轉(zhuǎn)錄因子MhGL3對薄荷表皮毛發(fā)育的影響

陳志峰,羅 慶,譚國飛

(1.遵義師范學院生物與農(nóng)業(yè)科技學院,貴州 遵義 563006;2.貴州省園藝研究所,貴陽 550006)

【研究意義】薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)為唇形科主要香料蔬菜作物之一,可作為香料蔬菜食用,也可用于提取薄荷精油[1]。生產(chǎn)上,薄荷主要以根、莖作為繁殖材料,能夠保持薄荷性狀一致[2-3]。然而,薄荷種植過程中經(jīng)常出現(xiàn)品種退化,呈現(xiàn)植株纖細、顏色不均一、抗病性差及植株表皮毛增多等非種植品種特有性狀[4]。因此,開展栽培薄荷栽培過程中表皮毛形成研究,對了解人工薄荷品種退化及其產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。【前人研究進展】植物表皮毛發(fā)育受天氣(如高低溫和干旱等)、激素、分子調(diào)控和營養(yǎng)水平等影響[5]。薄荷表皮毛增加使得其商品性降低,如影響食用。目前,關(guān)于薄荷表皮毛研究主要集中于其形態(tài)結(jié)構(gòu)和發(fā)育過程[6-8]等方面,研究表明薄荷表皮毛由原表皮細胞發(fā)育而來,主要由基細胞(略呈方形)、柄細胞(呈圓盤狀)和頂細胞(也叫分泌細胞,呈近方形)3個部分組成,其中柄細胞決定薄荷表皮毛的類型和功能。轉(zhuǎn)錄組測序和基因組測序等組學方法,通過生物信息大數(shù)據(jù)分析獲得目標候選基因,是目前獲取目標候選基因的快速方法[9-13]。擬南芥中通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得響應(yīng)鹽、滲透和低溫等脅迫候選基因[10],大籽雪膽通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定了合成葫蘆素IIa候選基因[11];中華水芹通過轉(zhuǎn)錄組等組學方式揭示了木質(zhì)素和纖維素合成基因[12];借助轉(zhuǎn)錄組測序揭示了蕓苔素對胡蘿卜葉柄延長的影響[13]。朱丹等[9]采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究薄荷幼苗響應(yīng)干旱高溫脅迫基因發(fā)現(xiàn),干旱脅迫和干旱-高溫脅迫薄荷幼苗分別產(chǎn)生4577和21 163個差異表達基因(DEGs),2種脅迫產(chǎn)生2141個共同DEGs,包括1219個共同上調(diào)DEGs和798個共同下調(diào)DEGs。【本研究切入點】植物表皮毛發(fā)育的分子機理調(diào)控是個非常復(fù)雜而精細的機制,且受環(huán)境因素的影響較大,如何快速獲得調(diào)控薄荷表皮毛發(fā)育的關(guān)鍵基因,對控制和培育無毛薄荷品種具有積極作用。目前,有關(guān)轉(zhuǎn)錄組測序與基因組測序等基因組學方法應(yīng)用于薄荷表皮毛發(fā)育方面的研究鮮見報道,調(diào)控薄荷表皮毛發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子也未見研究報告。【擬解決的關(guān)鍵問題】2019年,筆者在本地原始表皮毛較少(下稱少毛)薄荷種質(zhì)資源種群中發(fā)現(xiàn)1株莖及葉有較多的表皮毛(下稱多毛)薄荷,2019—2022年以少毛薄荷和多毛薄荷為研究材料,采集二者莖段在大棚內(nèi)營養(yǎng)充足環(huán)境下種植,采用轉(zhuǎn)錄組測序、組裝和注釋方法篩選影響薄荷表皮毛發(fā)育的候選基因,并對其進行克隆、生物信息及表達分析研究,以期為深入研究薄荷表皮毛發(fā)育、地方種質(zhì)資源的保護與開發(fā)利用和新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 薄荷 本地少毛薄荷品種及在2019年從該薄荷品種中獲得的1株莖及葉中含有大量表皮毛的薄荷,由貴州省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所提供。

1.1.2 試劑 天根RNA試劑盒購自北京天根生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(含有去除基因組DNA成分)、PCR聚合酶ExTaq和pMD19-T載體試劑盒購自寶生物工程 (大連)有限公司 (大連Takara公司);Axygen膠回收試劑盒購自Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd(上海)。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預(yù)處理 2019年,采集少毛和多毛薄荷莖段,在大棚中進行種植,鑒定材料的穩(wěn)定性。2022年6月,分別取少毛和多毛薄荷的嫩莖葉,用錫紙包好后,及時放入液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。一部分用于轉(zhuǎn)錄組測序,一部分用于提取RNA。

