黃腐酸提取、分析、分級以及存在問題簡述

趙建亮 劉 閆 宮迎春 劉 超 趙新巍 周 平 尹春艷

青島蘇貝爾作物營養有限公司 青島 266000

黃腐酸含有羧基、羥基等多種含氧官能團，這使其具備較高的活性[1，2]。黃腐酸結構復雜，因來源不同更是千差萬別。人們對黃腐酸的分子結構沒有定論，Schnitzer[3]根據實驗結果推測的黃腐酸分子結構如圖1所示。但從有機合成角度來看，此結構并不是一個大分子結構，只是幾個小的、存在強極性氫鍵的有機分子形成的超分子體系，仍是混合物。黃腐酸的結構至今無準確的報道。

圖1 Schnitzer提出的黃腐酸結構模型Fig.1 Fulvic acid structure model proposed by Schnitzer

隨著現代技術的發展，人們對黃腐酸的研究逐漸深入，已將其廣泛應用于農業、工業、環境、醫藥等方面。基于黃腐酸在各領域的重要作用，因此對黃腐酸的研究更為有意義。黃腐酸分為從風化煤、褐煤、泥炭等有機礦物中提取的礦物源黃腐酸和以農林、廚余廢棄物、酒精廢棄物為原料經微生物發酵制得的生物質黃腐酸[4]。國內外學者對從泥炭、褐煤和風化煤等低階煤中提取黃腐酸已做了大量研究，近年來各行業對礦物源黃腐酸的應用頻率大大升高，因此針對礦物源黃腐酸提取、分級及鑒定也顯得尤為重要。

本文主要對礦物源黃腐酸常用的提取方法進行了探討，同時進一步總結了提取后的黃腐酸分級和鑒定，但由于生物質黃腐酸逐步興起，其中也穿插了一些對礦物源與生物質黃腐酸的鑒別。最后，列舉了一些目前黃腐酸行業存在的問題及對未來發展進行了展望，以期為黃腐酸的深入研究與應用提供理論基礎和科學依據。

1 黃腐酸提取

1.1 堿溶酸析法

堿溶酸析法是指向樣品中加入堿溶液，在加熱、攪拌等條件下充分反應，得到腐植酸鹽溶液，再用酸溶液調節pH到一定范圍，離心、過濾即得黃腐酸產品。此過程利用黃腐酸溶于酸性溶液的特性，隨著酸的加入，溶液pH降低，不溶于酸的棕腐酸和黑腐酸依次析出，最終將黃腐酸提取出來。

馬力通等[5]采用堿溶酸析法，將8種堿性萃取劑提取黃腐酸的產率、純度和結構進行比對，結果表明Na2SO3提取的黃腐酸濃度最高，達0.284 g/L。焦元剛[6]則用1%的NaOH與稀硫酸提取風化煤中黃腐酸，探究不同終點pH對黃腐酸提取率的影響，發現pH增大使非黃腐酸物質溶解量增加且提取率升高。

此法提取簡單，成本低，適合大批量生產，是提取黃腐酸最常用方法之一。但得到的黃腐酸純度較低，易含較多非黃腐酸物質，需進一步純化。實際生產多選用KOH、NaOH為堿溶試劑提取黃腐酸。

1.2 化學氧化法

化學氧化法是指利用化學氧化劑將大分子腐植酸類物質氧化降解成小分子黃腐酸類物質。

Zhang Y等[7]以過氧化氫和甲酸為氧化劑并輔以微波提取新疆哈密褐煤中的黃腐酸，研究表明甲酸可以促進過氧化氫從褐煤中提取黃腐酸，其最佳收率可達9.13%。鄭紅磊[8]采用過氧化氫氧化法提取內蒙古呼倫貝爾褐煤中的黃腐酸，發現在過氧化氫濃度為17.5%、煤與過氧化氫比例為3.8∶1、溫度65 ℃、時間60 min的條件下黃腐酸的收率可達15.22%。

化學氧化法可以提高黃腐酸產率，增強含氧官能團活性與數量，但氧化劑的選擇是關鍵，硝酸易產生污染環境的副產物，而過氧化氫不穩定。

1.3 硫酸丙酮法

天然黃腐酸多以黃腐酸鹽的形式存在，如煤炭中黃腐酸多以鈣鎂的金屬鹽形態存在，硫酸中的氫離子取代黃腐酸鹽中的金屬離子，生成游離狀態的黃腐酸溶于丙酮，過濾去除不溶的硫酸鹽和雜質得到黃腐酸溶液，蒸發去掉溶劑即為黃腐酸產品。

