基于SRAP分子標記構建云南旱冬瓜核心種質

鄒廣權,王曉麗,曹現富,李 艷,張新洛, 曹子林

(1.西南林業大學西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室,昆明 650224; 2.西南林業大學生態與環境學院,昆明 650224)

【研究意義】旱冬瓜(Alnusnepalensis)系樺木科榿木屬落葉喬木,是典型的喜馬拉雅植物區系樹種,在中國主要分布于西南地區。作為云南重要的鄉土樹種,旱冬瓜生長迅速,適應性強,干型優良,用途廣泛[1]。收集和獲取優良的種質資源是發展高質人工用材林的基礎,云南省目前已完成收集云南省16個州(市)的64個旱冬瓜種源,并建立旱冬瓜種質資源庫,為旱冬瓜林木資源的高效利用奠定了基礎。在云南省玉溪市玉白頂林場旱冬瓜林木種質資源庫中,優樹收集區收集了來自云南省內43 個不同地區的優樹,從優樹的命名來看,多個優樹來自于一個鄉(鎮)的情況較普遍,可能不同的優樹間存在遺傳關系較近的情況。核心種質庫是種質資源中的優異性狀集合群,開展構建旱冬瓜核心種質的研究工作,對了解旱冬瓜種質庫中優樹的遺傳情況、降低優樹間的遺傳重復、節約種質資源庫保存成本及后期利用具有重要作用。【前人研究進展】國內外關于核心種質的研究廣泛,構建核心種質最佳的策略與方法也各有異同,研究對象主要集中在生長周期較短的食用作物上,如番茄(Solanumlycopersicum)、山藥(Dioscoreapolystachya)、苦瓜(Momordicacharantia)等[2-4],對生長周期相對較長的木本植物主要集中在經濟林木,如荔枝(Litchichinensis)、板栗(Castaneamollissima)、核桃(Juglansregia)等[5-7],隨著林木培育的發展,在灰楸(Catalpafargesii)、杉木(Cunninghamialanceolata)、云南松(Pinusyunnanensis)等[8-10]用材林樹種也有相關核心種質的報道。目前鮮見旱冬瓜核心種質構建的相關研究報道。SRAP分子標記在生物遺傳多樣性和重要性狀標記等方面廣泛運用。在云南松、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、油茶(Camelliaoleifera)、何首烏(Fallopiamultiflora)等物種的遺傳多樣性和核心種質庫構建策略的研究中,SRAP 分子標記技術已然是重要的手段[10-13],目前旱冬瓜遺傳多樣性的 SRAP 標記分析鮮見報道。【本研究切入點】借鑒王曉麗等[10]和Wang等[14]在材用云南松核心種質構建策略探討中的研究方法,綜合考慮旱冬瓜優樹子代的生長狀況和現實保存情況。【擬解決的關鍵問題】以旱冬瓜優樹半同胞子代為試材,以SRAP 分子標記數據為源數據,從核心種質構建策略、核心種質評價和檢測、核心種質的確認等方面探討旱冬瓜核心種質的構建方法,為旱冬瓜優樹的進一步評價、保存和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗涉及的28株優樹的84株半同胞子代(10年生)全部源于云南省玉溪市玉白頂林場旱冬瓜種質資源庫(表1)。在每樣株生長健壯的枝條上采集當年生葉片10 g,放入盛有硅膠的自封袋中保存,用于提取DNA和后續SRAP分子標記使用。

表1 試驗所用旱冬瓜優樹信息

試驗用的TaqDNA聚合酶、10×TaqBuffer(含Mg2+)、dNTPs、2000 bp DNA Ladder Marker 由北京博邁德生物有限公司提供,SRAP-PCR反應引物序列(表2)由北京博邁德生物有限公司合成。

表2 SRAP -PCR擴增引物組合及其引物序列

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取及擴增 采用改良CTAB法提取旱冬瓜樣株葉片DNA[15]。旱冬瓜SRAP-PCR反應體系和擴增程序參考前人的研究成果并加以改良[11-14],反應體系共20.0 μL,具體為DNA模板2.0 μL(50 ng/μL),上、下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL,2×TaqPCR MasterMix 10.0 μL,ddH2O補齊至20 μL。擴展程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,35 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共5個循環;94 ℃ 變性1 min,44 ℃退火1 min,72 ℃ 延伸1 min,共35個循環;最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳中初檢后,再采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離銀染檢測,拍照供分析。