1.2.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 采用天根RNA試劑盒,按照說明書提取RNA后,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA用ddH2O稀釋15倍后,保存于-20 ℃冰箱中,用于候選基因克隆和基因表達分析。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序分析 將備用薄荷樣品委托百邁客生物科技有限公司(北京)進行轉(zhuǎn)錄組測序。測序技術(shù)采用邊合成邊測序(Sequencing by synthesis,SBS)的方法,采用Illumina NovaSeq高通量測序平臺對cDNA文庫進行測序,確保數(shù)據(jù)有足夠高的質(zhì)量。使用Trinity軟件(V2.5.1,主要參數(shù):min contig length 200 group pairs distance 500 min kmer cov 1)將測序Reads打斷為較短的片段(K-mer),并將小片段延伸成較長的片段(Contig),利用這些片段之間的重疊得到片段集合(Component),最后利用De Bruijn圖的方法和測序Read信息,在各片段集合中分別識別轉(zhuǎn)錄本序列Unigene[14]。使用DIAMOND軟件將Unigene序列與Nr、Swiss-Prot、COG、KOG、eggNOG和KEGG數(shù)據(jù)庫比對[15],使用KOBAS得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology結(jié)果[16],InterProScan利用InterPro整合的數(shù)據(jù)庫分析新基因的GO Orthology結(jié)果,預(yù)測完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER軟件與Pfam數(shù)據(jù)庫比對,獲得Unigene注釋信息[17]。

1.2.4 候選基因篩選 少毛的薄荷材料仍含有少量表皮毛,表明少毛和多毛薄荷材料均具有形成完整表皮毛能力,可能是調(diào)控薄荷表皮毛發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子突變所致。為此,通過Nr、Swiss-Prot、COG、KOG、eggNOG和KEGG等數(shù)據(jù)庫對Unigene基因注釋的結(jié)果,篩選與表皮毛發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[18]。將2種薄荷材料表皮毛發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子進行比對、ORF框(Open reading frame,可閱讀框)查詢和生物學信息分析,篩選出可能的候選基因。

1.2.5 候選基因克隆 對獲得的候選基因MhGL3(Transcription factor GLABRA 3)設(shè)計1對克隆引物MhGL3-KLF和MhGL3-KLR(表1)。采用PCR聚合酶ExTaq對候選轉(zhuǎn)錄因子MhGL3進行克隆,PCR體系50 μL,其中,2×ExTaq混合酶25 μL,cDNA模板2 μL,MhGL3-KLF和MhGL3-KLR引物各3 μL(引物濃度均為10 μmol/μL),滅菌的ddH2O補足50 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s,72 ℃延伸120 s,34個循環(huán);72 ℃延伸5 min后,8 ℃保存。擴增產(chǎn)物使用濃度(V/V)為1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并將正確的目標條帶進行回收。采用Axygen膠回收試劑盒按照說明書回收目的基因片段。按照pMD19-T載體試劑盒及其試劑盒說明書將回收的目的片段連接到載體上。利用42 ℃熱激法將連接好的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中,37 ℃、120 r/min搖床中搖菌 1 h后,12 000 r/min離心收集菌落涂布于含有氨芐青霉素(濃度100 mg/L)的LB培養(yǎng)基中,37 ℃倒置黑暗培養(yǎng)12～14 h。挑取單菌落接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后,使用菌液PCR方法檢測單菌落是否含有目的片段,并將正確的3個單菌落委托南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

表1 候選轉(zhuǎn)錄因子MhGL3的克隆、基因表達與內(nèi)參引物

1.2.6 候選基因生物信息及表達分析 使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件,對克隆得到的MhGL3轉(zhuǎn)錄子對應(yīng)的氨基酸進行保守區(qū)域預(yù)測[19]。設(shè)計1對基因表達引物MhGL3-YGF和MhGL3-YGR(表1),分析多毛和少毛薄荷莖及葉的MhGL3表達分析,以薄荷Actin基因作為內(nèi)參(引物為MhActin-YGF和MhActin-YGR,表1)。MhGL3表達分析程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,65 ℃延伸10 s,40個循環(huán);72 ℃延伸2 min后,4 ℃保存。相對定量是基于處理和對照之間目標基因?qū)⒖蓟虮磉_量的比較[20],使用參照基因ΔCT法,表達差異為2-ΔCT。

ΔCT=CT目標基因-CT actin

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel 2007和SPSS 20對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 少毛與多毛薄荷莖和葉的特征

植物在高低溫、缺肥和干旱等條件下能夠促進表皮毛發(fā)育。少毛薄荷莖段繁殖的植株仍表現(xiàn)為少毛(圖1-A);多毛薄荷則表現(xiàn)為植株莖和葉表皮毛較多(圖1-B)。表明,獲得的表皮毛多的薄荷為穩(wěn)定的材料,可用于后續(xù)研究。

