春尺蠖熱激蛋白AcinHsp70基因的克隆、分子特性與表達分析

陳 龍,朱圣杰,崔闊澍,路 慧,王 靖,郝雅嫻

(1. 河套學院農學系,內蒙古 巴彥淖爾 015000; 2. 四川省農業技術推廣總站,成都 610041)

【研究意義】春尺蠖(Apocheimacinerarius)屬于鱗翅目、尺蛾科昆蟲,食性呈多樣化。該蟲主要分布于我國北方多個省(市、自治區),危害牧草、林木和經濟樹種[1-2]。近年來,危害對象逐漸由楊、桑、柳、檸條及經濟類林木擴散到玉米和小麥等大田作物,危害區域也由北(內蒙古、新疆和河北等地)向南(四川、云南等)擴散。春尺蠖3齡幼蟲于4月上旬出現并發生危害,此時內蒙古西部檸條天然草場的晝夜溫差達10 ℃,能在如此惡劣環境中生存下來并發生危害,與其較強的抗寒性密不可分。熱激蛋白(HSP)作為昆蟲生存重要的調控因子,在昆蟲生長、發育和繁殖以及在抵御外界不利環境的脅迫中具有重要作用[3-6]。因此,研究Hsp基因在春尺蠖對溫度脅迫的響應機制具有重要意義。【前人研究進展】近年來,有關Hsp70基因的序列及在高溫和低溫脅迫下的表達均有報道。例如,韭菜遲眼蕈蚊(Bradysiaodoriphaga)在40 ℃高溫處理下,體內Hsp70與sHsp均上調表達[7]。綠豆象成蟲高溫處理后,CcHsp70-5基因表達量顯著上調,推測該基因有助于綠豆象成蟲抵御高溫脅迫[8]。對梨小食心蟲(Grapholithamolesta)[5]和空心蓮子草葉甲(Agasicleshygrophila)[9]進行高溫處理后,發現Hsp70基因表達量顯著上調。對赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)不同齡期幼蟲高溫脅迫1 h中的研究發現,Hsp70基因的表達均不同程度上調1.1～2.0倍[10]。Li等[11]通過對松墨天牛(Monochamusalternatus)MaltHsp70-2的沉默研究中發現,在沉默MaltHsp70-2基因后,成蟲的耐熱性顯著降低,該基因可能在成蟲耐熱性中扮演重要角色。在低溫脅迫中,Hsp70基因同樣起到保護昆蟲機體的作用。如黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)在-7 ℃低溫條件下1 h,Hsp70基因表達量顯著上調[12]。褐飛虱(Nilaparvatalugens)Hsp70的表達量在低溫脅迫中下降,但不受高溫影響[13]。此外,Hsp70不同亞族基因對高、低溫脅迫也表現出不同的響應模式[14-15]。【本研究切入點】為深入探究熱激蛋白70基因在春尺蠖應對低溫脅迫中的作用,本研究基于前期組學數據,篩選Hsp70基因,結合Blastp和RT-PCR 技術克隆獲取1個Hsp70基因,對其分子特征、理化性質和系統進化關系進行分析,同時分析該基因在不同溫度和4 ℃不同時間脅迫下的表達譜。【擬解決的關鍵問題】明確Hsp70基因在春尺蠖3齡幼蟲響應低溫脅迫中的作用,為深入探究春尺蠖應對逆境脅迫的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

春尺蠖雌雄成蟲在2021年春季采集于內蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗檸條草場(108°45′23.63″ E,40°46′4.19″ N),帶回實驗室后在室溫下以檸條錦雞兒成對飼喂養,將所產卵置于恒溫(22±1) ℃、光周期L∶D=18∶6、相對濕度55%～59%的ZXQP-R1700 上海智城人工氣候箱中孵化,孵化出的幼蟲以檸條錦雞兒連續飼養,待幼蟲發育至3齡,選取供試幼蟲(蛻皮后2 d)做以下處理:①在-10、-5、0、5和25 ℃不同溫度下各處理1 h;②在4 ℃下處理0.5、1、3、5和7 h。每個處理3次重復,每次重復5頭幼蟲,處理結束后用液氮速凍,置于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2 主要試劑

