青海茄參光合相關抗寒基因的初步篩選

王 成,趙艷艷

(1. 青海大學農牧學院,西寧 810016; 2. 青海大學省部共建三江源生態(tài)與高原農牧業(yè)國家重點實驗室,西寧 810016)

【研究意義】青海茄參(MandragorachinghaiensisKuang et A. M. Lu)是茄科多年生草本植物,生于海拔4000 m左右的河灘草地、巖石縫或林下等。青海茄參在自然環(huán)境下的生存條件極其惡劣,它在8 ℃下能完成正常的生命周期,在2 ℃下器官組織生長較小,但不會死亡。研究表明,茄科植物體內蘊藏著豐富的抗寒基因,如陳世偉[1]、張?zhí)锾颷2]和王恩旭[3]團隊研究的番茄抗寒基因SlCR1、SlHY5、GGR、XTH3、P-p和NAC2,以及朱文超[4]團隊研究的辣椒抗寒基因CaAQP等。青海茄參作為一個在高海拔、低溫度環(huán)境下生長的茄科植物,推測其體內蘊含豐富的抗寒基因。【前人研究進展】目前國內外對青海茄參的研究甚少,本研究前期相繼對其進行了低溫脅迫下的葉片轉錄組測序分析,青海茄參MYB、AP2、WRKY家族成員的理化特性分析、信號肽分析、亞細胞定位、蛋白保守結構域的分布、跨膜結構域分析、二級結構分析及低溫脅迫下部分轉錄因子表達情況分析[5-6],種子萌發(fā)特性分析[7]以及不同組織營養(yǎng)品質分析[8],現(xiàn)階段開始進行抗寒基因的篩選與功能驗證。隨著測序技術的發(fā)展,越來越多物種的基因組被測定,基因組學技術愈發(fā)成熟[9]。青海茄參作為尚未公布基因組序列的物種,利用轉錄組測序可以快速高效地呈現(xiàn)出準確度高的信息[10]。利用轉錄組測序技術(RNA-seq)開發(fā)EST-SSR標記,逐漸成為一種低成本、高效率的技術,該技術已經在植物品種鑒定方面廣泛應用[11]。目前,轉錄組學在植物系統(tǒng)分類、物種鑒定以及遺傳多樣性分析等方面均取得了一定的進展,在植物系統(tǒng)學的研究中發(fā)揮著極其重要的作用[12]。溫度對植物光合作用的影響程度較大,溫度過高、過低以及持續(xù)長短都會影響植物光合作用的正常進行,低于臨界溫度的低溫脅迫會直接傷害植物的光合機構,降低光能的同化率,增加熱輻射消耗的比例,對植物內部器官造成嚴重傷害。研究表明,隨著低溫脅迫時間的延長,大多數(shù)光合參數(shù)會持續(xù)下降,當溫度恢復正常時,下降參數(shù)則會有不同程度的回升[13-14]。葉綠素熒光信號由植物體內發(fā)出,并且具有豐富的光合作用信息,可以利用葉綠素熒光參數(shù)研究植物在低溫脅迫下的光合作用[15]。低溫脅迫影響葉片光能的吸收、轉換與光合電子傳遞,使過剩能量積累于光系統(tǒng)Ⅱ反應中心,損傷植物葉片光合器官。研究表明,隨著低溫脅迫的延長,植物葉片的PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)顯著下降,電子傳遞速率(ETR)減慢,非光化學淬滅系數(shù)(NPQ)先上升后下降[16-19]。【本研究切入點】我國糧食主產區(qū)主要分布在東半部地區(qū),限制西部地區(qū)糧食作物如茄科茄屬馬鈴薯的主要原因是西部高海拔、低溫度的地理環(huán)境。我國基因庫亟需優(yōu)質的抗寒基因以發(fā)展西部農業(yè)。本研究前期雖然首次測定了青海茄參的轉錄組和代謝組,但未深入挖掘具體的基因功能和作用機理,光合作用與溫度密切相關,植物受到低溫脅迫時光合作用變化明顯,易尋找關鍵時間節(jié)點。【擬解決的關鍵問題】本研究通過光合生理試驗確定了分析轉錄組的關鍵時間節(jié)點,在低溫脅迫下的青海茄參葉片轉錄組數(shù)據(jù)中的數(shù)千個差異基因中篩選出候選基因,為下一步的轉基因功能分析提供理論依據(jù),以期為我國逆境農業(yè)栽培提供新鮮血液,為基因庫提供更優(yōu)質的抗寒基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

光合生理試驗材料:2022年8月青海省果洛藏族自治州達日縣(99°11′15″ E,33°15′15″ N)選取野外生長健康強壯且無病蟲害的野生青海茄參種子進行組織培養(yǎng)。

