中醫藥調控程序性細胞死亡干預肝纖維化的研究進展

黃良江，毛德文，張榮臻，黃國初，王 涵，秦偉彬，姚 春

1 廣西中醫藥大學研究生院，南寧 530200

2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院肝病科，南寧 530023

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）及其并發癥是全球成年人最常見的死亡原因之一，每年導致約數百萬人死亡［1］。目前HF 的分子發病機制尚未完全闡明［2］。一般認為，正常肝細胞在各種理化刺激下被激活為肌成纖維細胞，并分泌大量的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）在肝臟中彌漫性和過度進行性沉積，從而導致肝實質細胞減少和纖維化。作為一個基本的生物學過程，程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD）在整個肝臟疾病演變過程中扮演著重要角色，其與HF 的發生密切相關［3］。PCD 主要包括凋亡、程序性壞死、焦亡、自噬和鐵死亡，上述均為受到高度調控的細胞死亡方式［4］。中醫藥可通過調節機體內環境，改善肝臟微循環，抑制肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化和增殖，促進ECM的降解和吸收，從而達到抗肝纖維化目的。目前越來越多的證據表明中醫藥能夠通過調控PCD 而起到顯著改善HF 的效果。基于上述背景，本文結合國內外最新研究進展探討PCD 與HF 的關系，并概述中醫藥通過調控PCD 干預HF的新探索，旨在提高對HF發病機制的認識，并為中醫藥靶向調控PCD 作為HF 潛在新型治療靶點的策略提供新思路。

1 PCD與HF的關系

1.1 細胞凋亡與HF 密切相關 凋亡是一種主動的、有序的、能量依賴性的細胞死亡類型，其特征是核溶解、染色質凝結和細胞收縮，可以通過內在線粒體或外在死亡受體介導的途徑觸發，細胞凋亡通常發生在細胞發育和衰老過程中，并作為一種維持組織中細胞群的穩態機制［4］。細胞內途徑特征是線粒體外膜孔的形成，也稱為線粒體途徑，在發育控制和遺傳毒性劑介導的細胞凋亡中起作用，并受B 淋巴細胞瘤-2 家族成員的調控［6］。細胞凋亡的外在途徑由細胞外微環境的擾動啟動，主要由跨膜受體如死亡受體或模式識別受體的刺激驅動［5］。

在肝細胞中，死亡信號的放大和線粒體的結合對于肝細胞的生長至關重要［6］。有研究［7］表明，Kupffer 細胞（肝臟中的特殊巨噬細胞）吞噬凋亡小體可上調小鼠膽肝損傷中的死亡配體和細胞因子。同時，在同一模型中，細胞死亡受體fas 介導的肝細胞凋亡與HSC 的激活有關，并將細胞凋亡與肝纖維化聯系起來。也有研究［8］表明，小鼠的混合譜系激酶樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like，MLKL）缺失能顯著減少CCl4和膽管結扎誘導的肝損傷和纖維化的臨床癥狀，進一步研究表明，腺相關病毒8介導的肝細胞中MLKL 特異性敲除在預防和治療方面顯著減輕CCl4誘導的肝纖維化。因此，細胞凋亡與肝纖維化密切相關，如果能有效調控細胞凋亡，通過尋找抗凋亡藥物，抑制細胞凋亡相關基因或者中斷細胞凋亡傳導通路，將為疾病的預防和治療帶來新的方向。

1.2 壞死性凋亡是HF 的關鍵信號通路 壞死性凋亡是一種被動的、無序的、能量依賴性的細胞死亡形式，又稱為程序性壞死［9］。目前研究［10］表明，壞死性凋亡主要由受體相互作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（RIPK1）、RIPK3 和MLKL 介導。與細胞凋亡不同，壞死是一種不依賴胱天蛋白酶的PCD 形式，其特征是細胞膜通透性增加、質膜破裂、細胞質和細胞器普遍腫脹，以及細胞成分溢出到微環境中［11］。一般而言，壞死信號通路可以在多種刺激下激活，包括環境壓力、各種化療藥物、機械損傷、炎癥和感染等［12］。

