龍眼肉多糖對Aβ誘導耐受的小膠質細胞吞噬功能的影響及其機制

趙晨陽，崔鶴蓉，岳德瓊，張晗，李昶，李紅艷*（.遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 6600；.北京中醫藥大學，北京 0009）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種進行性發展的神經退行性疾病，β-淀粉樣蛋白（Aβ）過度累積和清除不足是AD發生發展的始動因素[1]。小膠質細胞是中樞神經系統的固有免疫細胞[2]，能夠感知識別Aβ并將其吞噬在自身溶酶體中從而限制它們在大腦中擴散[3]，有效抑制AD的自然病程，該過程依賴于mTOR/HIF-1α途徑[2]，并伴有PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活[4]。但長期暴露于Aβ環境中，小膠質細胞會出現能量代謝障礙并逐漸減少免疫應答而發展為慢性耐受[2]，導致Aβ大量沉積，造成大量神經元死亡和神經炎癥反應，最終導致AD發生[5]。

龍眼肉系無患子科植物龍眼（Dimocarpus longanLour.）的假種皮，龍眼肉多糖（longan aril polysaccharides，LAPs）是其主要有效成分之一。現代研究表明，LAPs能抑制脂多糖（LPS）誘導的炎癥介質產生和相關基因表達[6]，促進巨噬細胞的吞噬功能和炎癥因子釋放水平[7-9]。本研究基于文獻報道和前期研究結果，體外建立Aβ誘導耐受的小膠質細胞（BV2）模型，探討LAPs對Aβ耐受BV2細胞吞噬能力的影響，并結合課題組前期研究結果[10]及小膠質細胞免疫應答反應與PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路的相關性[2，4]，通過Western blot技術和熒光Aβ吞噬實驗等分析LAPs改善BV2細胞吞噬功能的作用機制，為深入探究LAPs的抗AD作用奠定基礎。

1 材料

1.1 細胞及培養

小鼠小膠質細胞BV2（協和細胞庫），使用含10%胎牛血清與1%雙抗的高糖DMEM培養基于37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2 試藥

龍眼肉（貨號：2206001，河北潤滑藥業）；Aβ1-42（批號：P210727-GB20601，上海捷妮泰生物科技）；Alexa Fluor 488熒光標記Aβ1-42（批號：2156636，Anaspec）；DMEM高糖培養基（批號：8121526）、胰蛋白酶（批號：2277231）（Gibco）；胎牛血清（批號：18070505，四季青）；雙抗（批號：J200044，Hyclone）；抗GAPDH抗體（批號：3561122204）、抗AKT抗體（批號：55500009442）、抗P-AKT（S473）抗體（批號：5500011663）、抗HIF-1α抗體（批號：5500016723）、抗PI3K抗體（批號：3560538002）、HRP山羊抗兔IgG（H＋L）（批號：9300014001）（ABclonal）；線粒體膜電位JC-1檢測試劑盒（批號：20210712）、雷帕霉素（批號：427W021）、BAY87-2243（批號：709B021）（索萊寶）。

1.3 儀器

萬分之一電子分析天平（Ohaus）；旋轉蒸發儀（上海申生科技有限公司）；調溫電熱套（北京市永光明醫療儀器有限公司）；CO2培養箱（Nuaire）；酶標儀（Mindray）；熒光倒置顯微鏡（Nikon）；電泳儀、半干式蛋白轉膜儀（Bio-Rad）；全自動化學發光/凝膠成像分析系統（Tanon）。

