根際細菌群落結構對黃瓜幼苗干旱脅迫的響應

王 燦,趙文麟,張新梅,許 彬,羅 文,解志強,張應華,許俊強

(1. 云南農業大學/云南省滇臺特色農業產業化工程研究中心,昆明 650201;2. 文山州農業科學院,云南 文山 663000;3.云南農業大學云南省蔬菜生物學重點實驗室,昆明 650201)

【研究意義】黃瓜(CucumissativusL.)為葫蘆科黃瓜屬蔬菜作物,是中國主要栽培的蔬菜種類之一[1]。干旱嚴重限制作物的生長致使作物產量和品質下降,是世界糧食安全和作物生產力的主要制約因素之一[2]。但由于黃瓜苗期根系不發達,生長需水量較大,對水分反應敏感,缺水會嚴重影響黃瓜幼苗的生長質量[3]。因此提高黃瓜抗旱性促進生長質量是保障黃瓜種植產業健康發展的重要措施之一。【前人研究進展】大量研究表明,植物根際微生物通過直接或間接途徑參與植物的生長和發育,同時協助植物抵御逆境脅迫(非生物及生物)。干旱脅迫下作物可以與相關的根際微生物(特別是能對土壤環境變化迅速響應的各種根際微生物群落)建立正向聯系,從而提高抗性,緩解干旱脅迫導致的損傷[4]。韋海波等[5]研究表明,干旱對長雄野生稻根際微生物群落結構多樣性指數無顯著影響,但顯著改變了微生物群落整體組成,同時顯著提高相關抗旱微生物豐度。Piccoli等[6]對阿根廷圣路易斯省西南區收集的含羞草科牧豆樹屬植物(Prosopisstrombulifer)根部微生物群落進行檢測,發現并分離獲得大量有益細菌,如惡臭假單胞菌(Pseudomonasputid)、芽孢桿菌(Bacillus)、梭狀賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusfusformis)等。同時將這些微生物接種到植株根際可顯著增加植株體內ABA含量進而提高抗干旱能力,這一結果有望作為優質的外源ABA提供者接種于植物根系土壤提高植物抗旱能力[7-8],同時可將其制作為農用微生物有機肥應用到干旱、半干旱地區土壤改良和作物生長中。方靜[9]研究表明,耐旱春小麥能夠增加放線菌門和奇古菌門(Thaumarchaeota)等根際抗旱相關有益微生物的相對豐度,能夠通過特定的信號傳導通路刺激耐旱春小麥抗旱相關基因的表達,使其更能適應干旱環境。可見微生物在植物抵御逆境中發揮著重要作用,在農業生產中有著巨大利用潛力,因此認識根際微生物群落對干旱環境擾動有何響應、干旱環境下植物-根際微生物互作關系,以及如何在農業生產中高效利用是當前研究的重點。【本研究切入點】目前,大量研究表明干旱對黃瓜生理代謝、酶活性、轉錄組表達有顯著影響,但干旱對黃瓜根際微生物群落組成是否有影響、微生物對黃瓜干旱環境擾動有何響應及微生物對異常環境的指示作用等方面研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】以黃瓜秧苗為研究對象從根際微生物群落多樣性角度探討干旱對黃瓜秧苗根際土壤細菌群落結構和功能的影響,挖掘可能在干旱脅迫下對黃瓜秧苗生長有正向反饋的土壤有益微生物,為黃瓜抗旱育種、栽培研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃瓜品系‘99-1’是雌性系高代自交材料,由云南農業大學滇臺中心提供,抗旱能力表現為良好。

育苗基質土為設施大棚內種植紅土與育苗基質按體積1∶1的混合土,混合土有效氮301.53 mg/kg、有效磷89.34 mg/kg、有效鉀370.59 mg/kg、pH 5.71,經托普云農TZS-3X土壤水分檢測儀檢測土壤最大持水量(灌滿水飽和狀態下,待土壤中重力水排除后的數值)為39%。

