奧氮平對乳腺癌相關巨噬細胞增殖與分化功能的影響

孟娟，李東輝，高元慧，劉梅，李建旺（海口市人民醫院，.腫瘤內科；2.泌尿外科；.中心實驗室，海口 570208）

乳腺癌已成為全球女性發病率最高的腫瘤，嚴重威脅到女性的健康。乳腺癌的發生發展是多種因素共同作用產生的，除了生殖、遺傳、飲食、生活方式及環境因素外，精神因素也是造成乳腺癌發病風險增加的重要因素[1]。奧氮平（OLZ）作為一種能拮抗5-羥色胺（5-HT）、多巴胺、膽堿能作用的精神類藥物，不僅能穩定精神情緒，改善抑郁狀態，提高睡眠質量，還具有良好的止吐作用[2-3]。作為止吐藥物，奧氮平已成為美國國立綜合癌癥網絡（NCCN）、歐洲腫瘤內科學會（ESMO）指南中預防高、中度致吐風險化療藥物的標準方案，在腫瘤對癥治療中廣泛使用。然而奧氮平對于腫瘤的影響尚不明確，本研究通過奧氮平作用于體外乳腺癌細胞-巨噬細胞共培養體系，研究其對巨噬細胞增殖與分化的影響，探討奧氮平在乳腺癌治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑及儀器

奧氮平（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），佛波酯（PMA，Sigma，USA），DMEM基礎培養基、胎牛血清（FBS）（Gibco，USA），Transwell培養板（Corning，USA），CCK-8（碧云天生物技術有限公司），動物組織/細胞總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，miRNeasy Mini Handbook（德國Qiagen），HiScriptⅡQ Select RT SuperMix for qPCR（＋gDNA Wiper）試劑盒、miRNA 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒（by stem-loop）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊），CO2恒溫培養箱（上海一恒），酶標儀（Thermo，USA），熒光定量PCR儀（BioRad CFX96，USA）等。

1.2 細胞培養

THP-1細胞用完全培養基為含10% FBS的RPMI 1640培養，MDA-MB-231細胞用含10%FBS的DMEM培養。所有細胞置于37℃、5%CO2培養箱中培養，當MDA-MB-231細胞生長至融合時，先用pH 7.4 PBS緩沖液漂洗一次，然后用1 mL 0.25%胰酶消化細胞，待細胞開始變圓后，加入3 mL培養基終止胰酶的消化作用，吹吸細胞使其完全分散，再1∶3傳代培養或調至所需細胞密度進行鋪板。

1.3 CCK-8法檢測共培養條件下THP-1的細胞增殖活性

將400 μL 1×105個·mL－1的密度的THP-1、MDA-MB-231細胞鋪進24 Transwell培養板中，培養24 h后，分別加入2 μmol·L－1和100 μmol·L－1的奧氮平，繼續培養48 h后每100 μL加入10 μLCCK-8試劑，繼續培養2 h，酶標儀450 nm測定吸光度。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測巨噬細胞表面分子與相關炎癥因子的表達

將400 μL 1×105個·mL－1的密度的細胞鋪進24 Transwell培養板中，培養24 h后，分別加入50 μmol·L－1奧氮平和100 ng·mL－1佛波酯。不同按處理方式，分為PMA-T組：佛波酯處理的THP-1細胞；PMA-OLZ-T組：奧氮平和佛波酯共同處理的THP-1細胞；PMA-TM組：佛波酯處理的THP-1與MDA-MB-231共培養體系；PMA-OLZ-TM組：奧氮平和佛波酯共同處理的THP-1細胞與MDA-MB-231共培養體系。繼續培養72 h后收集巨噬細胞，細胞總RNA提取使用動物組織/細胞總RNA提取試劑盒。以提取的總RNA為模板，使用HiScriptⅡQ Select RT SuperMix for qPCR（＋gDNA Wiper）試劑盒進行反轉錄，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進行qRT-PCR實驗檢測各基因的表達。qRT-PCR擴增程序為：95℃ 預變性30 s，95℃ 變性5 s，60℃退火并延伸30 s，共40個循環，熔解曲線65℃ 5 s，95℃ 5 s，1個循環。利用2－ΔΔCt公式計算miRNA相對表達量。miRNA引物序列見表1。

表1 qRT-PCR檢測miRNA表達用引物序列Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR detection of miRNA expression

1.5 qRT-PCR檢測巨噬細胞極化相關miRNA的表達

將400 μL 1×105個·mL－1的密度的THP-1、MDA-MB-231共培養細胞鋪進24 Transwell培養板中，培養24 h后，分別加入50 μmol·L－1奧氮平和100 ng·mL－1佛波酯，繼續培養72 h后收集細胞，細胞miRNA提取使用miRNeasy Mini Handbook。以提取的miRNA為模板，利用Stem-loop引物，使用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒（by stem-loop）進行反轉錄，使用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix進行qRT-PCR實驗檢測各miRNA的表達。利用2－ΔΔCt公式計算miRNA相對表達量。實驗所用miRNA的Stem-loop引物、上下游引物序列見表2。