近年來，越來越多的研究關注了壞死性凋亡在HF中的作用，并探索了針對壞死性凋亡的潛在治療策略。證據［13］顯示，在對乙酰氨基酚中毒、長期乙醇喂養、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和氧化應激等模型中，RIPK3缺陷或抑制可以降低肝損傷和纖維化。同時，在人類NASH和脂肪性肝炎小鼠模型［14］中表明，RIPK3介導c-Jun氨基端蛋白激酶（JNK）的激活有助于釋放促炎因子，如MCP-1，將巨噬細胞吸引到受損的肝臟，并進一步擴增RIPK3，介導信號通路、細胞死亡和肝纖維化。根據上述結果，有足夠的理由相信RIPK3依賴性壞死在NASH誘導的肝纖維化中發揮重要作用。相反，在NASH 中抑制胱天蛋白酶8（Caspase-8）反而增加了肝損傷和纖維化，表明其在防止壞死過度激活中起到保護作用［15］。這些研究表明，除了細胞凋亡外，壞死也是HF 的一個關鍵信號通路。靶向壞死可能為HF 提供一種特殊的治療方法。然而，還需要進一步的臨床研究來評估該途徑的哪些部分可以用作治療慢性肝病的靶點。

1.3 細胞焦亡調控HF的效應機制 焦亡是一類新近提出的炎癥細胞死亡類型，從形態學上看，細胞焦亡與壞死相似，有孔隙形成、脫氧核糖核酸斷裂和細胞腫脹［16］。對比凋亡，焦亡發生的速度更快，因為后者與IL-1β 和其他細胞內物質向細胞外空間的釋放有關［17］。目前研究［18］發現，焦亡信號通路主要包括依賴于Caspase-1 激活的經典途徑和Caspase-4/5/11激活的非經典途徑。

細胞焦亡有助于對肝病學研究進一步深挖。正常情況下，中度焦亡有助于及時刪除受感染的細胞，但焦亡的過度激活會導致大量細胞死亡、嚴重的組織損傷和器官衰竭［19］。研究［20］表明，HSC 在肝損傷后被激活，分泌大量的纖維化相關蛋白，如結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、金屬蛋白酶抑制劑1和膠原，焦亡可以激活HSC，增加結締組織生長因子、金屬蛋白酶抑制劑1 和膠原的表達，使得肝組織結構的改變。細胞焦亡可以通過多種途徑誘導HSC 的激活，包括肝細胞凋亡產物、嗜酸性粒細胞分泌的炎癥因子和NLRP3炎癥小體［21］。此外，細胞焦亡還可以誘導IL-1β 和IL-18 的分泌，這兩種促炎因子可以通過與IL-1 受體1（IL-1R1）結合，激活JNK 和活化蛋白-1（AP-1）信號通路，從而促進HSC 的增殖和纖維化。同時，IL-1β 還可以增強膠原和轉化生長因子β的表達，進一步加劇HF［22］。

綜上，細胞焦亡這種促炎性的細胞死亡方式，與HF密切相關，如果能有效調控細胞焦亡，通過尋找抗焦亡的藥物，抑制細胞焦亡相關基因或者中斷細胞焦亡傳導通路，即可減輕HF。

1.4 自噬與HF 的作用關系 自噬是一種細胞內的降解過程，可以清除異常蛋白、細胞器和感染因子，在既往30年中被認為是一種高度調節的降解途徑，用于去除不需要的胞質成分和受損或多余的細胞器，以保持細胞內部平衡和功能［4］。目前主要發現有3 種類型的自噬：微自噬、分子伴侶介導的自噬和巨自噬。巨自噬是最常見的自噬形式，也是肝細胞中選擇性地將脂滴運輸到溶酶體的主要方式，其涉及到一個新生的吞噬原包裹細胞質物質，形成雙層膜囊泡，稱為自噬體，自噬體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，降解和回收貨物，以維持細胞穩態［23］。