供試儀器:凝膠電泳系統、離心機,Bio-Rad公司生產;NovaSeq PE250 儀器,Illumina 公司生產。

1.2 試驗設計

試驗于2021年9月至2022年6月在文山州農業科學院人工氣候室內進行。55～60 ℃溫水浸泡黃瓜種子15 min,常溫浸種4～6 h后轉移至28 ℃恒溫箱黑暗催芽,露白后播種于裝有基質的塑料穴盤(28孔,每孔規格為5 cm×5 cm×5 cm)中,晝夜溫度設置為(27±1) ℃常規管理。幼苗長至3～4葉時,使用托普云農TZS-3X土壤水分檢測儀監測土壤含水量,待含水量自然下降到基質土壤最大含水量的60%～70%時進行干旱試驗。試驗共設置2個處理,分別為處理D(基質土最大含水量的60%～70%)和處理N(基質土最大含水量的80%～90%)。處理時長為7 d,期間動態監測基質土的水分變化,控制各處理的基質土含水量保持在既定范圍。處理結束后,每盤選取整齊一致的幼苗10株混合為1次重復(處理D 4次重復,處理N 5次重復),抖落根系附著的土壤后裝于50 mL無菌離心管中-80 ℃保存用于DNA提取、建庫、NovaSeq PE250 高通量測序,并收集秧苗葉片保存于4 ℃用于生理檢測。

1.3 測定方法

植株葉片葉綠素含量、可溶性糖含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、根系活力、根系超氧化物歧化酶(采用氮藍四唑法測定)參照王燦等[10]的方法檢測。

采用CTAB法提取土壤細菌DNA,用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。根據擴增測序區域,以基因組DNA為模板,使用帶Barcode的特異引物、Phusion?High-Fidelity高保真酶進行PCR反應。反應體系:Phusion Master Mix 15 μL,引物 515F 和 806R (2 μmol/L)各 3 μL,ddH2O 2 μL,DNA (1 ng/μL) 7 μL;反應條件:98 ℃,1 min;98 ℃,10 s,50 ℃,30 s,72 ℃,30 s,30 個循環;72 ℃,5 min。文庫構建使用NEBNext?UltraTMII DNA Library Prep Kit,并進行Qubit和Q-PCR定量,文庫合格后使用Illumina NovaSeq6000進行兩端測序(由北京諾禾致源科技股份有限公司完成)。使用16S V4區引物(515F:5’-CTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和806R:5’-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3’),通過Illumina NovaSeq進行兩端測序。

1.4 數據質控與分析

原始數據采用軟件Word 2003整理。使用軟件FLASH V1.2.11對樣本reads拼接得到Raw Tags;使用軟件Fastp質控得到Clean Tags;使用軟件Usearch將Clean Tags與數據庫進行比對最終得到Effective Tags。使用軟件QIIME2中的DADA2模塊對Effective Tags進行降噪過濾豐度小于5的序列,得到擴增子序列變異(ASVs);使用Classify-sklearn模塊將得到的ASVs與Greengene數據庫比對得到每個ASVs的物種信息。

使用軟件QIIME2計算observed_ASVs、Shannon、Simpson、Chao1、Goods_coverage,并繪制稀釋曲線(Rarefaction Curve);observed_ASVs表示觀測到的物種數目,指數越大說明觀測到的物種越多;Shannon和Simpson指數綜合體現物種的豐富度和均勻度,數值越大表示物種多樣性越高;goods_coverage表示覆蓋度,測序覆蓋度越高指數越大;同時基于observed_ASVs繪制物種累積箱形圖(Species accumulation boxplot),并計算Unifrac距離;使用軟件R繪制主坐標分析圖(PCoA)分析不同樣本的細菌群落結構差異;LEfSe分析通過軟件LEfSe來完成,默認設置LDA score閾值為4,設定>4為指示物種(有顯著差異性的物種)。

根際細菌群落功能進行預測使用軟件PICRUSt2;基于Greengene數據庫中的ASVs基因信息預測共同祖先的基因功能譜,從而對樣本菌群進行同源蛋白簇(Clusters of orthologous groups of proteins,COG)功能預測。