表2 qRT-PCR檢測miRNA表達用引物序列Tab 2 Primer sequences for qRT-PCR detection of miRNA expression

1.6 統計學分析

實驗獨立重復2次，結果用Graphpad Prism 10統計軟件進行分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 奧氮平在體外抑制THP-1、MDA-MB-231共培養條件下THP-1細胞的增殖活性

經過不同濃度的奧氮平處理48 h后，CCK-8法檢測THP-1單獨培養組中及其與MDA-MB-231共培養組（Co-THP-1）中THP-1細胞的增殖活性，結果顯示：2 μmol·L－1和100 μmol·L－1奧氮平對單獨培養的THP-1細胞增殖均有明顯抑制作用（P＜0.05），100 μmol·L－1奧氮平對Co-THP-1也有一定程度的抑制作用（P＜0.05）。兩組THP-1（Co-THP-1）的細胞活性并無明顯差異（P＞0.05）（見圖1）。

圖1 不同濃度奧氮平對THP-1和Co-THP-1組中THP-1的增殖活性的影響（＊P＜0.05）Fig 1 Effect of different concentrations of olanzapine on activity of THP-1 in the THP-1-alone group and the co-culture group （＊P＜0.05）

2.2 奧氮平對巨噬細胞表面標志物表達的調節

與PMA-T組相比，PMA-OLZ-T組中THP-1細胞表面分子CD68顯著增加（P＜0.05）；與PMA-T組相比，PMA-TM組中THP-1細胞表面分子CD68、CD80和CD163均無明顯變化（P＞0.05）；而與PMA-TM組相比，PMA-OLZ-TM組中THP-1細胞中CD68、CD80、CD163的表達顯著升高（P＜0.05）；與PMA-OLZ-T組相比，PMA-OLZ-TM組中THP-1細胞的CD68、CD80、CD163水平也均有不同程度升高（P＜0.05）（見圖2）。

圖2 qRT-PCR法檢測各組中巨噬細胞表面分子CD68、CD80及CD163的表達（＊P＜0.05）Fig 2 Expression of THP-1 surface molecules CD68，CD80，and CD163 by qRT-PCR（＊P＜0.05）

2.3 奧氮平對巨噬細胞炎性因子和趨化因子表達的調控

與PMA-T組相比，PMA-OLZ-T組中THP-1的炎癥因子IL-12顯著增加（P＜0.05），其余因子的變化并不明顯；與PMA-T組相比，PMA-TM組中THP-1的炎癥因子和趨化因子均無明顯變化（P＞0.05）；與PMA-TM組相比，PMA-OLZ-TM組中THP-1的CCL2、CXCL10、IL-1β、IL-10、IL-6、IL-12、TNF-α表達水平顯著升高（P＜0.05）；與PMA-OLZ-T組相比，PMA-OLZ-TM組中THP-1的CCL2、CXCL10、IL-1β、IL-10、TNF-α水平也均有不同程度升高（P＜0.05）（見圖3）。

圖3 qRT-PCR法檢測各組巨噬細胞炎性因子和趨化因子表達水平（＊P＜0.05）Fig 3 Expression of THP-1 surface molecules and inflammatory factors by qRT-PCR（＊P＜0.05）

2.4 奧氮平對巨噬細胞極化相關miRNA分子表達的調控

奧氮平處理THP-1細胞72 h的結果顯示，THP-1組中，奧氮平僅對miR155和Let7c的表達有明顯影響（P＜0.05），對miR146、miR9和miR34a的影響并不明顯。但在佛波酯誘導THP-1分化的情況下，與Co-THP-1組巨噬細胞極化相關miRNA分子miR34a和Let7c出現顯著變化（P＜0.05）（見圖4）。

圖4 qRT-PCR法檢測各組巨噬細胞極化相關miRNA分子的表達（*P＜0.05）Fig 4 Expression of macrophage differentiation-associated miRNAs by qRT-PCR（*P＜0.05）

3 討論

藥物治療是乳腺癌治療的關鍵，但新藥的研發成本巨大，而藥物再利用與新藥開發相比，可大幅縮短藥物的研發時間、成本和風險，奧氮平作為一種經濟、安全有效的藥物，在臨床中廣泛應用。它可阻斷多種神經遞質，包括多巴胺D1、D2、D3和D4受體，5-HT2A、5-HT2C、5-HT3受體，兒茶酚胺受體，α1-腎上腺素能受體，毒蕈堿受體的乙酰膽堿M1，組胺H1受體等。而乳腺癌的發生與精神壓力密切相關，在精神壓力作用下神經系統調節交感神經，刺激末梢神經釋放高濃度的兒茶酚胺和糖皮質激素，干擾神經內分泌和免疫系統的平衡，調節腫瘤微環境，誘導巨噬細胞分化[4]。而巨噬細胞是腫瘤微環境中重要的免疫細胞，參與抗原呈遞、吞噬和其他免疫調節過程，在腫瘤的發生發展過程中起到重要作用。THP-1細胞通常可被佛波酯誘導分化為巨噬細胞，廣泛用于單核細胞和巨噬細胞相關的機制、信號通路以及營養和藥物運輸等研究中。巨噬細胞在不同因素的刺激下可分化為M1型或M2型巨噬細胞[5]。在腫瘤發展的初始階段，巨噬細胞可以通過殺死腫瘤細胞直接促進抗腫瘤反應，表現為M1型[6]。由于腫瘤進展，腫瘤相關巨噬細胞（TAM）開始表現出免疫抑制的M2型，通過產生大量生長因子、細胞外基質重塑分子和細胞因子促進腫瘤的生長、遷移和血管生成[7-8]。本課題組推測，具有神經系統調節功能的奧氮平可影響巨噬細胞的增殖和分化，從而影響腫瘤生長。因此進一步明確奧氮平在乳腺癌中的作用機制，為奧氮平的藥物再利用提供充分依據。