焦元剛[6]采用硫酸丙酮法提取風化煤中的黃腐酸，使用的提取液為10%的丙酮溶液，在液固比7.5、時間1 h、酸煤比0.05、溫度30 ℃的條件下，黃腐酸的提取率達41%。但丙酮易揮發，易對人體和環境造成傷害。文鵬麗[9]采用乙醇替代丙酮，在液固比為4、反應時間1 h、提取液含水量15%、酸煤比0.1的條件下提取內蒙古風化煤中的黃腐酸，提取率可達32.28%。

1.4 離子交換法

離子交換法與硫酸丙酮法基本類似，利用強酸性離子交換樹脂中的氫離子取代可溶性黃腐酸鹽中的金屬離子，從而去除金屬離子，得到黃腐酸。王彩虹等[10]將DAX-8型樹脂與001×7 H+型樹脂相結合，提取的黃腐酸純度可達94.49%。

離子交換法方法簡單，除可用于提取黃腐酸外，還可對黃腐酸粗品純化得到更高純度的黃腐酸，使用的離子交換樹脂活化后可重復利用，但離子交換樹脂的再生活化工藝復雜，成本比較高，生產上通常不采用。

除了上述提取黃腐酸的方法外，還有微生物法（主要為發酵法），楊鑫[11]從混合菌株中篩選出一種對峨山褐煤提取效果最好的菌株，此方法提取的黃腐酸的水溶性和絮凝極限均變好，活性官能團增多。

2 黃腐酸的定性定量分析

黃腐酸含多種官能團，結構復雜。此外，制備黃腐酸的礦物源和生物質源原料有本質上的區別，以及黃腐酸提取方式的多樣性，使黃腐酸物質組成差異巨大。目前市場上出現用有機物類非黃腐酸冒充礦物源黃腐酸的案例，因此選取科學有效的分析手段對黃腐酸結構及性質進行定性定量分析以及如何鑒別真假黃腐酸是近年來研究的熱點。

2.1 黃腐酸含量檢測

根據《黃腐酸鉀》（HG/T 5334—2018）和《黃腐酸原料及肥料 術語》（GB/T 38072—2019）規定，黃腐酸原料、以黃腐酸為有機原料制成的肥料和以黃腐酸為基礎制備的黃腐酸鹽類均分為礦物源和生物質源。對于礦物源黃腐酸，中國腐植工業協會腐植酸質量檢測中心推薦采用《礦物源游離黃腐酸含量的測定》（GB/T 34765—2017）國家標準[12]，《黃腐酸鉀》（HG/T 5334—2018）和《肥料中黃腐酸的測定 容量滴定法》（NY/T 3162—2017）也是常用的檢測礦物源黃腐酸標準。僅有《黃腐酸鉀》一個標準既適合礦物源又適合生物質黃腐酸，而殷慧敏[13]對該標準稍加修改，先用七水硫酸鋅和五水硫酸銅沉淀分離黃腐酸后氧化滴定檢測，同時引入沉淀系數，可以很好地區分礦物源黃腐酸與生物質黃腐酸。

黃腐酸檢測標準大致分為提取、酸化分離、去除金屬離子、氧化和滴定5個步驟，即利用重鉻酸鉀的強氧化性來氧化黃腐酸中碳元素，再用硫酸亞鐵銨標準溶液滴定剩余重鉻酸鉀量間接求得黃腐酸含量，只是不同標準可能會在試劑濃度、碳系數和酸析pH等方面略有差異。

2.2 元素分析

元素分析是對黃腐酸樣品中特定元素的定量分析，也是黃腐酸定量的主要方法之一。黃腐酸中所含的C、H、N、S、O 5種元素，前4種常采用元素分析儀測定，氧元素利用差減法亦可得出。黃腐酸中元素的差異可以反映官能團及分子結構的變化，如C/O和C/H比分別反映了黃腐酸含氧官能團數量和芳香程度。李亞軍[14]利用微波輔助過氧化氫氧化呼倫貝爾褐煤，發現煤樣中氮元素與硫元素含量分別減少0.73%和0.09%，說明過氧化氫氧化有助于脫氮、脫硫。因此，元素分析可以對黃腐酸提取與純化后的產物進行初步驗證且為后續標準提供理論依據，但此方法受限于結晶水對結構的影響。

2.3 官能團含量的測定

黃腐酸所含的大量含氧官能團（羧基、羥基、羰基等），對其理化性質與生理活性有重要影響。常采用氫氧化鋇滴定法測得樣品中總酸基含量，醋酸鈣測定羧基含量，總酸基減羧基為酚羥基含量[15]。