2 方法與結果

2.1 龍眼肉多糖的制備

稱取200 g去核龍眼肉，剪碎，置于10 L圓底燒瓶中，加入10倍量純水浸泡2 h后，于加熱套中加熱提取，220 V加熱至沸騰后，轉至50 V保持微沸1 h，冷卻后四層紗布過濾，收集濾液，同法煎煮3次，合并濾液，70℃蒸發濃縮至200 mL得龍眼肉水煎液，采用“慢加快攪”的方式向其中加入95%乙醇至乙醇終濃度為80%以上，充分攪拌后，靜置12 h以上，5000 r·min－1離心10 min，收集沉淀，60℃干燥至恒重即得LAPs。根據公式：LAPs收率（%）＝LAPs稱重質量（g）/龍眼肉質量（200 g）×100%，計算得LAPs收率約為25.51%；依據文獻[11]，采用苯酚-硫酸法測得其多糖含量為（56.25±1.25）%。

2.2 Aβ耐受BV2細胞模型的建立

模型建立方法參考文獻[2]并進行適當修改。取對數生長期的BV2細胞，無菌接種于96孔細胞培養板，常規培養12 h后，隨機分為對照組及Aβ2、4、8 μmol·L－1組。除對照組外，各組分別采用2、4、8 μmol·L－1Aβ處理細胞48 h，對照組加入終體積相同的培養基。48 h后各組更換新鮮培養基常規培養24 h，再加入2 μmol·L－1Aβ誘導細胞激活，依據MTT法進行細胞增殖實驗，確定誘導BV2細胞耐受的Aβ最佳濃度，建立BV2細胞耐受模型。結果表明，隨著Aβ濃度增加，細胞增殖率逐漸降低，8 μmol·L－1Aβ已出現明顯細胞毒性（見圖1A，P＜0.05）。故選用2和4 μmol·L－1Aβ進行進一步實驗，即在Aβ處理細胞48 h＋24 h后，加入2 μmol·L－1Aβ再次處理細胞，觀察細胞增殖情況，結果表明，2 μmol·L－1Aβ組再次加入Aβ時（Aβ2＋2組），細胞較2 μmol·L－1Aβ組進一步增殖（見圖1B，P＜0.05），提示細胞尚未耐受；4 μmol·L－1Aβ組再次加入Aβ時（Aβ4＋2組）細胞增殖較4 μmol·L－1Aβ組顯著降低（見圖1C，P＜0.01），表明再次經Aβ處理時細胞并未繼續活化增殖，且因Aβ的再次加入而出現增殖率下降，提示在4 μmol·L－1Aβ處理細胞48 h＋24 h后，BV2細胞已達到耐受狀態，以此條件建立Aβ耐受的BV2細胞模型，作為模型組。

圖1 MTT法篩選Aβ耐受BV2細胞模型的造模條件Fig 1 Modeling conditions of immune-tolerant BV2 cell models by MTT method

2.3 MTT法檢測細胞增殖

取對數生長期的BV2細胞，接種于96孔細胞培養板，12 h后隨機分為對照組、模型組和LAPs組（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg·mL－1）。除對照組外，其余各組均加入終濃度4 μmol·L－1Aβ培養48 h后常規培養24 h建立細胞耐受模型。除對照組外，各組每孔加入2 μmol·L－1Aβ處理24 h誘導細胞激活，LAPs組在加入2 μmol·L－1Aβ前分別加入終濃度0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg·mL－1的LAPs預處理細胞2 h，MTT法檢測細胞增殖水平，選取細胞增殖率較高的濃度作為LAPs最佳給藥濃度。結果表明，與對照組比較，模型組細胞增殖率顯著提高（P＜0.05）（見圖2）。與模型組比較，當LAPs質量濃度為0.1 mg·mL－1時，細胞增殖率顯著降低（P＜0.01）；LAPs濃度為0.2、0.4 mg·mL－1時，細胞增殖差異無統計學意義；LAPs質量濃度為0.8、1.6 mg·mL－1時，細胞增殖率顯著提高（P＜0.05）。結果提示，LAPs可能因使用劑量不同，對BV2細胞活化有著雙向調節作用，低濃度（0.2、0.4 mg·mL－1）可能具有抑制BV2細胞激活的作用，高濃度（0.8、1.6 mg·mL－1）則能促進Aβ誘導耐受的BV2細胞增殖。

