楊樹UGT198基因的生物信息學分析、基因克隆及功能初探

楊改霞,王春雨,龍連香,王世杰,顧麗姣

(河北農業大學林學院/河北省林木種質資源與森林保護重點實驗室,河北 保定 071001)

【研究意義】楊樹是世界主要造林樹種之一,生長迅速、適應性強,是我國主要的速生經濟林樹種[1],其生長發育過程中容易遭到鱗翅目害蟲的侵蝕[2],而煙草的主要蟲害同樣為鱗翅目害蟲[3],且煙草的遺傳轉化相較于楊樹周期短、難度低,因此采用煙草進行功能的初步驗證。本研究利用現代生物技術開展楊樹自身抗蟲基因研究,篩選自身抗蟲基因,激發自身防御能力,對提升轉基因楊樹的環境安全性具有重要意義。【前人研究進展】糖基轉移酶是一種可以催化特定的糖基供體轉移到受體分子并形成糖苷鍵的活性蛋白質,其廣泛存在于多種生物體中,特別是在植物的生長發育、開花結果等不同生命階段中發揮不可或缺的作用[4]。目前對于糖基轉移酶的研究主要集中在擬南芥[5-6]、水稻[7]、大豆[8]、陸地棉[9]等植物中,例如李攀等[10]在擬南芥中鑒定出2個糖基轉移酶基因UGT79B2/UGT79B3不僅參與鹽脅迫和干旱脅迫響應,還參與冷凍脅迫響應。過表達CsUGT73D1的轉基因煙草和擬南芥生長發育進程加快、葉片腺毛減少[11]。黃娟等[12]研究克隆了陸地棉UGT家族基因GhUGT85O1(GenBank登錄號: KP300000),實時熒光定量PCR結果表明,該基因在衰老葉片中大量表達,并且受脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)和聚乙二醇(PEG)誘導。過表達UGT76C2在擬南芥中能夠影響與干旱脅迫相關基因的表達,從而提高過表達株系的抗旱能力[13]。狄少康等[14]構建植物過表達載體,通過花序浸染法轉化擬南芥,過量表達UGT73C19可以提高轉基因植物中黃酮醇糖苷和類黃酮含量。UGT擁有廣泛的生理功能,部分糖基轉移酶通過催化萜類、類固醇、苯丙素、類黃酮等小分子物質合成來提升植株抗蟲性,如水稻葡萄糖基轉移酶UGT基因Os07g32020通過調控主要類黃酮化學物的生化前體柚皮素合成,提高水稻的抗蟲性[15]。CtUGT49可催化底物的多個羥基位點,葡萄糖基轉移酶UGT基因的上調表達可促進蕓香糖苷和蘆丁合成,而這兩種物質對昆蟲具有一定毒害性[16]。糖基轉移酶在楊樹中也有報道,Veljanovski和Constabel[17]首次從雜交楊樹(毛果楊×三角葉楊)中克隆和鑒定UGT,底物特異性和動力學分析表明,其中至少1種UGT在黃酮醇和花青素的修飾中可能發揮作用。于惠敏等[18]從毛白楊中克隆了1個糖基轉移酶基因PtSGT1,經過酶活性分析, 證明該酶是楊樹的酚酸類物質糖基轉移酶。張一凡等[19]研究了楊樹PtrGT14成員對鹽脅迫的響應情況,結果發現PtrGT14基因中3個基因(Potri.017G075600、Potri.011G119600 和 Potri.001G053800)參與鹽脅迫響應,此外糖基轉移酶參與木本植物次生細胞壁中碳水化合物的合成和架構,直接影響木質部的發育過程[20],而關于糖基轉移酶在楊樹抗蟲性方面的研究還未見詳細報道。【本研究切入點】前期通過對公共轉錄組數據研究發現,PtrUGT198在楊樹響應蟲害的轉錄組中高調表達。本研究對PtrUGT198進行生物信息學分析并通過克隆楊樹UGT198基因,構建過量表達載體,通過農桿菌介導法轉入煙草獲得過量表達轉基因株系,進行強制性飼蟲實驗初步驗證UGT198基因是否參與調控抗蟲性。【擬解決的關鍵問題】本文為進一步研究UGT198基因功能及是否參與抗蟲性的相關研究奠定基礎,通過轉基因煙草飼蟲試驗進行驗證,為篩選楊樹內源性抗蟲基因及解析楊樹抗蟲機制提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用野生型煙草(Nicotianatabacum)組培苗和歐美楊107(Populus×euramericana)。菌株及載體質粒為大腸桿菌(Escheriachiacola)DH5α感受態細胞(購自上海昂羽生物技術有限公司)、農桿菌(Agrobacteriumtumefaciehs) EHA105(購自普因特生物工程有限公司)、pNC-Cam2304-35S(由中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所言普博士提供)。常用藥劑及培養基為6-BA、IBA溶液(1 mg/mL)、Kana溶液(100 mg/mL)、Tim溶液(200 mg/mL)、Rif溶液(40 mg/mL)和AS溶液(200 mmol)。