RNA提取、反轉錄、DNA純化、pMD19-T連接載體和PCR Mix均購于大連寶生物有限公司;DH5α感受態細胞等購于天根生化科技有限公司(北京)。

1.3 RNA提取及cDNA第1鏈的合成

選取1.1中處理的春尺蠖樣品,置于高溫滅菌后的研缽中添加液氮研磨,RNA提取步驟參照TaKaRa RNA提取試劑盒說明書。分別利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和Nano PhotometerTMP-Class超微量分光光度計檢測RNA的質量和濃度,待檢測指標合格后將RNA反轉合成第1鏈。

1.4 春尺蠖AcinHsp70基因的克隆

根據前期河套地區綠色農產品安全生產與預警控制實驗室已經獲取的春尺蠖幼蟲低溫脅迫的轉錄組數據,以Hsp70為關鍵詞在轉錄組數據庫基因功能注釋中搜索,結合NCBI BlastP驗證,篩選出具有完整CDS序列的Hsp70基因,命名為AcinHsp70(GenBank登錄號:OP750249)。根據轉錄組數據庫中的基因序列信息,利用Primer Premier 5.0軟件在AcinHsp70基因第74～2055 bp范圍內設計RT-PCR擴增引物(表1)來完成基因完整CDS的擴增。

表1 春尺蠖AcinHsp70的克隆與qRT-PCR檢測引物

PCR反應體系為25 μL,其中cDNA擴增模板1 μL,F/R引物各1 μL,PCR Mix 12.5 μL,最后無酶水補齊至25 μL。

PCR反應條件:首先進行5 min 94 ℃的預變性;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,運行30個循環;72 ℃運行10 min完成延伸過程,最后4 ℃低溫保存。PCR擴增完成后,擴增產物用1.0%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測AcinHsp70基因的擴增狀況,而后經PCR產物膠回收、亞克隆后提取質粒送測序上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.5 春尺蠖AcinHsp70基因的生物信息學分析

在NCBI 中利用(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線網站預測春尺蠖AcinHsp70基因的編碼蛋白區。使用在線預測工具ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)預測春尺蠖AcinHsp70基因編碼氨基酸的基本理化性質;使用DNAMAN 6.0軟件分析春尺蠖及其他目昆蟲的熱激蛋白70基因氨基酸序列一致。利用SignalIP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線網站預測春尺蠖AcinHsp70基因蛋白N端信號肽;蛋白跨膜區域則利用TMHMM在線網站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行預測;利用在線網站WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行亞細胞定位分析;磷酸化位點和糖基化位點預測分別選用在線預測網站NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和DictyOGlyc1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/)在線預測。利用MEGA6.0軟件構建系統進化樹,參數為鄰接法(Neighbor-joining, NJ)、P距離(P-distance),運行1000次。

1.6 春尺蠖AcinHsp70基因的表達

利用RT-qPCR檢測春尺蠖Hsp70基因在不同溫度及4 ℃不同時間處理下的表達譜,內參基因選用Actin,引物見表1,反應體系為20 μL:模板cDNA 2 μL,上/下游引物各0.4 μL,GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL,以Free Water將體系補至20 μL,GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒說明書作為本實驗的參照程序。

1.7 數據統計與分析

應用SPSS 20.0軟件中的單因素方差分析中的Duncan多重比較分析對AcinHsp70基因差異表達情況統計分析,利用GraphPad Prism 7.0 軟件作圖。柱形圖結果用平均值±標準誤表示,差異顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 春尺蠖AcinHsp70基因的克隆

根據轉錄組數據庫中已有的春尺蠖AcinHsp70序列信息,在基因編碼蛋白區設計引物擴增目的基因CDS序列,以AcinHsp70的F/R為引物在目的基因外圍擴增1988 bp的片段,經濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測在2000 bp處發現一條特異性單一條帶(圖1),經測序后發現上述條帶分別包含轉錄組數據中1899 bp的Hsp70基因序列且序列信息比對一致。

M:DL2000 DNA Marker;1:春尺蠖 AcinHsp70 的PCR擴增產物。M: DL2000 DNA Marker; 1: PCR products of AcinHsp70.