轉錄組分析葉片樣本:2022年采集的野生青海茄參葉片放于人工氣候箱0 ℃(12 h/12 h光周期,光照強度12 000 Lx)低溫處理12 h,為避免晝夜節(jié)律變化的影響,于上午8:00開始低溫處理,在0 h(常溫樣品)、12 h 2個時間點分別采樣,每個時間點設3個生物學重復,采集生長點下完全展開葉,液氮速凍后儲存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 光合生理試驗

1.2.1 光合生理材料的培養(yǎng)與脅迫處理 種子的消毒工作和培養(yǎng)基選擇借鑒段紅俊等[7]的方法,用100 mg/L的GA3激素浸泡16 h,接種前用75%的乙醇消毒30 s后用無菌水清洗2次,轉入20%NaClO消毒劑中消毒30 s,后用無菌水清洗2次,最后將種子均勻放置在滅菌濾紙上,等其表面水分完全被吸干后接種于涂好1/2 MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,每瓶8粒種子。將培養(yǎng)瓶放在人工氣候箱中,培養(yǎng)條件為:光照強度12 000 Lx,光周期16 h/8 h,晝夜溫度均為25 ℃,相對濕度70%。

試驗0 ℃低溫處理依據(jù):根據(jù)其正常生長條件得知,青海茄參在8 ℃時可以正常發(fā)育并開花,2 ℃下葉片雖然不會死亡,但各組織生長較小,已有低溫脅迫跡象。本次試驗結合試驗室條件決定以0 ℃作為低溫脅迫處理溫度。

培養(yǎng)3個月后,選取長勢健康一致、無病變,且葉片≥4的組培植株5株進行0 ℃低溫處理(光照強度12 000 Lx,光周期16 h/8 h,晝夜溫度均為0 ℃,相對濕度70%),并選取5株進行常溫對照(光照強度12 000 Lx,光周期16 h/8 h,晝夜溫度均為25 ℃,相對濕度70%)。

1.2.2 葉片光合與葉綠素熒光參數(shù)測定 測定低溫處理0、2、4、8、12和24 h 6個時間點以及常溫對照的組培青海茄參植株的光合與葉綠素熒光參數(shù)。用Yaxin-1102便攜式光合蒸騰儀測定氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)。每個處理選5株,每株選取4片葉子,每片葉子測3個重復,即每個時間點60個重復。用JUNIOR-PAM熒光儀測定熒光參數(shù): 初始熒光強度(Fo)、最大熒光強度(Fm)、PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)、光化學猝滅系數(shù)(qP)、非光化學猝滅系數(shù)(qN)、電子傳遞速率(ETR)。每個處理選5株,每株選取4片葉子,每片葉子測3個重復,即每個時間點60個重復。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)處理分析,以LSD法進行差異顯著性分析,顯著性水平設定為P<0.05,采用Excel軟件作圖。

1.3 轉錄組測序及候選基因篩選

1.3.1 葉片總RNA提取 將0 h (常溫樣品)和12 h的葉片樣本進行轉錄組分析,每個時間點選取5片葉混合研磨后置于凍融管保存,委托北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉錄組測序。

1.3.2 候選基因篩選 使用Trinity(v2.4.0)軟件和Corset軟件對轉錄本進行拼接和聚類處理,以獲取用于后續(xù)分析的Unigenes。通過NCBI Blast(2.2.28+)將Unigenes比對到NR數(shù)據(jù)庫得到該Unigenes的功能注釋,并對獲得Unigenes進行基因的GO注釋和KEGG注釋。隨后通過KEGG注釋得到的通路篩選出光合相關代謝通路,進一步篩選出通路中的差異表達基因,以此初步篩選出可能參與青海茄參低溫脅迫表達的候選光合相關抗寒基因。

1.4 實時熒光定量試驗

通過轉錄組數(shù)據(jù)分析,在光合作用和光合作用-天線蛋白2個通路中篩選出響應耐寒機制的7個差異表達基因,根據(jù)這7個候選基因的轉錄組核苷酸序列,利用Primer 5軟件設計實時熒光定量引物,進而利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析基因在青海茄參低溫脅迫過程中的表達情況,引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1)。