自噬失調與許多肝臟疾病有關，其調節也被認為是肝纖維化的一種潛在的新治療策略［3］。研究［24］表明，自噬對HSC 的能量代謝具有重要的調節作用，HSC 激活的一個顯著特征是釋放含有視黃酯和甘油三酯的脂滴，并且表現出類似于肌成纖維細胞的特征，如平滑肌α-actin的表達和對促纖維化、趨化性和有絲分裂因子受體的新生表達，自噬通過作用于脂滴釋放，從而為HSC 激活提供能量。另一方面，自噬可以通過抗炎作用抑制HF 的出現，在體內和體外實驗中，抑制HSC 中的自噬顯示出減輕纖維化的效果，與減毒的HSC 激活一致，自噬抑制導致HSC 中保留了脂滴，并降低了總ATP 水平，從而抑制上皮-間質轉分化（epithelial mesenchymal transition，EMT），進一步抑制肌成纖維細胞的產生，以預防HF［25］。毫無疑問，自噬在生物體的生理和病理過程中都可見，其作用是積極的還是消極的至今尚未完全闡明，特別是對HF的研究值得進一步關注。

1.5 細胞鐵死亡在HF中發揮關鍵作用 鐵死亡是一種由鐵依賴的脂質過氧化引起的細胞死亡方式，受鐵代謝和氨基酸抗氧化系統等因素調控［26］。鐵死亡與其他細胞死亡方式如凋亡或壞死有明顯區別，可影響細胞內多種細胞器的結構和功能，包括線粒體、內質網和高爾基體［27］。研究［28］發現，鐵死亡是由鐵死亡誘導劑和鐵死亡防御系統之間的失衡所致，當促進鐵死亡的因子如鐵依賴性脂質過氧化和活性氧（reactive oxygen species，ROS）超過抗氧化防御系統時，脂質過氧化物就會在細胞膜上積累，從而觸發鐵死亡。

近年來，越來越多的證據表明鐵死亡參與了肝纖維化的發病機制。研究［29］證明，誘導HSC發生鐵死亡可以減少其活化程度，降低其分泌促纖維化因子，并增加其分泌抗纖維化因子，可抑制肝纖維化。鐵死亡的特定調節因子包括ELAVL1、ZFP36、BRD7和TRIM26。ELAVL1是一種普遍存在的RNA結合蛋白，通過結合BECN1/Beclin1 mRNA 促進自噬激活，從而增強鐵死亡［30］。ZFP36 是一種RNA 結合蛋白，可通過不穩定自噬相關16 類似物1（ATG16L1）mRNA，從而抑制巨噬細胞自噬/自噬激活并介導鐵死亡抵抗，在小鼠模型中，鐵死亡誘導劑索拉非尼可通過泛素連接酶F-box 和WD 重復域含7（FBXW7/CDC4）降低ZFP36 蛋白表達、激活鐵蛋白自噬和HSC 的鐵死亡來改善肝纖維化［31］。BRD7具有靶向HSC的鐵死亡誘導劑的能力，與此同時，埃拉斯汀和索拉非尼可通過BRD7/P53/SLC25A28 軸誘導HSC 鐵死亡，從而抑制小鼠肝纖維化［29］。最近的一項研究［30］表明，E3 泛素連接酶TRIM26 在纖維化的肝組織中下調，TRIM26 過表達通過介導SLC7A11的泛素化和降解促進了HSC鐵死亡，從而抑制了HSC增殖。綜上所述，這些發現在調節HSC的鐵死亡中發揮關鍵作用，是預防肝纖維化的有效靶點。

綜上所述，目前程序性細胞死亡抑制肝纖維化發生發展的主要相關機制有：有效性的肝實質細胞凋亡減少、激活壞死體誘導HSC 壞死性凋亡、抑制炎性小體激活焦亡延遲纖維化、細胞自噬促進HSC 活化及抑制炎癥、靶向誘導HSC鐵死亡等。