2.2 AcinHsp70基因蛋白的生物信息學分析

春尺蠖AcinHsp70蛋白基因完整的CDS區為1899 bp,預測分子式為C3052H4904N876O971S16,共編碼633個氨基酸,預測蛋白質分子量和等電點分別為69.91 kDa和5.51,負電荷殘基(Asp + Glu)總電荷為95,正電荷殘基(Arg + Lys)總電荷為83,半衰期和脂肪指數分別為30 h和82.62。該蛋白的平均親水性為-0.507,預測不穩定系數為33.19,故該蛋白屬于親水穩定蛋白,N端氨基酸為蛋氨酸(Met, M)。AcinHsp70基因蛋白具有Hsp70家族簽名序列(圖2),在N端均不含信號肽且無跨膜區。磷酸位點檢測分別發現絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸位點24、26和8個(圖3);未發現糖基化位點(圖4)。此外,亞細胞定位結果發現其主要位于細胞質(圖5)。

圖3 春尺蠖AcinHsp70蛋白的磷酸化位點預測Fig.3 Prediction of the phosphorylation sites of the AcinHsp70 protein from A. cinerarius

圖4 春尺蠖AcinHsp70基因的糖基化位點預測Fig.4 Prediction of the glycosylation sites of the AcinHsp70 gene from A. cinerarius

圖5 春尺蠖AcinHsp70基因的亞細胞定位預測Fig.5 Prediction of the subcellular localization of the AcinHsp70 gene from A. cinerarius

2.3 春尺蠖AcinHsp70基因蛋白的序列一致性比對及系統進化關系分析

將春尺蠖AcinHsp70基因的氨基酸序列與NCBI中搜索得到的其它鱗翅目昆蟲序列進行比對,春尺蠖與慶網蛺蝶的一致性最高(圖6),達92.91%,其次為美洲棉鈴蟲(Helicoverpazea)、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、柞蠶(Antheraeapernyi),一致性分別為91.80%、91.80%和91.17%,均在90%以上;而與斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、家蠶(Bombyxmori)BmorHsp70A1和BmorHsp70的一致性均在90%以下,分別為89.11%、89.84%和83.88%。

Hsp70蛋白來源物種及其 GenBank 登錄號。AcinHsp70: 春尺蠖 A. cinerarius Hsp70(MZ689788); McinHsp70-2:慶網蛺蝶 M. cinxia Hsp70-2(AGR84224.1); HzeaHsp70:美洲棉鈴蟲 H. zea Hsp70(ACV32640.1); AperHsp70-2: 柞蠶 A. pernyi Hsp70-2(ALL42052.1);HarmHsp70:棉鈴蟲H. armigera Hsp70(ADP37711.1);SlitHsp70:斜紋夜蛾S. litura Hsp70(ADV03160.1);BmorHsp70A1:家蠶B. mori Hsp70 A1(NP_001296526.1);BmorHsp70:家蠶(NP_001037396.1);Consensus: 共有序列。

通過NCBI搜索其它目昆蟲已上傳的Hsp70基因的氨基酸序列與春尺蠖AcinHsp70序列信息結合構建系統進化樹。系統進化結果顯示(圖7),春尺蠖AcinHsp70與鱗翅目昆蟲Hsp70聚為一類,且與同鱗翅目昆蟲的慶網蛺蝶親緣關系最近。

春尺蠖AcinHsp70蛋白用三角標記。AcinHsp70 protein of A. cinerarium is marked with filled triangle.