2.4 波譜分析

波譜分析法是根據每種原子特有的特征譜線來鑒別物質及確定含量的方法。

2.4.1 紫外-可見光譜

紫外-可見光譜是利用黃腐酸分子對紫外（200～400 nm）和可見光（400～800 nm）的吸收所得。由于黃腐酸結構復雜，各官能團的吸收光譜會發生不同程度的位移或重疊，故其光譜對黃腐酸結構分析存在局限性。目前，在腐植酸應用研究中普遍認為465 nm和665 nm處吸光度比值（E4/E6）反映黃腐酸分子的芳香縮合度，比值越高，芳香縮合度越低；但對此特征常數的討論也不斷，部分學者認為E4/E6比值與分子量有關而與芳香縮合度無關[16]，關于此比值的界定仍需進一步研究。

2.4.2 紅外光譜

紅外光譜中不同的化學鍵有不同的吸收波長位置。由于黃腐酸結構的復雜性及各基團相互影響，定量分析困難，但可以利用紅外光譜確定黃腐酸的特征峰及其歸屬，對其官能團進行定性分析。趙亞玲[17]將河南風化煤中提取的礦物源黃腐酸、秸稈和蘋果渣發酵提取的生物質黃腐酸進行紅外光譜分析發現圖譜具有相似之處。

2.4.3 核磁共振波譜

核磁共振波譜是根據物質吸收光能量的磁場區或化學位移不同來辨別化合物結構的。黃腐酸結構以C、H、O為主，因此核磁共振氫譜與核磁共振碳譜是研究腐植酸分子結構與官能團的主要波譜。路亞楠等[18]利用1H NMR鑒定了不同萃取劑提取褐煤中腐植酸對其結構和官能團的影響；張超[19]利用核磁共振碳譜和氫譜表征從風化煤和造紙黑液中提取的黃腐酸，發現二者結構大體相同，但造紙黑液里的黃腐酸結構更為復雜且含較多芳香結構。但此方法因黃腐酸可以準確積分的烷基氫少，加上其溶解度在非水溶劑中不好或容易吸水問題，以及活性氫（來源COOH，OH或NH，SH）本身的積分易受環境影響而無法標準化等導致定量分析的準確度比較低。

2.4.4 色譜-質譜分析

黃腐酸大分子經化學降解或熱降解后變成小分子碎片，進入色譜柱分離，由質譜儀定性定量分析碎片離子的組成，反推測黃腐酸的可能局部結構。目前，氣相色譜-質譜聯用（GC/MS）是分析黃腐酸物質碎片結構的通用手段。王智[20]將礦物源黃腐酸與生物質黃腐酸用熱裂解-氣相色譜-質譜聯用法對比其組分，發現生物質黃腐酸含有礦物源黃腐酸所沒有的稠環芳香化合物。Qin Y等[21]對氧化褐煤提取的黃腐酸用透析袋透析為100～500分子量大小的黃腐酸，采用GC/MS對其研究，共得到47種碎片離子類化合物。

2.4.5 熒光光譜法

利用黃腐酸樣品被紫外線照射后發出反映黃腐酸特性的熒光進行鑒定[14]。在黃腐酸溶液濃度低時，熒光強度與濃度呈正比，可以準確地定性定量分析；若濃度較大，會發生自吸收或自猝滅，熒光強度與濃度無線性關系，對黃腐酸的定量分析產生局限性。

2.4.6 拉曼光譜法

拉曼光譜是根據光散射效應的分析技術，從分子能級的變化來鑒定黃腐酸分子結構，可對黃腐酸樣品進行快速、無損檢測。但此法在黃腐酸結構分析方面研究不多。

3 黃腐酸分級

盡管目前國內外采用很多先進儀器和方法來表征分析黃腐酸，但黃腐酸是由一系列相對分子量較小的有機分子結合而成的混合物，本身的異質性限制人們對黃腐酸的表征與分析，使得當下仍無明確清晰的黃腐酸組成及作用機理。因此，根據黃腐酸分子量、溶解性對其進行分級，得到不同梯度性質相似的物質，降低黃腐酸異質性，便于更好地研究不同級分黃腐酸的理化性質、結構組成和作用機理。

3.1 梯度淋洗法

此方法采取溶劑梯度和溫度梯度相結合的手段對黃腐酸進行分級。將黃腐酸溶于內置玻璃珠的溶劑（乙醇）中，減壓蒸餾后去除乙醇，黃腐酸將均勻附著在玻璃珠表面，將其放于玻璃柱中，用不同淋洗液（乙醇與非溶劑復配）和溫度梯度對玻璃柱淋洗，依次減壓蒸餾即得不同分子量的黃腐酸。張德和[22]用該法對黃腐酸進行分級得到了12個分子量級別的組分，且回收率高達99.6%，但此方法造成淋洗液的過度浪費。