2 結果與分析

2.1 不同處理黃瓜幼苗生理代謝測定

正常處理N的葉片葉綠素和可溶性糖含量分別是2.440和10.380 mg/g,顯著高于處理D的1.547和8.356 mg/g(P<0.05);處理D的葉片中脯氨酸和丙二醛含量為51.807 μg/g和54.848 nmol/g,顯著高于處理N的32.628 μg/g和29.005 nmol/g;在根系活力中,處理N的根系活力為32.670 μg/(g·h),顯著高于處理D的20.714 μg/(g·h);處理N的超氧化物歧化酶(SOD)含量為324.826 U/g,顯著低于處理D的578.363 U/g(表1)。說明,相較處理N,干旱處理D黃瓜幼苗受到干旱脅迫,試驗處理正確,可用于后續試驗。

表1 不同處理對黃瓜幼苗生理指標的影響

2.2 不同處理黃瓜幼苗根際土壤細菌群落組成

通過NovaSeq PE250高通量測序并優化后,正常處理N和干旱處理D有效序列分別是83 466.2和78 798.6,堿基數目是21 171 896.6和19 962 790.6 nt,平均長度是254和253 nt,GC百分比分別是57.238%和56.444%(表2)。由圖1可知,持續抽樣下新的ASVs出現速率隨著樣本量的加大,箱形圖位置逐漸趨于平緩,說明測序結果可基本覆蓋樣品中所有的物種,數據量充分且已經能夠反映處理中土壤細菌群落情況,可用于后續數據分析。

圖1 Observde_ASVs物種累積箱形圖Fig.1 Observde_ASVs species accumulation boxplot

表2 測序數據質量

處理N和處理D共同的ASVs數為2050個,處理N獨有的ASVs是1365個,處理D獨有的是1695個,處理D較處理N多600個(圖2-a)。門分類水平下豐度排名第1的是變形菌門(Proteobacteria),占比分別是34.27%(處理N)和29.18%(處理D);豐度排名第2的是芽單胞菌門(Gemmatimonadota),占比分別是18.21%(處理N)和11.78%(處理D);豐度排名第3的是擬桿菌門(Bacteroidota),占比分別是7.20%(處理N)和13.53%(處理D);豐度排名第4的是酸桿菌門(Acidobacteriota),占比分別是10.16%(處理N)和9.61%(處理D);豐度排名第5的是放線菌門(Actinobacteriota),占比分別是9.36%(處理N)和10.48%(處理D)(圖2-b)。

a:ASVs 韋恩圖;b:門分類水平下細菌種類相對豐度熱圖(Top10)。a: Asvs venn diagram; b: Heat map of relative abundance of bacterial species at phylum level (Top10) .

2.3 不同處理黃瓜幼苗根際土壤細菌群落多樣性差異

對不同處理的α多樣性指數(Chao1、Shannon、Simpson)進行統計,從表3可知,處理D的Chao1、Shannon、Simpson均高于處理N,但差異不顯著。基于Weighted unifrac距離進行PCoA分析,PCoA1、PCoA2分別貢獻了35.54%和17.34%(圖3)。PCoA1將處理N和處理D分開,二者間差異顯著(R2=0.578,P=0.007)。處理N相較于處理D樣本點離散程度較小,表明干旱處理對黃瓜幼苗根際細菌群落結構具有較大的擾動。門分類水平下,處理N相較于處理D顯著上調的微生物為芽單胞菌門(Gemmatimonadota),下調的是擬桿菌門(Bacteroidota)和厚壁菌門(Firmicutes)(P<0.05)(圖4)。說明相較于正常處理N,干旱處理D顯著富集擬桿菌門(Bacteroidota)和厚壁菌門(Firmicutes)。利用軟件LEfSe(LDA值為4)差異分析屬分類水平上土壤細菌群落(圖5),處理N中芽單胞菌門(Gemmatimonadota)、變形菌門(Proteobacteria)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)和鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)顯著富集。處理D中,顯著富集的有擬桿菌門(Bacteroidota)[包括擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌目(Bacteroidales)、Muribaculaceae屬]和厚壁菌門(Firmicutes)[包括梭菌綱(Clostridia)、芽孢桿菌綱(Bacilli)]。說明這些細菌在黃瓜幼苗根際土壤細菌群落中是具有統計學差異的標志物種(Biomarker)。