1.2.2 核心種質的構建 利用各樣株SRAP-PCR分子標記信息構建0-1矩陣數據,利用軟件POPGENE32計算遺傳相似矩陣,依據遺傳相似矩陣,聚類軟件為NTSYSpc2.10e,遺傳距離采用Nei’s遺傳距離,聚類方法采用不加權類平均法[10],取樣方法采用改進的最小距離逐步取樣法,設10%、15%、25%、35%、45%和55%共6個抽樣比例,構建基于SRAP分子標記數據的種質子集。

1.2.3 核心種質評價 利用軟件POPGENE32計算遺傳多樣性指數來評價種質子集[10,14],通過軟件SPSS 23.0 和Excel 2022進行種質子集遺傳多樣性指數的t/F檢驗和相關系數分析,最后依據軟件NTSYSpc2.10e的聚類結果來評價種質子集的代表性和實用性。

2 結果與分析

2.1 旱冬瓜原種質集SRAP-PCR擴增結果

采用28對SRAP引物對28個旱冬瓜優樹的84株半同胞子代種質進行PCR擴增,共擴增出201個多態位點,用于構建旱冬瓜核心種質。如圖 1所示,1～21號樣品擴增充分分離、條帶清晰明了,表明試驗提取的DNA、篩選出SRAP 引物、采用的擴增體系、電泳體系和銀染體系適合旱冬瓜種質研究。

2.2 旱冬瓜原種質集與不同抽樣比例種質子集比較

2.2.1 遺傳多樣性比較 由表3可見,多態位點數、多態位點百分率、觀測等位基因數和等位基因保留率在55%、45%、35%和25%抽樣比例下與原種質集一致,而在15%和10%抽樣比例下低于原種質集,說明當抽樣比例過低時,原種質集的某些性狀就會遺失,其余4個遺傳多樣性指數均大于原種質集,呈現出隨抽樣比例的降低而先增后減趨勢,在25%抽樣比例下,除有效等位基因數外,其余3個指標均達到最大值,說明基于優樹子代構建的種質子集不僅能降低原種質集的遺傳累贅,還能提高遺傳多樣性,且25%抽樣比例優于其他抽樣比例,其構建的種質子集在遺傳多樣性上更能代表原種質集。

1～21:引物組合Me2+ Em2對1～21號樣株的擴增結果;M:標記。1-21:Amplification results of primer combination Me2+Em2 of sample strains 1-21;M:Marker.

表3 旱冬瓜種質集遺傳多樣性指數

2.2.2 遺傳多樣性指標的均值t檢驗和方差F檢驗 由表4可見,在55%抽樣比例構建的種質子集各指標的檢驗中,僅Shannon’s多樣性信息指數F檢驗存在顯著差異,其余指標的t/F檢驗均沒有顯著差異;在45%、35%、25%抽樣比例構建的種質子集中,除等位基因數外,其余4個評價參數的方差均小于原種質集、均值皆大于原種質集,且在t/F檢驗中,這4個評價參數均與原種質集差異顯著;在15%和10%種質子集的t/F檢驗中,除等位基因數與原種質集差異顯著外,其余5個種質子集的等位基因數與原種質集無顯著差異,就等位基因數而言,認為其余4個種質子集更有代表性,15%抽樣比例種質子集的有效等位基因數在F檢驗存在顯著差異;此外,隨著抽樣比例的降低,除等位基因數外的4個遺傳評價參數的方差隨差異比例降低而逐漸減小,在25%種質子集達到最小值后又隨差異比例降低而逐漸增大,說明隨著抽樣比例的降低,各種質子集與原種質集的差異也先減后增,說明25%抽樣比例構建的種質子集相較其他比例構建的種質子集,與原種質集差異最小。

表4 旱冬瓜種質集遺傳多樣性指標t/F檢驗

2.2.3 相關系數比較 如圖2所示,種質子集與原種質集各遺傳指數的均值相關系數接近或等于1,表現為強相關性,就均值而言,6個種質子集能代表原種質集;各遺傳指數方差的相關系數只有10%抽樣比例的種質子集與原種質集呈中度相關,從相關性來看,55%、45%、35%、25%及15%這5個種質子集均可代表原種質集。

綜上,通過各種質集合的遺傳多樣性比較、t/F檢驗和相關系數比較,認為25%抽樣比例種質子集能代表原種質集。

2.3 核心種質的確認

由表5可見,與原種質集的遺傳距離相比,25%抽樣比例種質子集的最大距離與原種質集相同,平均距離和最小距離大于原種質集,說明25%抽樣比例種質子集保留了原種質的優異性狀外,還有效地去除了原種質中的冗余材料,與遺傳多樣性指數分析結果一致。如圖3所示,25%抽樣比例種質子集遺傳距離聚類圖在0.55水平上分為兩大類,聚類無有明顯的地理趨勢,不同種源的材料混雜的聚在一起,說明構建出的核心種質的代表性較好,遺傳多樣性較為豐富。認為25%抽樣比例下的,以21個樣株構建的種質子集能充分代表原種質集。

