黃芪甲苷對地塞米松誘導的骨質疏松模型C57BL/6小鼠RAAS系統的影響

柴藝匯 牛建均 田興中 劉春艷 陳云志 吳大梅△

(1.貴州中醫藥大學,貴州 貴陽 550025;2.德江縣民族中醫院,貴州 銅仁 565200;3.張家口市第五醫院,河北 張家口 075000)

近年來,骨質疏松癥(osteoporosis,OP)已經成為全球性的嚴重健康問題,尤其是在老年人中更加普遍。據統計,全球每年骨折約有930萬例,其中約80%以上是由于骨質疏松所致。OP是一種以骨量減少、骨密度下降和骨組織微結構受損為特征的骨骼系統疾病[1]。RAAS系統被認為是影響骨代謝和骨質疏松的潛在因素之一。RAAS系統的過度激活會導致骨質疏松病變,而VD/VDR被證明是RAAS系統調節中的關鍵因素。RAAS系統激活后,其產生的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)可抑制骨再生過程,增加骨吸收活性細胞的形成和功能,導致骨質量下降[2]。RAAS系統的另一個關鍵成分是醛固酮(ALD)。ALD通過Na+/K+轉運蛋白增加腸道和腎臟對鈣的吸收和排泄,還通過增加Na+/H+在骨細胞膜上的轉運和鈉鉀泵的活性,從而抑制骨形成[3]。VD/VDR則是RAAS系統中一個重要的調節因子,VD/VDR能夠降低RAAS系統的活性,從而減輕骨質疏松病變過程[2]。黃芪甲苷(astragaloside IV,AS-IV)為黃芪最主要活性成分之一,具有調節免疫功能、提高機體免疫力和抗氧化等藥理活性。研究表明,黃芪制劑可通過抑制血漿中腎素(Renin)的活性和AngⅡ中介的骨吸收作用,從而增加骨形成率和骨礦密度。黃芪甲苷還可上調VD/VDR表達水平,提高VD/VDR介導的鈣離子信號轉導和骨形成活性[4,5]。VD/VDR調控RAAS系統在骨質疏松癥中的作用和AS-IV在改善骨質疏松癥中的作用機制是當前研究的熱點和難點。通過對VD/VDR和RAAS系統在骨質疏松中的作用機制的分析,以及AS-IV在這個過程中的作用機制的研究,可以增加我們對骨代謝和骨質疏松癥治療的認識,為臨床骨質疏松癥的防治提供新的思路和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料(1)實驗動物:選取30只健康8周齡C57BL/6雄性小鼠,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,生產許可證號:SCXK(京)2019-0010,所有小鼠實驗前均適應性喂養1個月,室溫(25±1)℃、相對濕度(55±5)%,每日12 h光照黑暗交替,自由進食進水,持續干預12周,每周稱量1次體重,根據體重每周調整用藥量。(2)試劑:蘇木素染液(珠海貝索生物技術有限公司,C202101);伊紅染液(珠海貝索生物技術有限公司,C202103);25(OH)D3(武漢基因美生物科技有限公司,GR20221206);AKP測試盒(南京建成生物科技有限公司,20221206);RIPA Lysis Buffer (康為世紀有限公司,CW2333S);蛋白酶抑制劑(康為世紀有限公司,CW2200S);BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀有限公司,CW0014);SDS-PAGE loading buffer(康為世紀公司,CW0027A);SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(康為世紀公司,CW0022);ECL高靈敏度化學發光檢測試劑(康為世紀有限公司,CW0049);ECL低背景學發光檢測試劑盒(康為世紀有限公司,CW0048);山羊抗兔(H+L)HRP(康為世紀有限公司,CW0103S);FGF23 抗體(Bioswamp,PAB34378);VDR 抗體(Bioswamp,PAB37474);ACE 抗體(成都正能,R381341);AngⅡ 抗體(博奧森有限公司,bs-20101R);GAPDH 抗體(abcam,ab181602)(3)儀器:轉輪式切片機(徠卡-2016,德國);自動組織脫水機(武漢俊杰電子有限公司,JT-12S);型包埋機(常州郊區中威電子儀器廠,BMJ-A);正置熒光顯微鏡(德國徠卡,DM500);板式酶標儀(北京新風機電公司,ZS-2);紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司,T6新世紀);臺式高速冷凍離心機(湘儀貝克公司,TGL-20M);超聲波細胞粉碎機(寧波榮順公司,RS-25S);成像系統(德國徠卡);凝膠成像儀(天能,4600SF);電泳儀(BIO-RAD,164-5050);蛋白電泳槽(BIO-RAD,Mini-PROTEAN Tetra);蛋白轉印系統(BIO-RAD,Mini Trans-Blot);Analog 3D Shaker(SCILOGEX,SK-D1807-E)。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模與給藥將30只C57BL/6雄性小鼠隨機分為六組:空白組(生理鹽水),模型組[地塞米松,3 mg/(kg·d),每周2次]、模型組+黃芪甲苷低劑量組[6 mg/(kg·d)]、模型組+黃芪甲苷中劑量組[12 mg/(kg·d)]、模型組+黃芪甲苷高劑量[25 mg/(kg·d)]、模型組+VD 組[0.7 μg/(kg·d),1,25(OH)2D3]。各組均采用灌胃給藥,每周稱量1次體重,根據體重每周調整用藥量。