2.4 春尺蠖AcinHsp70基因在不同溫度脅迫下的表達譜

從圖8中可知,AcinHsp70基因在回溫與不回溫下的表達量均在-10 ℃達到最大值,不回溫條件下,隨著溫度上升表達量下降,除-10 ℃外,其余溫度條件下差異不顯著(P>0.05);回溫條件下,隨著溫度上升表達量也呈下降趨勢,其余溫度條件下差異顯著(-5與0 ℃、5與25 ℃之間無顯著差異)(P<0.05);在相同溫度下,除-10 ℃外,其余溫度下基因表達量回溫后均呈上升趨勢,除5和25 ℃外,表達量差異顯著(P<0.05)。

圖8 春尺蠖AcinHsp70基因在不同溫度脅迫下的表達量Fig.8 Expression profile of AcinHsp70 gene under different temperature stress of A. cinerarius

2.5 春尺蠖AcinHsp70基因在4 ℃不同時間脅迫下的表達譜

從圖9中可知,AcinHsp70基因在4 ℃處理1 h 后表達量達最大值,總體呈先上升后下降趨勢,在上升和下降階段(除3和5 h)表達量均差異顯著(P<0.05)。

圖9 春尺蠖AcinHsp70基因在4 ℃不同時間脅迫下的表達譜Fig.9 Expression profile of AcinHsp70 gene in A.cinerarius under 4 ℃ stress for different time

3 討 論

本研究基于前期已獲取的春尺蠖幼蟲不同溫度脅迫下的轉錄組數據,從中篩選獲取Hsp70基因,結合NCBI BlstP和RT-PCR技術,克隆獲取Hsp70基因完整的CDS區,命名為AcinHsp70,同時上傳NCBI獲取GenBank登錄號OP750249。在對春尺蠖AcinHsp70基因1899 bp的CDS區域分析中發現,該基因蛋白氨基酸尾部序列為EEVD,還發現3個Hsp70基因家族特有的標簽序列,所以表明Hsp70屬于胞質型Hsp70基因家族。此外,Hsp70基因蛋白的亞細胞定位結果顯示,該基因主要位于細胞質中,進一步證實了上述結論。

Hsp70基因家族中2個亞家族誘導型Hsp70和結構型Hsc70,主要區別在于結構型Hsc70存在多個GGXP序列結構,而誘導型Hsp70則沒有。通過分析AcinHsp70基因編碼的蛋白序列,未發現該特征序列,同時結合表達譜情況(受溫度誘導表達),進一步確認AcinHsp70是誘導型Hsp70基因。

從春尺蠖Hsp70基因與其它昆蟲的系統進化樹中發現,Hsp70基因在不同種類昆蟲中具有較高的保守性,春尺蠖Hsp70基因與同為鱗翅目的慶網蛺蝶序列一致性最高,且具有較高同源性,但半翅目同翅亞目昆蟲Hsp70基因相似度較低,系統進化樹表現為半翅目的褐飛虱和同翅目的白背飛虱(Sogatellafurcifera)聚為一類,沒有和半翅目昆蟲的中華淡翅盲蝽(Tytthuschinensis)聚為一類,與同種的Hsp70基因親緣關系較遠,張青等[16]、譚瑤等[17]研究也出現類似結果,原因可能是與其親緣關系更近的昆蟲Hsp70還未被鑒定出來。本研究的春尺蠖未發現此現象,春尺蠖與慶網蛺蝶Hsp70親緣關系最近,序列一致性達92.91%。