侵染液為MS+蔗糖30 g/L+葡萄糖酸鈣0.65 g/L+MES 0.5 g/L+肌醇 0.1 g/L+2,4-D 1.0 mg/L+KT 0.1 mg/L,pH 5.5～5.6,其它常用培養基在前人研究基礎上加以改良[21],篩選培養基中加入50 mg/L Kana和300 mg/L Tim的 MS培養基。

1.2 PtrUGT198的生物信息學分析

根據毛果楊的全基因組序列,利用NCBI的ORFfinder(http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)在線分析出PtrUGT198基因的CDS序列和其編碼的氨基酸序列;利用Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)在線分析PtrUGT198蛋白的相對分子質量和等電點等理化性質;利用在線軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和SWISS MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)分別對PtrUGT198蛋白質的二級和三級結構進行預測;利用TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分別進行跨膜區分析;利用在線軟件SignalP 4.1(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)對PtrUGT198蛋白進行信號肽預測,磷酸化位點用NetPhos 3.1(https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)進行分析,利用NCBI數據庫和Phytozome數據庫對PtrUGT198基因進行同源基因搜索,用DNAMAN對PtrUGT198基因及同源基因的氨基酸序列進行多重比對,再通過MEGA 7.0軟件采取NJ法構建分子系統進化樹。

1.3 基因克隆及過表達載體構建

參 考 NCBI 網 站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)毛果楊基因組序列,根據基因序列,利用 Primer 5.0 軟件設計引物,引物合成由通用生物(安徽)股份有限公司完成。提取歐美楊107楊植株葉片的總RNA,反轉錄成cDNA,以cDNA為模板進行 PCR克隆,用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物,并用膠回收試劑盒(杭州倍沃醫學科技有限公司)回收PCR產物;進一步將產物連接到過表達載體 pNC-Cam2304-35S上(體系配制詳見表1),PCR運行程序為 50 ℃ 30～60 min;并轉化感受態細胞 DH5α,37 ℃、200 r/min 搖菌 1 h,經離心后吸除大部分上清液,剩余菌液在含抗生素的LB固體培養基平板上倒置、過夜培養,挑取單菌落,37 ℃恒溫搖床培養12～16 h,200 r/min,菌液PCR 驗證是否為陽性克隆。PCR檢測陽性的菌液由北京擎科生物有限公司完成測序。比對測序結果,可行的測序結果連接農桿菌感受態EHA105、挑取單克隆進行 PCR 驗證,過表達載體構建完成。

表1 重組過表達載體構建體系

1.4 遺傳轉化及功能初步驗證

1.4.1 葉盤法轉化煙草 將保存于-80 ℃超低溫冰箱中的農桿菌載體取出,吸取100 μL菌液,28 ℃、150 r/min搖床上搖菌,過夜,至OD值為0.6,菌液轉移至 50 mL 離心管中進行離心,24 ℃、4000 r/min、10 min。棄菌液將農桿菌菌塊轉移至重懸液然后進行煙草轉化,挑選生長狀態良好、葉色鮮綠的煙草幼苗,取其葉片并去除主脈,剪成大小約1 cm×1 cm,將剪好的葉片置于侵染液中侵染10 min,期間輕晃液體,使葉片與菌液充分接觸;將浸染過的葉片取出,用吸水紙(經高壓滅菌)吸干表面多余菌液,平鋪于無抗生素的煙草分化培養基上,黑暗條件下共培養36～48 h;共培養結束后,將煙草葉片轉至篩選分化培養基上繼續培養,于25 ℃、2000 LX,光/暗周期16 h/8 h條件下培養,每2周更換1次培養基;當煙草葉片上長出嫩芽至1 cm左右時,將顏色鮮綠的抗性芽轉至篩選生根培養基上繼續篩選,直至長出不定根。