圖2 MTT檢測不同濃度LAPs對Aβ誘導耐受的BV2細胞增殖的影響Fig 2 Effect of different concentrations of LAPs on the proliferation of Aβ-induced tolerant BV2 cells by MTT method

2.4 JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位

取對數生長期的BV2細胞以1×105個·mL－1接種于6孔細胞培養板中，隨機分為對照組，模型組，LAPs 0.8、1.6 mg·mL－1組。除對照組外，其余各組均加入終濃度4 μmol·L－1Aβ培養48 h后常規培養24 h建立細胞耐受模型；各組每孔均加入2 μmol·L－1Aβ1-42再次處理細胞24 h，對照組加入等體積培養基。按照試劑盒說明書，每孔加入1 mL JC-1染色工作液，置于細胞培養箱中37℃孵育20 min。孵育結束后棄去上清液，使用JC-1染色緩沖液洗滌2次后于倒置熒光顯微鏡下觀察，Image J軟件分析各組細胞紅、綠色熒光強度，計算紅/綠熒光強度比，比較各組細胞線粒體膜電位變化。由圖3可見，與對照組比較，模型組細胞紅/綠熒光比值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，LAPs組細胞紅/綠熒光比值提高（P＜0.01）。結果提示，模型組細胞線粒體受損，膜電位下降或喪失；LAPs能提高Aβ誘導耐受的BV2細胞線粒體膜電位水平。

圖3 LAPs對BV2細胞線粒體膜電位的影響Fig 3 Effect of LAPs on mitochondrial membrane potential in BV2 cells

2.5 熒光顯微鏡檢測細胞吞噬功能

取對數生長期的BV2細胞，接種于96孔細胞培養板，細胞分組及處理同“2.4”項下。在LAPs預處理細胞2 h后，除對照組外，其余各組均加入終濃度4 μmol·L－1Aβ培養48 h后常規培養24 h建立細胞耐受模型；各孔細胞均加入2 μmol·L－1熒光標記Aβ1-42再次處理24 h，對照組加入等體積培養基。24 h后棄去各孔培養基，用PBS小心潤洗后，于倒置熒光顯微鏡下觀察，Image J軟件分析熒光強度，計算細胞熒光吞噬率。細胞熒光吞噬率（%）＝實驗組熒光強度/對照組熒光強度×100%。結果表明，與對照組比較，模型組細胞熒光吞噬率顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，LAPs組細胞熒光吞噬率顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），其中LAPs 0.8 mg·mL－1組熒光吞噬率尚未達到正常細胞水平（P＜0.05），LAPs 1.6 mg·mL－1組細胞熒光吞噬率顯著高于對照組細胞（P＜0.05）（見圖4A、B）。

圖4 LAPs對BV2細胞吞噬熒光Aβ的影響Fig 4 Effect of LAPs on the phagocytosis of fluorescent Aβ in BV2 cells

2.6 Western blot技術檢測PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路相關蛋白表達

取對數生長期的BV2細胞以5×105個·mL－1接種于細胞培養瓶中，細胞分組及處理同“2.4”項下。收集各組BV2細胞，用預冷PBS洗滌3次，根據說明書按比例加入裂解液，冰上裂解，吸取上清液進行BCA蛋白含量檢測。取等量蛋白，經SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉至NC膜上，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，洗滌；加入一抗（抗PI3K、Akt、p-Akt、HIF-1α以及GAPDH抗體，1∶500），4℃孵育過夜，洗滌；加入二抗（HRP標記山羊抗兔抗體，1∶3000），室溫孵育2 h，洗滌；采用ECL化學發光，用Image J軟件分析條帶灰度值。由圖5可見，與對照組比較，模型組除PI3K蛋白表達減少外，Akt、p-Akt和HIF-1α蛋白表達均增加（P＜0.01）；與模型組比較，LAPs（0.8、1.6 mg·mL－1）組的PI3K、Akt、p-Akt和HIF-1α蛋白的表達水平均提高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 LAPs對BV2細胞PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路蛋白表達的影響Fig 5 Effect of LAPs on the expression of PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α pathway proteins in BV2 cells