圖1 少毛薄荷(A)與多毛薄荷(B)的莖和葉Fig.1 Stem and leaves of M.haplocalyx with hairless hairs (A) and many hairs (B)

2.2 多毛與少毛薄荷RNA的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

多毛與少毛薄荷RNA的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示二者分別獲得12.40和12.12 Gb的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),Unigene基因39 853和30 249條,N50長度分別為1380和1434 bp,序列平均長度為789.44和779.03 bp(表2)。獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量可用于后續(xù)薄荷表皮毛候選基因篩選研究。

表2 多毛與少毛薄荷RNA的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

2.3 候選基因篩選

植物表皮毛發(fā)育及調(diào)控的研究主要在轉(zhuǎn)錄因子上,包括正向調(diào)控和負向調(diào)控[5]。本研究中少毛和多毛薄荷均含有表皮毛,表皮毛數(shù)量的差異可能由調(diào)控因子導(dǎo)致。正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子包括TTG1(TRANSPARENT TESTA GLABRA1)、bHLH-like transcription factors GL3 (GLABRA3,GL3)、EGL3(ENHANCER OF GLABRA3)、TT8(TRANSPARENT TESTA)和MYB等;負向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子包括CPC(CAPRICE)、TRY(TRIPTYCHON)、ETC1(ENHANCER OF TRY AND CPC1)和ETC2等[5]。

以多毛及少毛薄荷的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)分析可能影響植物刺毛發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子,結(jié)果顯示,多毛及少毛薄荷中轉(zhuǎn)錄因子負向調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子在序列長度及結(jié)構(gòu)上均無明顯差異,而正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MhGL3的cDNA序列長度ORF存在明顯差異,分別為1848和933 bp。

將多毛薄荷轉(zhuǎn)錄因子MhGL3的cDNA序列作為參考序列,以設(shè)計的MhGL3-KLF和MhGL3-KLR為克隆引物,分別以多毛及少毛薄荷的cDNA為模板,對多毛和少毛薄荷的轉(zhuǎn)錄因子MhGL3進行克隆,結(jié)果顯示,多毛薄荷的MhGL3克隆長度為1848 bp,少毛薄荷的MhGL3克隆長度為1849 bp;克隆序列比對顯示,多毛和少毛薄荷的轉(zhuǎn)錄因子MhGL3序列上存在12個位點差異。少毛薄荷MhGL3的ORF框長度僅為933 bp,在920 bp位置上多毛薄荷中缺失堿基A,其ORF框長度延伸到1848 bp(圖2)。

HhBH-Hair,多毛薄荷;HhBH,少毛薄荷;紅色箭頭及紅星分別為少毛薄荷缺失的堿基“A”和終止密碼子。下同。HhBH-Hair, hairy M. haplocalyx; HhBH, hairless M. haplocalyx; The red arrow and red stars represent the missing base ‘A’ and termination codon of hairless M. haplocalyx.The same as below.

2.4 薄荷MhGL3生物信息分析

對比多毛和少毛薄荷MhGL3對應(yīng)氨基酸序列與公布的唇形科植物西班牙鼠尾草(Salviahispanica)氨基酸序列(NCBI登錄號:XP_047970505.1)的結(jié)果顯示,多毛薄荷MhGL3對應(yīng)的氨基酸序列長度為615 aa,與西班牙鼠尾草GL3氨基酸長度基本一致,而少毛薄荷MhGL3對應(yīng)的氨基酸序列長度僅307 aa(圖3)。使用SMART進一步對3個物種GL3氨基酸序列進行功能區(qū)域domain預(yù)測的結(jié)果表明,多毛薄荷及西班牙鼠尾草GL3氨基酸序列均含有2個保守區(qū)域,分別為bHLH-MYC_N和HLH,而少毛薄荷僅含有bHLH-MYC_N。3個材料的bHLH-MYC_N氨基酸位置均在15～198 aa,多毛薄荷和西班牙鼠尾草HLH保守區(qū)域分別在420～469和432～481 aa上,且多毛薄荷和西班牙鼠尾草HLH保守區(qū)域氨基酸長度均為50 aa(圖4)。在擬南芥中,轉(zhuǎn)錄因子AtGL3具有HLH保守域[19],西班牙鼠尾草在其莖和葉柄上有一定數(shù)量的短表皮毛,暗示少毛薄荷轉(zhuǎn)錄因子MhGL3序列在920 bp位置中插入單核苷酸“A”,造成移碼突變(Frame shift mutation),使其轉(zhuǎn)錄因子MhGL3出現(xiàn)過早終止(Premature termination),其ORF長度為933 bp,進而缺失了此轉(zhuǎn)錄因子的重要保守功能區(qū)域即HLH;多毛薄荷相對少毛薄荷在920 bp位置中無插入的核苷酸“A”,使其ORF長度延長,獲得了該轉(zhuǎn)錄因子重要保守區(qū)域HLH,從而恢復(fù)了調(diào)控薄荷表皮毛發(fā)育的調(diào)控功能。

Salvia hispanica,西班牙鼠尾草 (XP_047970505.1)。下同。Salvia hispanica (XP_047970505.1). The same as below.