1.4.2 轉基因煙草的獲得、煉苗及移栽 待煙草苗不定根長至1 cm左右時,挑選生長狀態良好的轉基因煙草幼苗,于通風處打開封口膜煉苗3 d,將幼苗從組培瓶中取出,清水洗凈根部的培養基盡量保持根系的完整性,栽植在v(園土)∶v(營養土)∶v(蛭石)=1∶1∶1的花盆中,于溫室中進行培養。初期用塑料保鮮膜對幼苗進行覆蓋,保持高濕狀態,避免幼苗因失水而萎蔫死亡。待幼苗有新葉展出,逐步掀除薄膜使幼苗逐漸適應溫室環境。

1.5 轉基因煙草鑒定及qPCR驗證

1.5.1 PCR檢測 為驗證目的基因是否成功導入煙草中,在轉基因煙草移栽生長第30天,選取第4片生長良好的葉片分別提取對照煙草苗和轉基因煙草苗的DNA(康為世紀生物科技股份有限公司),對于超表達陽性植株的檢測通過比較未轉化苗(陰性對照)、轉化苗及pNC-UGT198為陽性對照擴增目的基因(表2)來檢測,PCR擴增驗證結果應為陰性對照無條帶,轉化苗和陽性對照有條帶。

表2 引物序列

1.5.2 qPCR檢測 使用RNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物)提取轉基因煙草和未轉基因煙草的RNA,參照“哧溜”極速反轉錄試劑盒(北京聚合美生物科技有限公司)說明書,將提取的 RNA 反轉錄成 cDNA,將反轉錄的cDNA稀釋10倍作為模板,以Actin為內參基因(表2),按照熒光定量試劑盒說明書(天根生化北京)進行實時熒光定量PCR檢測(Agilent Mx3005P),體系配制詳見表3,程序Stage1: (1 cycle) 95 ℃ 2 min;Stage2: (40 cycles) 95 ℃ 5 s,60 ℃ 15 s,每個樣品重復3次,反應完畢后,收集數據進行計算,表達量按照 2-ΔΔct計算,用以后續試驗。

表3 qRT-PCR體系

1.5.3 煙草飼蟲試驗 選擇生長健壯的轉基因煙草株系(3個)和野生型煙草,剪取葉面積相同的葉片進行飼蟲試驗。購買2齡棉鈴蟲,喂食飼料于培養箱中培養24 h,次日剪取煙草葉片,正面朝上置于鋪有濾紙的培養皿中,濾紙上噴滴清水保濕,于培養皿中飼喂棉鈴蟲幼蟲。每個培養皿中單獨放有相同葉面積轉基因煙草株系(3個)和野生型煙草的葉片,挑選生長一致的蟲體,每個皿中放置10只棉鈴蟲,進行飼蟲試驗,重復3次。于4、8、24 h拍照記錄各株系葉面積損失情況。置于溫度(27±2)℃,相對濕度65%±5%,光/暗周期16 h/8 h培養箱中培養。

2 結果與分析

2.1 PtrUGT198蛋白的生物信息學分析

2.1.1 理化性質、蛋白質二級和三級結構 對毛果楊的PtrUGT198基因進行分析,結果表明,毛果楊PtrUGT198基因完整的ORF區為1440 bp,編碼479個氨基酸,其終止密碼子為TGA;利用Protparam 在線分析PtrUGT198蛋白的理化性質,預測出該蛋白分子量為53.14 kDa,分子式為C2399H3761N629O695S19,亮氨酸(Leu)含量最高(占12.7%),半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)含量最低(占1.5%),不含苯丙氨酸(Pyl),等電點為5.92,呈酸性,不穩定系數為44.17,大于40,疏水性為-0.059,是負值,表明PtrUGT198蛋白是酸性且不穩定的疏水蛋白;用SOPMA軟件對PtrUGT198蛋白的二級結構預測,該蛋白由α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲組成,其中α-螺旋占41.75%、β-折疊占14.61%、β-轉角占7.10%,無規卷曲占36.53%(圖1);用SWISS MODEL軟件在線預測PtrUGT198蛋白的三級結構(圖2)。

Helix:α-螺旋; Sheet:β-折疊;Turn:β-轉角;Coil:無規卷曲。Helix: α-spiral; Sheet: β-fold; Turn: β-angle; Coil: Random coil.