2 結果與分析

2.1 低溫對青海茄參光合參數(shù)的影響

從圖1可知,0 ℃低溫脅迫對青海茄參葉片的凈光合速率(Pn)影響較大,整體呈下降趨勢,尤其是8～24 h下降幅度激增,推測12 h左右青海茄參光合相關通路發(fā)生了重要反應;0 ℃低溫脅迫對于青海茄參氣孔導度(Gs)的影響在處理前期不明顯,雖然整體呈下降趨勢,但在8～12 h時下降幅度最大,說明青海茄參葉片對于低溫的敏感時期在8～12 h左右;0 ℃低溫脅迫對于青海茄參葉片胞間CO2濃度(Ci)的影響較為明顯,整體呈上升趨勢且在8～12 h時上升幅度最大,推測青海茄參葉片在低溫處理8～12 h左右時光合效率顯著降低,導致胞間CO2積累量較多;0 ℃低溫脅迫對青海茄參葉片蒸騰速率(Tr)的影響整體呈下降趨勢,在8～12 h時下降幅度最大,且在12 h后變化程度趨于平穩(wěn),推測青海茄參葉片在低溫處理8～12 h左右時光合相關通路發(fā)生重要反應導致光合效率明顯降低,蒸騰速率急劇下降。

不同小寫字母代表在P<0.05水平上差異顯著。下同。Different lowercase letters represent significant differences at the P<0.05 level. The same as below.

2.2 低溫對青海茄參葉綠素熒光參數(shù)的影響

從圖2可知,隨著0 ℃低溫脅迫處理時間的增加,青海茄參葉片的初始熒光值(Fo)呈逐漸上升趨勢,且在8～12 h上升幅度最大,在0 ℃低溫脅迫處理4～24 h的過程中,青海茄參葉片的Fo值顯著高于對照組,說明低溫脅迫下的青海茄參葉片光系統(tǒng)Ⅱ反應中心受到了嚴重破壞;隨著0 ℃低溫脅迫處理時間的增加,青海茄參葉片最大熒光值(Fm)呈下降趨勢,且在8～12 h下降幅度最大。在0 ℃低溫脅迫處理2～24 h的過程中,青海茄參葉片的Fm值顯著低于對照組;隨著0 ℃低溫脅迫處理時間的增加,青海茄參葉片光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學效率(Fv/Fm)呈下降趨勢,且在4～8 h下降幅度最大,在0 ℃低溫脅迫處理4～24 h的過程中,青海茄參葉片的Fv/Fm值顯著低于對照組;隨著0 ℃低溫脅迫處理時間的增加,青海茄參葉片的qP值有明顯的下降趨勢,且在8～12 h下降幅度最大,在0 ℃低溫脅迫處理4～24 h的過程中,青海茄參葉片的qP值顯著低于對照組,由此說明,低溫脅迫下,青海茄參葉片的電子傳遞受到了較大程度的抑制;隨著0 ℃低溫脅迫處理時間的增加,青海茄參葉片的qN值上升趨勢明顯,且在8～12 h上升幅度最大,在0 ℃低溫脅迫處理4～24 h的過程中,青海茄參葉片的qN值顯著高于對照組。由此說明,0 ℃低溫脅迫下青海茄參葉片天線色素吸收的光能大部分沒有被利用,而是以熱能形式消耗掉;隨著0 ℃低溫脅迫處理時間的增加,青海茄參葉片的ETR值有明顯的下降趨勢,且在8～12 h下降幅度最大,在0 ℃低溫脅迫處理4～24 h的過程中,青海茄參葉片的ETR值顯著低于對照組,說明青海茄參葉片的電子傳遞效率受到了嚴重抑制。

圖2 低溫對青海茄參葉綠素熒光參數(shù)的影響Fig.2 Effect of low temperature on chlorophyll fluorescence parameters of Qinghai eggplant ginseng

2.3 轉錄組數(shù)據(jù)分析篩選光合相關抗寒基因

2.3.1 青海茄參葉片差異表達基因篩選 對轉錄本進行組裝和聚類,得到了55 663個Unigenes。以FPKM>0.3為基因表達標準,在0 ℃低溫脅迫0和12 h的青海茄參葉片樣品轉錄組數(shù)據(jù)中分別篩選出31 084和29 697個基因,其中2個處理共有基因23 630個,只在0 h樣本中表達的基因有7454個,只在12 h樣本中表達的基因有6067個。

為探究青海茄參的抗寒分子機制,以padj<0.05且|log2(fold change)|>1作為顯著差異表達閾值,對0 ℃青海茄參葉片低溫脅迫12 h前后的差異基因譜圖進行全面的分析鑒定。之后從55 663個Unigenes中鑒定出1919個上調表達差異基因和995個下調表達差異基因。將差異表達基因進行KEGG富集分析,篩選出差異代謝通路240條,選擇與光合作用相關的光合作用-天線蛋白通路和光合作用通路進行基因篩選,對通路中的差異表達基因進行差異表達程度、高同源性基因研究等方面綜合篩選出候選基因。