A.多毛薄荷;B.少毛薄荷;C.西班牙鼠尾草(XP_047970505.1)。A. Hairy M. haplocalyx; B. Hairless M. haplocalyx; C. S. hispanica (XP_047970505.1).

2.5 薄荷轉(zhuǎn)錄因子MhGL3的表達

在多毛和少毛薄荷莖及葉中轉(zhuǎn)錄因子MhGL3均有表達,莖中分別為7.42和6.21,葉中分別為4.84和4.62;多毛和少毛薄荷的轉(zhuǎn)錄因子MhGL3表達水平在莖和葉中均無顯著差異(P>0.05),但MhGL3基因的表達量莖均高于葉(圖5)。轉(zhuǎn)錄因子MhGL3在2種材料莖和葉中均有表達且存在差異,可能是少毛的原始材料中因缺少HLH結(jié)構(gòu)域?qū)е缕洳荒茱@著調(diào)控植株表皮毛形成所致。

圖5 多毛和少毛薄荷莖和葉中MhGL3的表達水平Fig.5 Expression levels of MhGL3 in stem and leaves of hairy and hairless M. haplocalyx

3 討 論

植物表皮毛對植物抵抗外界病蟲害、高溫和低溫等具有顯著作用[5,21-24]。一些植物表皮毛,如茶葉的“毫”[5,25]和西紅柿的表皮毛[5,26]等能夠分泌一些次級代謝產(chǎn)物;一些植物種子上的刺毛能夠借助外力(如風)或者掛在人及動物身上傳播[5],如蒲公英、鬼針草等;然而,一些植物表皮毛能夠污染環(huán)境和影響人類健康,如楊樹和懸鈴木葉片及種子中的“絮”[27]。對于蔬菜作物而言,表皮毛不僅影響蔬菜的適口性,而且一些蔬菜種子的表皮毛使其很難進行播種,如胡蘿卜[28-29]。對于薄荷,栽培上以少或者無表皮毛品種為主。貴州省野生環(huán)境中存在的野生薄荷資源種類多、資源豐富,大部分野生薄荷均含有一定的表皮毛。經(jīng)過長期栽培及馴化,植株表皮無或少毛的薄荷品種已成為薄荷栽培的趨勢。本研究中,從一個群體中獲得表皮毛多的薄荷材料,該材料與表皮毛少的材料種植在同一個大棚中,其在抗白粉病和霜霉病、蚜蟲等病蟲害能力較表皮毛少的材料強,是否表皮毛多的薄荷材料在精油合成及含量上有優(yōu)勢,需要進一步研究。

研究結(jié)果表明,通過轉(zhuǎn)錄組測序方法和基因克隆,少毛薄荷是由于轉(zhuǎn)錄因子MhGL3在其序列 920 bp處的堿基“A”缺失導(dǎo)致其序列的延長,獲得了轉(zhuǎn)錄因子GL3所需要的2個保守區(qū)域,從而使其具有調(diào)控表皮毛發(fā)育的功能,暗示HLH結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄因子MhGL3調(diào)控薄荷表皮毛所必須。同時,多毛和少毛薄荷材料的轉(zhuǎn)錄因子MhGL3序列之間存在多處不同,暗示在自然栽培環(huán)境中薄荷表皮毛通過無性繁殖易發(fā)生突變[2,30]。另外,也暗示轉(zhuǎn)錄因子MhGL3可能為薄荷表皮毛發(fā)育的主要調(diào)控因子,該轉(zhuǎn)錄因子的突變能明顯影響薄荷表皮毛的數(shù)量;培育無毛薄荷新品種,誘變MhGL3是關(guān)鍵。MhGL3能使薄荷表皮毛數(shù)量發(fā)生明顯變化,但原始材料中仍存在部分表皮毛,可能還有其他轉(zhuǎn)錄因子對薄荷植株表皮毛進行微調(diào)控,需要進行下一步研究。

4 結(jié) 論

利用轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)合基因克隆的方法探明轉(zhuǎn)錄因子MhGL3突變是導(dǎo)致薄荷表皮毛發(fā)育的重要因素。多毛薄荷轉(zhuǎn)錄因子MhGL3序列在920 bp位置上無堿基“A”,使其轉(zhuǎn)錄因子MhGL3序列長度延伸至1848 bp,獲得HLH保守功能區(qū)域,促進了多毛薄荷表皮毛發(fā)育。