2 中醫藥調控PCD治療HF的研究進展

中醫藥是中國傳統醫學的重要組成部分，具有悠久的歷史和獨特的理論體系。從中醫角度而言，HF 的發生與氣滯、血瘀、濕熱、脾虛等因素有關，治療HF 當以調和肝脾、活血化瘀、清熱利濕等，通過多種藥物配伍，達到多成分、多靶點、多途徑的綜合調節作用。針對現有的國內外相關研究，筆者總結了上述多種中醫藥調控PCD治療HF的主要機制的相關研究。

2.1 中醫藥調控細胞凋亡防治HF 新思路 據文獻［32］報道，在CCl4誘導的HF 大鼠模型中，桂枝茯苓丸能夠通過抑制TGF-1/Smad2/3-CUGBP1 信號傳導和激活IFN-γ/STAT1/Smad7 信號傳導，抑制HF。同時體外實驗［33］亦證實其可抑制乙醛刺激的LX-2 細胞增殖并引發細胞凋亡，以抑制HF。此外，Wang 等［34］發現，四逆散減少了CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型膠原和ECM 的沉積，下調了血清中的纖維化相關因子（透明質酸和層粘連蛋白）含量，維持了肝組織的形態結構，改善了肝功能。在進一步的體內實驗中，四逆散治療抑制了HF小鼠肝組織中肝實質細胞的凋亡，并調節凋亡素的表達，同時在體外保護L02 細胞免受TNF-α 和ActD 誘導的凋亡，有效地阻止了肝纖維化的進展。乙酸乙酯餾分是現代中藥制劑下瘀血湯的主要活性部位提取物，Zhang等［35］發現，乙酸乙酯餾分可在CCl4誘導的HF 小鼠模型中誘導HSC 凋亡，并抑制HSC 凋亡途徑相關蛋白（JNK 和p38 MAPK）的表達。此外，研究［36］報道，通過建立膽管結扎（BDL）誘導的HF小鼠模型發現，四物湯可通過Fas/FasL 信號通路有效促進活化的HSC凋亡，這可能是由CD8+組織駐留記憶T 淋巴細胞介導的。以上研究表明，中藥復方及中藥活性成分可通過減輕炎癥、ECM 積聚、肝實質細胞異常血管生成和凋亡，以及通過對多個靶點的作用抑制HSC 的活化，有效地阻止了HF 的進展，因此可能成為治療這種情況的新方案。

2.2 中醫藥抑制細胞壞死性凋亡增強HF 防治效果研究發現，通過建立CCl4誘導的雄性ICR 小鼠HF 模型和HSC-LX2 細胞體外實驗表明，莪術醇可通過誘導RIP1/RIP3 依賴的壞死性凋亡清除活化的HSC，并且促進Atg5 與RIPs 間的相互作用激活壞死體誘導HSC 壞死性凋亡，來達到抗肝纖維化的作用［37］。Sun 等38］發現姜黃醇可通過降低Atg1 的乙酰化水平來靶向Sirt5 調節自噬，Sirt1的HSC 特異性沉默加劇了CCl4誘導的HF小鼠，Atg5 的脫乙酰化不僅加速了自噬體的積累，而且增強了Atg5 與RIP1/RIP3 之間的相互作用，誘導壞死性凋亡。綜上，姜黃醇可激活Sirt1促進Atg5脫乙酰，增強其蛋白-蛋白相互作用功能，從而誘導自噬，促進HSC 壞死性凋亡，減少HF。研究［39］還表明，在CCl4誘導的雄性ICR小鼠HF 模型和HSC-LX2 體外實驗中發現，姜黃醇可誘導內質網應激通過Sirtuin-1（Sirt1）/Notch 信號通路介導的HSC 壞死性凋亡。此外，Jia等［40］發現，姜黃醇改善了CCl4誘導的小鼠HF 并抑制了HSC 增殖和激活，這與RIPK1/RIPK3 的磷酸化來調節HSC 壞死性凋亡有關。以上數據顯示，一些中藥復方及中藥提取物治療HF 的作用是通過誘導HSC 的壞死性凋亡來清除活化的HSC，并且各個細胞死亡方式之間可能存在一定關聯，這些發現將為未來天然植物化合物治療HF 的臨床應用提供科學依據。