2.3.2 光合作用-天線蛋白通路候選基因篩選 在光合作用-天線蛋白通路(圖3)中篩選出CAB-8(Cluster-10474.16694)、CAB-11(Cluster-10474.17761)和CP24-10B(Cluster-10474.17028)3個差異基因。

圖3 光合作用-天線蛋白通路Fig.3 The photosynthesis antenna protein pathway

2.3.3 光合作用通路候選基因篩選 在光合作用通路(圖4)中篩選出CH-02(Cluster-10474.17880)、FD-C2(Cluster-10474.17210)、CP-43(Cluster-10474.20814)和PSI-D2(Cluster-10474.17465)4個差異基因。

圖4 光合作用通路Fig.4 The photosynthetic pathway

2.4 候選基因熒光定量分析

2.4.1 實時熒光定量引物篩選 用Primer 5軟件設計的實時熒光定量引物(表1)進行PCR特異性篩選(圖5),結果表明熒光引物特異性較好,無引物二聚體,可用于后續(xù)的實時熒光定量PCR實驗。

M: 2000 bp DNA marker; 1:葉綠素a-b結合蛋白CAB-8引物;2:葉綠素a-b結合蛋白CAB-11引物;3:葉綠素a-b結合蛋白CP24-10B引物;4:葉綠體ATP合酶γ鏈Ch-02引物;5:光系統(tǒng)I反應中心亞基II PSI-D2引物;6:鐵氧還蛋白Fd-C2引物;7:光系統(tǒng)II反應中心蛋白CP43引物。M: 2000 bp DNA marker; 1: Chlorophyll a-b binding protein CAB-8 primer; 2: Chlorophyll a-b binding protein CAB-11 primer; 3: Chlorophyll a-b binding protein CP24-10B primer; 4: Chloroplast ATP synthase γ chain Ch-02 primer; 5: Photosystem I reaction center subunit II PSI-D2 primer; 6: Ferredoxin Fd-C2 primer; 7: Photosystem II reaction center protein CP43 primer.

2.4.2 基因表達調控分析 將選出的7個差異表達基因利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析基因在青海茄參低溫脅迫過程中的表達情況,以18S rRNA作為內參基因設置實時熒光定量程序。結果分為兩類(圖6),第一類是CP43的表達先上升后下降,整體呈上升趨勢,在12 h時表達量達到最高,且在8～12 h上升幅度最大;第二類是CAB-8、CAB-11、CP24-10B、CH-02、PSI-D2和Fd-C2的表達先下降后上升,整體呈下降趨勢,在12 h表達量達到最低,其中CAB-8和CAB-11在2～4 h下降幅度最大,而CP24-10B、CH-02、PSI-D2和FdC2在0～2 h下降幅度最大。初步推測0 ℃低溫脅迫2和12 h為青海茄參光合相關抗寒基因關鍵表達時間節(jié)點。

圖6 青海茄參低溫脅迫下相關基因表達量分析Fig.6 Analysis of the expression levels of related genes in Qinghai eggplant ginseng under low temperature stress

3 討 論

本研究中,0 ℃低溫對于青海茄參葉片的凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度以及蒸騰速率影響都很大,且明顯變化時間都在8～12 h左右,通常認為植物在受到逆境脅迫時,凈光合速率下降是由2種因素引起:氣孔因素或非氣孔因素[20-21]。氣孔因素指氣孔關閉導致胞間CO2濃度降低從而降低光合能力,凈光合速率下降。非氣孔因素指氣孔導度下降的同時胞間CO2濃度上升,這一類導致凈光合速率下降的原因是植物體內發(fā)生了反應。本試驗結果表明,在低溫脅迫下青海茄參葉片的凈光合速率下降是由非氣孔因素引起的,說明光合相關通路在關鍵時間點發(fā)生了重要反應。

0 ℃低溫對于青海茄參葉片的初始熒光、最大熒光、光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學效率、光化學猝滅系數(shù)、非光化學猝滅系數(shù)以及電子傳遞速率影響程度較大且響應速度快于光合參數(shù),明顯變化時間都在8～12 h左右,Fo值上升表明光系統(tǒng)Ⅱ反應中心發(fā)生可逆失活或被破壞[22],Fv/Fm值降低表明植株葉片發(fā)生了光抑制[23],qP值下降體現(xiàn)出原初電子受體的電子傳遞受到抑制[24],qP值下降表明0 ℃低溫脅迫下青海茄參葉片天線色素吸收的光能大部分都沒有被利用,而是以熱能形式消耗掉[25],ETR為光合電子傳遞速率,是光合作用中光能轉化最大效率的一種度量,可以反映光合機構機能的變化[26-27]。結合光合參數(shù)最終分析決定以12 h為關鍵節(jié)點進行后續(xù)實驗。

