管裝置，并探討射頻消融技術(shù)［35］治療PVT的效果。此外，彭長鐵等［28］通過犬PVT模型發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長因子可能通過激活信號通路Janus 激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3促進(jìn)血栓的機(jī)化再通。

4 小結(jié)

動(dòng)物模型可用于研究PVT 的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)治療PVT 的新方法，PVT 模型的選擇應(yīng)基于研究內(nèi)容、技術(shù)能力、成本等多方面考慮。PVT 動(dòng)物模型建立方法多仿效已被報(bào)道的下肢深靜脈血栓建模方法，包括單純靜脈結(jié)扎、靜脈結(jié)扎聯(lián)合損傷血管內(nèi)皮、自體血栓聯(lián)合凝血酶注射和纖維線圈植入聯(lián)合凝血酶注射等。然而，脾切除術(shù)、脾臟皮下轉(zhuǎn)位術(shù)、射頻消融術(shù)和大腸桿菌內(nèi)毒素注射的方法并不適用于PVT 模型的常規(guī)制備。目前，PVT 動(dòng)物模型的相關(guān)研究較少，故仍需改進(jìn)現(xiàn)有模型并開發(fā)新模型。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：劉壯負(fù)責(zé)查閱文獻(xiàn)、資料分析、撰寫論文；諸葛宇征、陳紀(jì)宏、許向波參與修改論文；祁興順指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。