HSP70是生物體對外界溫度脅迫響應聯系緊密的一類蛋白質,相關研究也證實其在昆蟲抵抗高/低溫脅迫中具有重要作用[18-19]。春尺蠖3齡幼蟲最早于4月上旬開始發生危害,此時當地晝夜溫差較大(最大可達10 ℃),能在如此環境中生存下來且發生危害,與其極強的抗寒性密切相關,3齡幼蟲作為危害的臨界期,在該時期防治可以有效控制種群數量。本研究對春尺蠖3齡幼蟲進行不同溫度(-10、-5、0、5和25 ℃)回溫與不回溫及4 ℃不同時間(0、0.5、1、3、5和7 h)處理,通過qPCR技術檢測AcinHsp70的mRNA表達水平來探討該基因對溫度的響應。在低溫條件下,灰飛虱體內的LsHsp70基因和LsHsc70基因均可被誘導表達[12],但是Kim等[20]卻發現灰飛虱體內另外2種Hsp70基因卻不受低溫誘導。大螟(Sesamiainferens)在應對低溫脅迫時Sihsc70的表達并不顯著[21]。低溫可以誘導黑腹果蠅Hsp70Aa,但卻不能誘導Hsc70-1[22]。本研究中AcinHsp70基因不回溫下的表達量在-10 ℃達到最大值,其余溫度無顯著差異,結果表明AcinHsp70基因可被低溫誘導表達,但僅限-10 ℃,高于-10 ℃的低溫不需要更多的Hsp70,在常溫下體內表達的Hsp70可以應對高于-10 ℃的低溫脅迫。昆蟲體內的多種Hsp70基因表達呈現多樣化,說明昆蟲體內不同Hsp70發揮不同作用。

在研究對環境應激的反應時,必須注意涵蓋暴露和恢復兩種情況[23]。本研究中,春尺蠖AcinHsp70在1 h低溫處理后基因表達量未發生顯著變化(-10 ℃除外),但在25 ℃回溫30 min后發生顯著上調(5 ℃除外),5 ℃雖然未發生顯著上調,卻呈上升趨勢。在黑腹果蠅的研究中發現,Hsp70Aa基因表達量均在低溫處理期間未發生明顯變化,在回溫后則發生明顯上調[23]。推測春尺蠖在-10 ℃處理回溫30 min后,Hsp70基因表達量逐步降低,可能因為在回溫30 min后體內不需要大量的Hsp70蛋白,需要更多的回溫時間才能實現表達上調,例如在對大豆蚜若蚜高溫脅迫回溫2 h后,Hsp70基因的表達量顯著影響上調[24]。

有研究表明,熱激蛋白的表達有助于提高生物抵御逆境的能力,但是會消耗體內很多能量,對其它蛋白的合成造成影響,嚴重時會造成壽命縮短和生殖能力下滑,所以顯著的誘導表達不能長久和穩定[25]。本研究將春尺蠖3齡幼蟲在4 ℃條件下處理,隨著處理時間延長,AcinHsp70基因的表達量先上升后下降,在1 h處達到最大值,達到對照的23.92倍,在上升和下降階段(除0.5和7 h)差異顯著(P<0.05)。韓嵐嵐等[24]和譚瑤等[17]分別對大豆蚜(Aphisglycines)熱激和沙蔥螢葉甲(Galerucadaurica)卵低溫處理后也發現類似的結果,由此推測,隨著低溫脅迫時間的延長,過多的變性蛋白影響了AcinHsp70的表達。

4 結 論

獲取了春尺蠖誘導型Hsp70基因,對其分子特征與低溫脅迫下的表達情況進行分析,在春尺蠖體內存在結構型和誘導型Hsp70,今后筆者將對2種熱激蛋白基因進一步研究,才能深入系統地了解Hsp70基因家族在響應外界不利環境中的作用機理。此外,本研究僅從基因水平對AcinHsp70研究,蛋白水平及缺失研究也十分重要。春尺蠖雌雄成蟲最早于2月下旬羽化出土,所處溫度遠低于-10 ℃,Hsp70基因在成蟲低溫應激的機制更為突顯,需進一步研究。