通過光合作用直接通路和光合關聯(lián)代謝通路的分析得到的差異基因,經過實時熒光定量結果與光合及葉綠素熒光參數(shù)變化的分析對比,推測7個基因(CAB-8、CAB-11、CP24-10B、CH-02、FD-C2、CP-43和PSI-D2)都有可能是光合相關抗寒基因,分析其家族功能具體如下。

光捕獲葉綠素a/b結合蛋白(Chlorophyll a/b binding protein,Cab)是一類能捕獲光能,并將轉化為電能的光能傳遞到光反應中心引起光化學反應的色素蛋白,這些蛋白復合體由色素結合蛋白與色素結合而成,然后通過色素結合蛋白的跨膜區(qū)將其錨定在類囊體膜上,且高等植物進行光合作用時光能的捕獲與傳遞主要是通過Cab來完成[28-29]。在高等植物中,Lhc家族基因可以調控光合作用,光合作用是響應植物低溫脅迫以及維持植物生存的重要環(huán)節(jié),而CAB-8及CAB-11在代謝通路中分別屬于Lhca3和Lhca4兩個Lhc基因家族的亞家族,參與調控光合作用[30]。葉綠素結合蛋白CP24在調節(jié)光合作用中起著重要作用,缺少CP24的植株光合速率和生長速率會明顯下降。研究表明,一定數(shù)量的葉綠素等色素分子與CP24結合,可以保持其穩(wěn)定性和活性。弱光下葉綠素與CP24結合量增加,以吸收光子,保護光合器官;強光下胡蘿卜素與CP24結合量增加,發(fā)揮光保護作用;黑暗下葉綠素和CP24積累迅速減少,即也有一定脅迫保護作用[31-37]。

通過代謝通路分析可知,CH-02基因位于ATP合酶y鏈上,此處ATP合酶分布于葉綠體類囊體上,參與光合磷酸化等重要過程,且有研究發(fā)現(xiàn)ATP合酶在低溫脅迫下有著重要調控作用[38]。鐵氧還蛋白(Fd)是一類參與光合電子傳遞的低分子量的酸性電子傳遞蛋白。光合型Fd參與多種依賴光的代謝調節(jié)過程,因為其可以將光激發(fā)電子從光系統(tǒng)I傳遞給各種相關酶。有研究表明,Fd表達水平的改變能夠改變植物對低溫脅迫的抗性[39]。光合系統(tǒng)主要分為光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II,光系統(tǒng)II是一個獨立的復合體,可分為天線和核心兩部分。天線系統(tǒng)由Lhca和Lhcb兩種捕光色素蛋白復合物組成,Lhcb與50個葉綠素a分子結合并與反應中心緊密結合成內周天線系統(tǒng)CP43[40]。通過代謝通路分析可知,PSI-D2位于PsaD上,光系統(tǒng)I有3個膜外在的亞基:PsaC、PsaD和PsaE,三者均位于光合系統(tǒng)I基質外側,以提供鐵氧還蛋白的停靠點。亞基PsaD位于靠近連接區(qū)的基質峰附近,從PSI到鐵氧還蛋白的電子轉移至關重要[41],PsaD通過1個短環(huán)連接到1個α螺旋上與PsaA和PsaC形成相互作用,兩者分別是光系統(tǒng)I最重要的亞基和最重要的外部亞基,PsaA含有大部分天線蛋系統(tǒng)的葉綠素和類胡蘿卜素以及大部分輔助因子,而PsaC與PSI核心對接以及通過形成PsaC嵌入基質隆起與PsaE和PsaD相作用[42-43]。因此亞基PsaD是光系統(tǒng)I不可或缺的部分。研究證明,光系統(tǒng)I被證明可以通過循環(huán)電子傳遞進行吸收光的光化學和非光化學猝滅,從而起到保護光合器官的作用,還有研究發(fā)現(xiàn)替代電子傳遞途徑可能在此過程中發(fā)揮一定作用[44-45]。

4 結 論

通過低溫脅迫光合生理試驗確定了青海茄參光合相關抗寒基因響應的關鍵時間節(jié)點為12 h,對在關鍵時間節(jié)點的轉錄組數(shù)據(jù)分析后篩選出的7個基因進行了實時熒光定量試驗,分析出不同時間節(jié)點的基因表達量。本研究確定了候選基因,為后續(xù)的基因功能驗證提供了一定理論基礎。