圖2 PtrUGT198蛋白的三級結構Fig.2 The third structure of PtrUGT198 protein

2.1.2 跨膜區、信號肽和磷酸化位點分析 利用TMHMM分析PtrUGT198蛋白的跨膜區,結果顯示該蛋白膜內外跨膜螺旋數為0,不存在跨膜區,從而預測其不屬于膜蛋白;使用在線軟件SignalP 4.1對PtrUGT198蛋白進行信號肽分析,結果表明該蛋白不存在信號肽,為非分泌性蛋白;通過NetPhos 3.1在線軟件預測可知(圖3),PtrUGT198蛋白共有47個磷酸化位點,其中31個是絲氨酸磷酸化位點,11個是蘇氨酸磷酸化位點,還有5個酪氨酸磷酸化位點,說明該蛋白的磷酸化修飾以絲氨酸為主。

圖3 PtrUGT198蛋白的磷酸化位點預測Fig.3 Prediction of phosphorylated sites of PtrUGT198 protein

2.1.3 PtrUGT198蛋白的同源序列比對 通過BlastX和Phytozome 數據庫并使用DNAMAN軟件對PtrUGT198基因的氨基酸與其他8種植物基因的氨基酸序列完成同源比對,結果(圖4)顯示該9種蛋白的C末端存在高度保守的植物次生產物糖基轉移酶(Plant secondary product glycosyltransferase, PSPG)基序, 主要由44個氨基酸(WAPQ--VL-H-AVG-FLTHCGWNSTLES---GVP---WPM--DQ)組成。

紅色方框指示PSPG基序。The red box indicates the PSPG motif.

2.1.4PtrUGT198基因的系統發育樹分析 通過PtrUGT198基因的氨基酸序列在NCBI和Phytozome中找到22個物種的同源序列,利用MEGA 7.0 軟件,采用NJ法構建系統進化樹。由圖5可知,PtrUGT198基因和同屬植物毛白楊、銀白楊和胡楊的基因距離最近,顯示較近的親緣關系,其次和模式植物煙草有較近親緣關系。

圖5 PtrUGT198與其他物種蛋白的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of protein in PtrUGT198 and other species

2.2 基因克隆及過量表達載體構建

為分析PtrUGT198基因功能,本研究從歐美楊107植株上提取總RNA(圖6-a),反轉錄成cDNA,以反轉錄的cDNA為模板,通過PCR 克隆,克隆出UGT198基因,大小約1400 bp(圖6-b);菌落PCR 擴增獲得1 條單獨的條帶,位置在 1400 bp 左右,與PtrUGT198基因的全長1400 bp 大小一致(圖6-c)。經測序比對后(圖7),兩者之間存在16個堿基突變,說明不同植物的基因序列存在差異,而這些變異位點的存在可能會影響基因的表達效率。PCR擴增并膠回收,得到PCR產物,進一步連接到過表達載體 pNC-Cam2304-35S上,得到產物轉化農桿菌EHA105感受態,待單菌落長出后,挑取單菌落進行PCR擴增,結果在1400 bp出現了 1 個條帶,大小與PtrUGT198基因 ORF 全長一致,說明過量表達載體構建成功。

a. RNA電泳圖;b. 目的基因擴增;c. 菌落PCR檢測;1～10:試驗樣品。a.RNA electrophoretogram; b. Amplification of the target gene; c. Colony PCR detection; 1-10: Tested samples.

PtrUGT198:毛果楊的序列;UGT198:107楊中克隆出的序列。PtrUGT198: Sequence downloaded from P. trichocarpa; UGT198: Cloned sequence from 107 poplar.

2.3 農桿菌轉化煙草

挑選生長狀態良好、葉色鮮綠的30 d煙草生根苗,取其葉片并去除主脈剪成大小一致的方塊,將剪好的葉片置于侵染液中侵染(圖8-a),將浸染過的葉片取出吸干多余的菌液,平鋪于無抗生素的煙草分化培養上,黑暗條件下共培養1～2 d;共培養結束后,將煙草葉片轉至篩選分化培養基上(圖8-b、8-c)繼續培養,當煙草葉片上長出嫩芽至1 cm左右時,將顏色鮮綠的抗性芽轉至篩選生根培養基上(圖8-d、8-e)繼續篩選,直至長出不定根。待煙草苗不定根長至1 cm左右時,挑選生長狀態良好的轉基因煙草幼苗,栽植在花盆中,于溫室里進行培養(圖8-f)。

a. 農桿菌侵染;b and c. 抗性芽篩選;d and e. 生根苗篩選;f. 移栽苗。a. Agrobacterium infection; b and c. Resistant bud screening; d and e. Screening of rooting seedlings; f. Transplanting seedlings.