2.3 中醫藥影響細胞焦亡防治HF新探索 持續的炎癥是HF 的起始和維持因素，因此，抗細胞焦亡以抑制炎癥可以有效改善HF。研究［41］表明，用連翹苷A（FA）包裹的CD44 特異性配體透明質酸（HA）修飾的乳源外泌體（mExo）的納米載體（HA-mExo-FA），體內結果顯示，HAmExo-FA可以改善斑馬魚幼蟲的肝臟形態和功能變化，其抗HF機制與NLRP3介導焦亡的抑制有關。此外，在CCl4誘導的HF小鼠模型中，疏肝健脾方給藥后可改善肝臟病理組織學損傷程度，抑制細胞焦亡，顯著下調α-SMA、CollagenⅠ、Caspase-1、IL-1β、IL-18 以及TLR4、MyD88 和NLRP3 mRNA 與蛋白表達水平，表明疏肝健脾方可通過調控TLR4/MyD88/NLRP3信號軸，減少細胞焦亡，抑制肝星狀細胞活化，最終達到抗HF 目的［42］。此外，研究［43］發現，通過體外培養人正常肝細胞L02，采用H2O2誘導L02 細胞損傷模型，干預組加入中藥單體柴胡的主要化學指標和生物活性成分之一柴胡皂苷d（SSd）（低、中、高劑量組）孵育24 h 后再經過H2O2處理細胞。結果表明，與對照組比較，氧化應激損傷的L02 細胞焦亡相關指標Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達明顯升高（P值均＜0.05），EMT 相關指標TGF-β1、Vimentin、α-SMA 的表達升高，Ecadherin 表達下（P值均＜0.05）；SSd 干預后，Caspase-1、IL-1β、IL-18、TGF-β1、Vimentin、α-SMA的表達明顯下調，Ecadherin表達上調（P值均＜0.05）。以上結果表明，氧化應激損傷的L02細胞活力下降可能與細胞焦亡相關，SSd有抑制損傷的L02細胞焦亡、控制EMT過程，發揮抗肝纖維化的作用［44］。以上研究表明，中藥復方及中藥提取物在防治HF中顯現出良好的應用前景。

2.4 中醫藥促進細胞自噬清除HF細胞損傷 大量研究表明自噬失調在HF的進展中起著關鍵作用。據文獻［43］報道，在腹膜內注射CCl4的HF 大鼠模型中，白花香蓮解毒顆粒可通過活化AMPK/mTOR 通路抑制自噬，從而拮抗HSC活化，以預防HF化。在體外實驗［44］亦發現，白花香蓮解毒顆粒可升高大鼠原代HSC 中p-AMPK/AMPK、p-mTOR/m TOR、p-p70S6K/p70S6K表達和細胞活力，降低α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平（P值均＜0.05）；各劑量白花香蓮解毒顆粒可顯著降低大鼠肝組織α-SMA蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平（P值均＜0.05），減少受損肝細胞數量、炎細胞浸潤及纖維間隔區域面積，減輕膠原纖維增生，降低α-SMA 表達。研究［45］表明，小檗堿在小鼠體內具有抗HF的作用，在體外可抑制LX-2 細胞的增殖、遷移及活化，這可能與小檗堿抑制HSC自噬水平有關。此外，Zhang等［46］發現，在CCl4誘導的雄性SD大鼠模型中，給予片仔癀治療8周，同時，在體外研究了片仔癀處理的HSC 的細胞活力和主導自噬的關鍵分子的表達。結果顯示，片仔癀可通過下調TGF-β1和磷酸化Smad2來抑制HSC的激活。此外，片仔癀下調酵母Atg6（Beclin-1）和微管相關蛋白輕鏈3（LC3）抑制HSC 自噬，減少細胞外膠原的產生，抑制HSC 的活化，以減輕CCl4誘導的肝纖維化。因此，基于這些研究，我們合理地指出了使用中醫藥通過調節自噬來治療肝纖維化的可能性。