圖3 Weighted unifrac PCoA分析Fig.3 Weighted unifrac PCoA analysis

圖4 黃瓜幼苗根際土壤細菌群落(門分類水平)Fig.4 Rhizosphere soil bacterial community in cucumber seedlings(phylum level)

圖5 黃瓜幼苗根際土壤細菌群落LEfSe差異分析Fig.5 LEfSe difference analysis of rhizosphere soil bacterial community in cucumber seedlings

表3 細菌群落多樣性指數

2.4 不同處理黃瓜幼苗根際土壤細菌群落功能預測

基于同源蛋白簇(COG)數據庫使用PICRUSt 2對不同處理細菌群落功能進行注釋。處理D中獨有的COG為70個,顯著高于處理N的11個(圖6-a、6-b),其主要表現在RNA加工和修飾、染色質結構和動力學、轉錄、氨基酸運輸和代謝、碳水化合物的運輸和代謝等。處理N中獨有的KEGG代謝通路有7條,少于處理D的12條(圖6-c),包括芳香化合物、l-谷氨酸等降解和CMP-假氨基甲酸酯、四氫甲蝶呤等的合成(表4);處理D極顯著(P<0.001)高于處理N的豐度值,代謝通路豐度前3位的是與硫胺素相關的合成途徑、嘌呤核苷酸從頭生物合成超途徑II、葡萄糖和木糖降解超途徑。此外還有次級代謝物的合成與降解途徑,如吡哆醛5’-磷酸合成、香葉基香葉基二磷酸生物合成I、甲羥戊酸途徑I、甘露聚糖降解、乙炔降解、乳糖和半乳糖降解等(表5)。

圖6 黃瓜幼苗根際土壤細菌群落COG韋恩圖(a)、柱形圖(b)及KEGG韋恩圖(c)Fig.6 Rhizosphere soil bacterial community COG veen plot (a), column plot (b) and KEGG veen plot (c) in cucumber seedlings

3 討 論

干旱脅迫嚴重影響植物的生長發育,表現為葉片萎蔫、光合減弱、膜脂過氧化、丙二醛積累對細胞產生毒害等,而逆境中植物會產生各種應對策略,如ABA調節氣孔關閉,Pro參與滲透壓調節,保護酶清除體內活性氧和自由基等[11]。本試驗中,干旱處理黃瓜葉片葉綠素、可溶性糖含量和根系活力顯著低于正常處理,脯氨酸、丙二醛、超氧化物歧化酶含量則顯著高于正常處理,與陳文妃等[12]干旱降低了黃瓜植株根系活力,而提高脯氨酸、SOD、丙二醛等含量結果一致。