圖3 25%抽樣比例種質子集UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA clustering diagram of germplasm subset with 25% sampling ratio

表5 遺傳距離的比較

3 討 論

本研究采用28對SRAP引物進行擴增,共擴增出201條多態性譜帶,與前人研究結果相似[16-17]。核心種質庫的大小取決于抽樣比例的設置和原種質集大小。大量研究發現,5%～30%抽樣比例構建的核心種質和種質資源保存庫即可重復代表原種質群體[18],對不同的種質資源要考慮核心種質組成始終處于動態交流和調整之中,且隨著種質資源的不斷收集,還會出現新的變異類型,依據構建不同目的進行實用性檢驗是對核心種質有效性最直接和最具說服力的檢驗途徑,王曉麗等[10]以30%的抽樣比例構建的材用云南松種質保存庫,可以提高原種質群體52.16%的遺傳距離,劉遵春等[19]以新疆野蘋果初級核心種質中的60份種質構建了包含45份的核心種質,其抽樣比例高達70%,為原始種質的14%,保留了93%以上的農藝性狀,鄭福順等[2]以15%抽樣比例構建包含72份寧夏地區的番茄核心種質。本研究認為25%抽樣比例構建的核心種質,符合前人研究的抽樣比例規律,所構建的核心種質能充分保留原種質集遺傳性質,提高種質間的遺傳距離。

基于離散型的分子標記數據推測林木間的遺傳距離和遺傳多樣性,采用的遺傳距離和聚類法依林木種類而不同,最常見的是Nei’s遺傳距離,而聚類方法多數采用不加權類平均法,構建核心種質的研究中也常見關于遺傳距離、聚類方法、抽樣方法及比例等構建策略的研究[10,19-20]。評價指數常見的有標記頻率差異百分率、平均期望雜合度、多態位點百分率、Shannon-Weaver多樣性指數、平均有效等位基因數和平均多態信息含量[10,19-21],常通過t/F檢驗分析種質子集的代表性。本研究依據前人研究的種質子集評價指數,結合均值t/F檢驗、相關系數分析、聚類分析等分析方法來分析種質子集對原種質集的代表性,結果表明,構建的核心種質盡可能保留等位基因數和遺傳多樣性,提高原種質集的遺傳距離,減少冗余,這與前人的研究結果一致,其分析結果在后續基于SRAP分子標記數據構建林木核心種質的研究中具有一定的借鑒參考價值。但本研究的樣品總數較少,因此在今后研究中還需補充并收集新的種質資源。

大量研究表明,生物的優良家系及優樹的平均遺傳增益和經濟效益顯著高于普通樹種[22-23],林木種質資源庫的建設對林木資源的保護和利用具有重要意義。但林木樹體高大、生長周期長,且種質資源收集工作是不斷動態變化的,數量會不斷增加,導致其種質資源保存費力、費時,而在種質資源庫的基礎上構建核心種質是解決上述問題的一個有效途徑。不同于以往林木種質構建核心種質研究中的大范圍取樣,種質資源庫中的優樹樣株本身已經經過一次選優過程,構建核心種質更加便捷。曾憲君等[24]以歐洲黑楊基因庫中的優樹無性系子代,構建了歐洲黑楊優質核心種質;彭嬋等[25]以湖北南方型美洲黑楊種質資源庫中的優樹無性系,構建了美洲黑楊優質核心種質;張良波[26]以光皮樹種質資源庫中的211株光皮樹優樹構建光皮樹優樹核心種質。本研究以旱冬瓜種質資源庫中的優樹子代(10年生)為試材,進一步探索構建林木核心種質的方法。研究表明,基于優樹半同胞子代構建旱冬瓜核心種質的方法與前人研究結果類似,為優質旱冬瓜種質資源的長期保存和高效利用提供理論依據,也為其他林木核心種質構建提供參考。

4 結 論

在25%抽樣比例下構建的旱冬瓜種質子集能充分代表原種質的遺傳多樣性,可作為該原種質的核心種質。利用上述核心種質構建策略,從84株樣株組成的原種質中,篩選出21株樣株組成旱冬瓜核心種質。