2.5 中醫藥調節細胞鐵死亡緩解HF 最近，來自體外和體內模型的越來越多的證據表明，鐵死亡的藥理誘導可能會減輕肝纖維化的發展。研究［47］報道，在腹膜內注射CCl4的大鼠肝纖維化模型中，根皮苷處理組與模型組相比膠原沉積顯著減少，血清AST、ALT、層粘連蛋白和透明質酸水平降低，其機制可能涉及鐵死亡、碳代謝以及生物力學的相關變化。Liu 等［48］發現，在大鼠HSC 細胞體外實驗中，黃芩苷通過激活SOCS1/P53/SLC7A11 介導的HSC 鐵死亡，其干預的HSC鐵死亡和ECM減少被鐵生長抑制劑鐵抑素-1 明顯消除，以緩解HF。此外，Kong等［49］發現，青蒿琥酯治療可以誘導纖維化肝臟中活化的HSC 鐵死亡。同時，青蒿琥酯治療可顯著誘導造血干細胞鐵死亡，主要表現為細胞活力下降、細胞死亡率增加、鐵積累、過氧化脂升高和抗氧化能力下降。值得一提的是，Huang 等［50］以斑馬魚、HSC-T6 細胞和小鼠為研究對象，發現異甘草素通過抑制GPX4表達、增加TFR和DMT1的表達誘導HSC 鐵死亡產生大量的ROS，從而緩解肝纖維化，其次，研究還發現異甘草素可以通過干預Cav-1 介導的HSC鐵死亡發揮抗HF作用。以上研究表明，中藥復方和中藥活性成分可通過調控細胞鐵死亡為治療HF 提供新的治療策略。

此外，還有更多文獻報道，其他中藥復方和中藥活性成分可以通過調控細胞程序性細胞死亡來降低HF 的程度（表1）。

3 小結與展望

HF是一個復雜的病理過程，涉及多種因素、靶點和途徑，如今已成為一個嚴重后果的重大公共衛生問題［60］。近年來，從中藥中尋找和發現抗纖維化藥物已成為一個熱門研究領域［61-62］。許多中藥及其活性成分被發現可以調控多種細胞死亡方式來緩解肝纖維化，由于其結構多樣、毒性低、來源廣泛，在抗HF 方面具有獨特的優勢和巨大的應用前景［63-64］。這些既定證據表明，中藥是一種可行、有效的防治HF 補充劑，并可在日常生活中用于預防與肝病相關的疾病。然而，相關研究大多數仍處于體外和體內實驗階段，缺乏中藥抗HF 成分的臨床研究，臨床前安全性的評估很少記錄，可能的副作用和毒性仍未被發現，將來應該在臨床數據挖掘和實驗研究方面投入更多的工作，同時還需要研究HF 患者中多種細胞死亡形式各自占比是多少，明確各種形式的細胞死亡對HF 的直接貢獻程度。其次，目前沒有足夠的證據來解釋這些抗纖維化成分的具體分子機制，這些來自中藥的天然抗HF 產品的藥代動力學和藥理學特性需要進一步研究。此外，中醫藥干預PCD 改善HF 的研究對象還不夠廣泛，未來需要擴大到更多類型和來源的中藥或中藥配方。最后，由于HF 期間發生的細胞死亡是一個多因素和多環節的信號轉導過程，因此還需要進一步了解各種不同因子介導的信號轉導途徑在多種細胞死亡形式中的激活條件及其關系。綜上，中醫藥因其獨特的理論體系和長期的臨床實踐，在HF 的治療中具有很大的潛力。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：毛德文、張榮臻負責對研究思路的設計；黃良江、王涵負責查閱相關文獻，資料歸納、分析，撰寫論文；秦偉彬、黃國初負責修改論文；姚春負責指導、審閱論文及最后定稿。