不同環境下植物可改變其根分泌物的組成,影響根際土壤微生物群落組成和豐度變化[13]。本試驗中2個處理的α多樣性指數無顯著差異,但PCoA分析中2個處理在PCoA1軸(35.54%)顯著分離,說明干旱和非干旱下黃瓜根際細菌群落區別明顯,這與張江偉等[14]、梁新波等[15]結果一致。此外2個處理樣本點離散程度有一定差異,處理D各樣本點離散程度較大,表明干旱對黃瓜根際細菌群落結構擾動較大,也可能在干旱條件下生理代謝途徑存在差異,進而引起分泌化合物組分及相對豐度的差異,間接導致根際細菌結構組分的不同[16]。韋海波等[5]發現長雄野生稻在干旱脅迫下,相對豐度顯著升高的類群有酸桿菌門(Acidobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、泉古菌門(Crenarchaeota)、放線菌門(Actinobacteria)和α-變形菌(Alphaproteobacteria)等,而螺旋菌門(Spirochaetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、綠菌門(Chlorobi)和δ-變形菌(Deltaproteobacteria)等的相對豐度顯著下降。丁紅等[17]表明花生在干旱低氮下放線菌門、酸桿菌門、厚壁菌門相對豐度顯著增加,變形菌門豐度顯著下降。試驗中正常處理與干旱處理相比,芽單胞菌顯著上調,擬桿菌和厚壁菌下調,表明干旱處理中擬桿菌和厚壁菌顯著富集。LEfSe分析表明,處理N中顯著富集的指示微生物是芽單胞菌門、變形菌門、芽單胞菌屬和鞘脂單胞菌科,干旱處理中則是擬桿菌門下擬桿菌綱、擬桿菌目、Muribaculaceae屬和厚壁菌門下梭菌綱、芽孢桿菌綱顯著富集,說明這些細菌對干旱下黃瓜根際環境變動較敏感。擬桿菌門和厚壁菌門參與土壤有機質分解和分泌物多糖代謝過程[18-19],擬桿菌作為多糖降解途徑的主要成員,能將復雜多糖轉化為可利用的化合物,使其能高效利用植物根系分泌的多糖化合物,在特定環境(干旱、低肥)中更具競爭力[19]。擬桿菌門Muribaculaceae科在降解復雜碳水化合物上具有功能多樣性,表現出對復雜多糖有較高敏感性[19-20]。植物受中度或短期干旱時會增加根部碳水化合物的儲存,提高根系分泌物主糖類、氨基酸、有機酸和黃酮類等次生代謝物的濃度,而重度或長期干旱時,根系生長停止,正反饋效應也停止[21]。因此在黃瓜干旱前中期,Muribaculaceae科可作為響應黃瓜干旱的指示物種。厚壁菌多數為革蘭氏陽性有益菌,產生乙酸鹽、丁酸鹽、乳酸鹽和抗菌物質,可防止病原體入侵植物體[18, 22]。干旱處理下厚壁菌門中的梭菌綱和芽孢桿菌綱顯著富集,其具有固氮和纖維素降解能力,同時芽孢桿菌分泌的脂肽類物質可作為誘導因子,激發植物抗逆性,使植物通過乙烯途徑和水楊酸途徑正調控誘導抗病相關基因表達[22-24],這些微生物可能對黃瓜抵御干旱逆境起重要指示作用。

PICRUSt 2功能預測結果顯示,干旱處理對黃瓜根際細菌群落功能具有較高的誘導和促進作用,主要以RNA加工和修飾、染色質結構和動力學、轉錄、氨基酸運輸和代謝、碳水化合物的運輸和代謝等為主,表明干旱處理顯著提高菌群質膜上轉運蛋白的表達,介導氨基酸、糖類脂質、次級代謝物等的耗能轉運等功能,這與De等[25]和孫中興等[26]的干旱、鹽脅迫下植物根際微生物群落的功能一致。KEGG代謝途徑注釋發現,干旱處理顯著提高與硫胺素、香葉基香葉基二磷酸、甲羥戊酸等氨基酸、嘌呤嘧啶和次級代謝物相關的合成途徑,同時提高以糖類、氨基酸等為主的降解途徑,和降低了某些正常代謝途徑等。表明干旱處理下黃瓜植株通過根系合成復雜多糖類和氨基酸參與滲透調節,導致相關細菌群落顯著富集。干旱處理下黃瓜根際細菌群落功能中硫胺素相關合成途徑表達顯著上調,說明硫胺素在植物應對生物脅迫(炭疽病和白粉病)[27]和非生物脅迫(干旱、高鹽)[28-29]過程中起重要作用,Wei等[30]對干旱條件下的楓楊施加外源硫胺素,可有效緩解干旱脅迫對楓楊的影響,并激活8個葉綠素合成基因的表達,提高葉綠素含量,同時刺激主要由生長素介導的信號通路中的基因表達,從而提高耐旱性。這一結果為微生物參與黃瓜抗旱研究及黃瓜種植生產中相關益生菌的利用提供新思路。

4 結 論

黃瓜幼苗根際細菌群落多樣性在干旱處理與正常處理下無顯著差異,但干旱處理顯著改變細菌群落結構;干旱脅迫對某些細菌相對豐度產生劇烈影響,顯著增加根際細菌群落有益細菌種類豐度和功能豐度;上調與硫胺素等次級代謝物相關的合成途徑和以糖類、氨基酸為主的降解代謝途徑。該研究結果為黃瓜抗旱生長中發掘相關有益微生物提供基礎和為其他作物研究提供思路。