2.7 抑制劑BAY、Rapa對LAPs給藥后的BV2細胞吞噬功能的影響

取對數生長期的BV2細胞，接種于96孔細胞培養板，12 h后隨機分為對照組、模型組、LAPs組（0.8、1.6 mg·mL－1）和抑制劑組（LAPs＋BAY、LAPs＋Rapa），抑制劑組在LAPs給藥前根據文獻[2]分別加入HIF-1α抑制劑BAY87-2243（10 μmol·L－1）和mTOR抑制劑Rapa（30 nmol·L－1）。除對照組外，其余各組均加入終濃度4 μmol·L－1Aβ培養48 h后常規培養24 h建立細胞耐受模型；各孔細胞均加入2 μmol·L－1熒光標記Aβ1-42再次處理24 h，對照組加入等體積培養基。24 h后棄去各孔培養基，用PBS小心潤洗后，于倒置熒光顯微鏡下觀察，Image J軟件分析熒光強度。由圖6可見，與對照組比較，模型組細胞胞內綠色熒光減少（P＜0.01）；與模型組比較，LAPs組細胞胞內綠色熒光增多（P＜0.01）；與LAPs組比較，BAY及Rapa組細胞胞內綠色熒光均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 BAY和Rapa對LAPs給藥的BV2細胞吞噬熒光Aβ的影響Fig 6 Effect of BAY and Rapa on the phagocytosis of fluorescent Aβ in BV2 cells administered with LAPs

2.8 統計學分析

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 8.0進行統計分析，實驗數據采用均數±標準差（±s），組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 討論

近年來研究表明，Aβ沉積可誘導小膠質細胞的增殖，使其從靜止態轉變為活化態，最終促使活化的小膠質細胞吞噬Aβ能力增強[12]。活化的小膠質細胞聚集在Aβ周圍，不斷吞噬Aβ斑塊以延緩AD的發生發展[13-14]。但因Aβ具有線粒體毒性，長期的Aβ環境使小膠質細胞線粒體嚴重受損[2，15]，細胞能量代謝障礙，而出現免疫耐受，對Aβ的吞噬能力下降[16]。本文以Aβ慢性處理誘導BV2細胞耐受，結果表明，耐受的BV2細胞雖然仍表現出一定水平的增殖，但其吞噬能力和線粒體膜電位均下降，再次加入Aβ后細胞增殖率明顯降低，提示耐受的BV2細胞功能受損或已發生早期凋亡。經LAPs干預后，耐受的BV2細胞增殖能力、線粒體膜電位水平及吞噬功能均提高，提示LAPs能夠逆轉Aβ誘導的BV2細胞耐受，在一定程度上恢復BV2細胞的吞噬功能。因免疫耐受的小膠質細胞存在PI3K/Akt/mTOR及mTOR/HIF-1α信號通路抑制[2，4]，本研究通過Western blot技術檢測PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路關鍵蛋白的表達情況，并觀察抑制劑BAY和Rapa對LAPs提高BV2吞噬功能的阻斷作用。結果表明，LAPs能顯著提高信號通路關鍵蛋白的表達，Rapa和BAY顯著降低了LAPs的作用，提示激活PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α信號通路是LAPs影響BV2細胞吞噬功能的可能作用機制，但Rapa和BAY的加入均未能完全阻斷LAPs的作用，因此課題組認為LAPs可能存在多個作用靶點，或存在多種作用途徑。

本研究為基于調控小膠質細胞免疫應答反應探討LAPs抗AD的作用機制提供了依據，后續將基于體外實驗開展LAPs抑制AD進程的體內作用與機制研究，以全面闡釋LAPs的抗AD作用。