2.4 轉基因煙草鑒定及qPCR驗證

對轉UGT198基因的煙草幼苗進行PCR擴增,從圖9-a可知,從轉UGT198基因的煙草幼苗中提取的DNA均檢測出UGT198基因,表明UGT198基因已經成功整合到煙草的基因組中,并獲得轉基因煙草植株。隨機選取3個株系剪取野生型煙草和轉UGT198基因煙草的葉片提取RNA后逆轉錄得到cDNA進行熒光定量檢測,由圖9-b可知,3個轉基因煙草中的UGT198基因的表達水平都高于野生型對照,且在檢測的轉基因株系中株系7的相對表達量最高,約為野生煙草的343倍,表明轉基因株系中UGT198基因已成功高調表達。

2.5 煙草飼蟲實驗

由飼蟲實驗結果(圖10)可知,在飼蟲過程中,各株系的葉片均有不同程度受損,在實驗進行4和8 h時葉片均無嚴重受損狀況,且轉基因株系葉片受損情況都比野生型輕。在24 h時,U1和CK受損較重,但是U2和U7受損較輕,說明U2和U7提高了抗蟲性,其之間的抗蟲性差異可能與在煙草中的表達水平不同有關,U2和U7中UGT198基因表達水平最高,而U1相對來說比較低,這可能是抗蟲性出現差異的原因,推測在UGT198基因表達水平較高時可以提高植株抗蟲性。

CK為未轉基因煙草,U1、U2和U7為圖9-a中1、2和7泳道對應株系。CK is unmodified tobacco, and U1, U2 and U7 are corresponding lines of lanes 1, 2 and 7 in figure 9-a.

3 討 論

本研究在前期分析公共轉錄組數據基礎上,篩選得到高表達的PtrUGT198并進行生物信息學分析,研究發現其序列中有1個1440 bp 的開放閱讀框,編碼 479 個氨基酸,并對PtrUGT198基因的理化性質、二級結構、三級結構、磷酸化位點分析、同源序列及系統發育樹等進行深入分析,成功克隆了UGT198基因。

植物糖基轉移酶(UGT)是植物中一類重要的催化酶[22-23],對UGT家族的研究主要集中在生物和非生物脅迫下的表現及參與植物的生命活動過程,擬南芥糖基轉移酶UGT74E2的過表達轉基因擬南芥的抗旱性得到明顯增強[24];林繼山等[25]論述了UGT72Bz基因負責木質素單體糖基化修飾作用與木質化過程密切相關;AtUGT76C2提高過表達植株干旱和鹽脅迫耐受性[13];周坤等[26]發現MdUGT88F1過表達調控植株發育和抗病能力。植物來源的抗蟲基因有蛋白酶抑制劑基因、植物凝集素基因、淀粉酶抑制劑基因、幾丁質酶基因等[27],關于糖基轉移酶參與抗蟲性也有報道。陶韻文等[28]在皂苷生物中發現有8種UGT基因參與了三萜皂苷生物合成,而植物皂苷的主要功能是參與植物防御反應,與植物的抗病蟲能力關系密切,GmUGT基因可改變大豆中類黃酮的生物合成途徑,從而提高大豆對咀嚼葉食昆蟲的抗性[29]。糖基轉移酶是否參與煙草和楊樹抗蟲性的相關報道還很少見,本研究成功構建了pNC-UGT198過量表達載體并轉化煙草獲得了煙草過表達株系,通過棉鈴蟲取食煙草葉片發現UGT198基因相對表達量較高時,棉鈴蟲不喜進食,推測UGT198基因過表達對煙草的抗蟲性有一定提高,且提高效果與表達水平有關,為后續培育轉基因抗蟲楊樹提供參考價值。

4 結 論

PtrUGT198基因的ORF區為1440 bp,編碼479個氨基酸,是酸性且不穩定疏水蛋白,跨膜區為0,不屬于膜蛋白,該蛋白磷酸化修飾以絲氨酸為主,成功構建了pNC-UGT198基因過量表達載體,并轉化煙草獲得過量表達轉基因株系,進行飼蟲試驗得出過量表達轉基因株系UGT198表達水平較高時可以提高植株抗蟲性。