3.2 分子篩層析法

分子篩采用多孔網狀結構的凝膠，分離出不同分子量大小的黃腐酸，因此又叫凝膠過濾法。黃腐酸分子量較大的物質由于不能流入凝膠孔內，會快速流過凝膠間，流出凝膠柱；而分子量較小的物質會進入凝膠內部，按分子量大小依次流出凝膠柱，分子量越小，流出越晚。若樣品濃度過高，會減弱分離效果，導致黃腐酸分級收率較差[23]。

3.3 膜分離法

膜分離法分為透析袋分級和加壓超濾。透析袋分級是將裝有黃腐酸溶液的特定相對分子量的透析袋置于緩沖溶液中，利用半透膜內外不同的濃度差，比半透膜分子量小的物質被透析出來為透析液，分子量大的物質留在袋內為保留液。通過不同分子量透析袋透析所得的透析液減壓蒸餾即得黃腐酸的不同級分[21]。此法操作便捷，透析袋可循環使用。梁媛媛等[24]采用透析膜將黃腐酸分為＜3000、3000～10000和＞10000 Da 3個分子量等級，發現分子量越小的黃腐酸親水性與活性越高，低施用量效果顯著。

加壓超濾與透析袋分級原理類似，同樣利用特定超濾膜來分級，不同點在于加壓超濾利用儀器對超濾膜加壓來對黃腐酸分級。不同分子量的物質在壓力作用下通過不同孔徑的超濾膜被分離出來[25]。超濾膜越小，所需壓力越大，分離速度越慢。

4 存在問題

黃腐酸蘊含豐富的含氧官能團決定其具備諸多的特性，這使得它在農業、工業、環境、醫藥領域得以廣泛應用。越來越多的學者對黃腐酸展開研究，但由于其復雜的結構使得對黃腐酸研究仍面臨許多問題：（1）低階煤種類豐富，提取方法繁多，都會導致提取到的黃腐酸結構（官能團種類、數量）差異化。因此，對不同來源、不同提取方式所得的黃腐酸結構及作用機理的研究十分重要；（2）目前來看，我國低階煤資源豐富，但隨著工業化進程加快，勢必面臨能源短缺問題，如何高效地從低階煤中提取黃腐酸或尋找新的來源值得思考；（3）黃腐酸檢測主要為容量法，此方法受碳系數影響較大，常出現同一個產品不同單位檢測黃腐酸含量不同，甚至差距較大的現象，這些都與黃腐酸碳系數不統一或不合理有關[26]；（4）近年來關于生物質黃腐酸的研究增多，相比類黃腐酸、發酵有機酸等，生物質黃腐酸逐漸被大家認可[27]，但不同來源黃腐酸所含羧基、羥基等活性官能團數量、位置不同，與其他原料可能發生的反應及其作用于土壤中的機理也不同，在此基礎上制得的黃腐酸肥料難以保證良好的穩定性是目前肥料行業普遍出現的問題；（5）如何更好地鑒定礦物源黃腐酸與生物質黃腐酸也是目前存在的主要問題，黃腐酸肥料生產成本較高、而原料的質量檢測標準匱乏，針對生物質黃腐酸檢測標準也只有《黃腐酸鉀》標準，很難做到很好地區分兩種黃腐酸，容易導致黃腐酸類肥料生產以假亂真、粗制濫造。

5 展望

黃腐酸在多領域有很大應用潛力，如醫藥和畜牧領域，對人體及動物多種疾病預防與治療效果顯著，為以后提高藥效和長期安全性還需進一步摸清其在人體和動物中的起效機理。黃腐酸在農業上的應用仍是主流，其良好的水溶性使其在肥料復配中極具優勢，添加氨基酸、海藻酸等天然活性物質與黃腐酸配伍，開發新型黃腐酸肥料，是實現農業可持續發展的一個思路。

黃腐酸雖應用廣泛，還是更要注重其結構與組成的基礎研究，為后續黃腐酸肥料標準的制定和黃腐酸類新產品的推出奠定基礎；本文概述的黃腐酸提取、鑒定及其分級部分雖主要以礦物源黃腐酸為主，在定性定量及分級部分也只是粗略列舉了關于礦物源黃腐酸與生物質黃腐酸測定和結構方面的差異，如何快速清晰的對二者進行鑒別和檢測也是一直以來許多行業關注的問題；其次，表征黃腐酸結構的的儀器與方法很多，科學搭配，整理和完善不同來源、不同提取方法制得的黃腐酸的結構數據，更加合理的應用黃腐酸，提高黃腐酸利用率，讓用黃腐酸制成的產品更加穩定，減少因質量問題而被市場淘汰的概率；在黃腐酸肥料產業，含礦物源黃腐酸的肥料產品一直占市場較大比例，生物質黃腐酸雖然備受爭議，但也逐漸被認可，針對不同種類的黃腐酸肥料，應定向細化標準，做到每類含黃腐酸產品均有檢測標準可循，讓黃腐酸行業健康穩定地發展。