在前期實驗中發現，不同濃度的奧氮平對單獨THP-1細胞和MDA-MB-231細胞共培養條件下的THP-1細胞均有抑制作用，但兩者之間并無差異。這提示奧氮平對THP-1細胞增殖活性的影響并不會受到MDA-MB-231細胞的影響。由于100 μmol·L－1的奧氮平對THP-1細胞增殖活性的影響較為明顯，后續的實驗中，采用50 μmol·L－1的奧氮平對巨噬細胞的分化進行研究。

為了進一步研究奧氮平對THP-1細胞和MDA-MB-231細胞共培養條件下THP-1的分化是否存在差異，本研究通過佛波酯誘導THP-1細胞向巨噬細胞分化，然后對巨噬細胞表面分子的表達進行檢測。結果顯示，在THP-1細胞單獨培養組中，奧氮平僅參與CD68表達的調控；而在MDA-MB-231細胞參與的情況下，奧氮平能夠顯著提高CD68、CD80和CD163的表達水平，這提示奧氮平的存在對于THP-1細胞向巨噬細胞分化有著重要的意義，而MDA-MB-231細胞的存在對奧氮平影響巨噬細胞分化起著基礎作用，但尚不能明確巨噬細胞M1或M2分化的方向。

為了進一步探索奧氮平對巨噬細胞分化的影響，我們檢測了THP-1細胞向巨噬細胞分化時趨化因子和炎癥因子表達的變化。結果顯示，在MDA-MB-231細胞的參與下，單純佛波酯誘導的THP-1細胞向巨噬細胞分化過程中炎癥因子的變化并不明顯。但是，在奧氮平的參與下，佛波酯誘導THP-1向巨噬細胞分化時IL-12的表達增加；隨著MDA-MB-231細胞的進一步參與，CCL2、CXCL10、IL-1β、IL-10、IL-6、IL-12、TNF-α、TGF-β表達水平均顯著升高。這一結果進一步證明了奧氮平對腫瘤微環境下巨噬細胞分化存在重要意義。已有文獻顯示，CCL-2、IL-6、IL-12、IL-1β是M1型亞群表型[9]，說明經奧氮平處理后的THP-1有向M1型分化增強，向M2型分化減弱的可能。但M2型炎癥因子CXCL10、IL-10、TNF-α也有升高[10]，這提示腫瘤相關巨噬細胞的極化是一個復雜的過程，受多因素的調控。

miRNAs作為一種單鏈RNA，可以調節許多病理生理過程，如細胞增殖、代謝、凋亡等[11]。越來越多的證據表明，miRNA可以調節巨噬細胞極化[12]。結合前面的研究，腫瘤細胞的存在是奧氮平在巨噬細胞分化和極化中發揮作用的重要基礎，因而我們進一步檢測了巨噬細胞極化相關miRNA分子表達的變化。結果顯示，在腫瘤細胞參與的情況下，奧氮平對miR155、miR34a和Let7c都有一定的調節作用。Graff等[13]比較了極化的人單核細胞源性巨噬細胞和極化的人單核細胞THP-1細胞系中miRNA的表達，結果發現miR-155在M1和M2b條件下均升高。研究表明，miR-9通過靶向過氧化物酶體增殖體激活受體δ增強M1極化[14]，miR-155水平在巨噬細胞M1向M2極化時顯著下降，但在巨噬細胞M2向M1極化時升高[15]。但有研究得出不同的結論，張艷青等[16]發現TGF-β1下調miR-155的表達，巨噬細胞會趨向M2型活化。另外，miRNA34a抑制TAMs細胞極化過程，TAMs細胞過表達miRNA34a后可以顯著抑制MDA-MB-231細胞的生長增殖過程[17]。

綜上所述，本研究證明奧氮平能夠通過調節巨噬細胞表面分子、炎癥因子和極化相關miRNA分子，參與腫瘤微環境的調控。因此，奧氮平具有腫瘤治療的潛力及深入研究的價值。今后我們會進一步研究奧氮平調控乳腺癌腫瘤微環境的作用機制，并結合臨床病例進行深入研究，探索奧氮平在抗腫瘤治療中的新作用。