1.2.2 取材末次給藥后,對小鼠進行斷頭取血,收集小鼠股骨。所取血液靜置30 min后,4 000 rpm 離心10 min,取上層血清。血清樣品保存-80 ℃冰箱,股骨浸泡于4 %多聚甲醛中進行固定。

1.2.3 HE染色取小鼠股骨使用EDTA脫鈣液脫鈣、脫水、透明、浸蠟,包埋后切片,使用蘇木素染液染色5 min,自來水沖洗1～3 min,1%鹽酸酒精脫去細胞質中多余的的蘇木素染色液,伊紅染液染色1 min,自來水沖洗1～3 min,梯度酒精脫水,使用透明二甲苯與中性樹膠封片,并用顯微鏡進行圖像采集。

1.2.4 ELISA法檢測按照ELISA試劑盒說明書,檢測大鼠血清中25(OH)D3、BGP水平,使用酶標儀內的450 nm波長測定板內各孔的OD值,最終計算求得各孔的AKP、25(OH)D3濃度。

1.2.5 Western-blot法檢測取各組小鼠股骨,加入組織蛋白抽提試劑,冰浴勻漿及超聲破碎,冰上孵育20 min后,10 000 rpm離心20 min,收集上清,以BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將制備好的股骨組織蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳,低溫轉膜0.5 h,加入VDR一抗(稀釋比例1∶1 000)、FGF23一抗(稀釋比例1∶1 000)、ACE一抗(稀釋比例1∶500)、AngⅡ一抗(稀釋比例1∶1 000)、GAPDH(稀釋比例1∶10 000)4℃孵育過夜,TBST洗膜,加入山羊抗兔二抗(稀釋比例1∶200),室溫孵育1 h,ECL發光顯影。將膠片進行掃描,分析目的蛋白分子量和凈光密度值。以GAPDH為內參照。用凝膠顯微成像系統進行化學發光顯影成像,利ImageJ 軟件測定目的蛋白條帶灰度值。

2 結 果

2.1 C57BL/6小鼠股骨病理學改變HE染色顯示,正常組小鼠股骨骨皮質光滑,由排列規則的骨板及骨細胞組成,骨小梁粗大飽滿連續,厚度均勻,間隙正常;模型組骨質疏松模型小鼠股骨可見骨皮質變粗糙,破骨細胞增多,伴隨凹坑吸收區域的增大,骨小梁變細,數量減少,間隙增大,見骨髓水腫;與模型組比較,黃芪甲苷高劑量組和陽性對照組小鼠股骨破骨細胞數量明顯減少,骨小梁變細程度輕微,骨小梁數量明顯增多,未見骨髓水腫;黃芪甲苷中、低劑量組小鼠股骨組織病理學改變亦有不同程度改善。見圖1。

注:正常組:Control;模型組:Model;黃芪甲苷高劑量組:AS-IV-H;黃芪甲苷中劑量組:AS-IV-M;黃芪甲苷低劑量組:AS-IV-L;陽性對照組(維生素D)8Vit D。

2.2 小鼠血清中AKP、25(OH)D3水平含量ELISA結果顯示,與正常組比較,模型組C57BL/6小鼠血清AKP、25(OH)D3含量顯著降低(P<0.01);與模型組比較,黃芪甲苷高、中劑量組和維生素D組C57BL/6小鼠血清AKP、25(OH)D3含量顯著升高(P<0.01);黃芪甲苷低劑量組AKP、C57BL/6小鼠血清AKP、25(OH)D3含量亦顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 黃芪甲苷對地塞米松誘導骨質疏松C57BL/6小鼠模型血清25(OH)D3含量的影響

2.3 小鼠股骨中VDR、FGF23、ACE、AngⅡ蛋白表達水平Western-Blot檢測結果顯示,與正常組比較,模型組C57BL/6小鼠股骨細胞中VDR 蛋白相對表達量顯著降低(P<0.01),FGF23、ACE、AngⅡ 蛋白相對表達量顯著升高(P<0.01);與模型組比較,黃芪甲苷高、中劑量組和維生素D組小鼠C57BL/6股骨細胞中VDR 蛋白相對表達量顯著升高(P<0.01),FGF23、ACE、AngⅡ蛋白相對表達量顯著降低(P<0.01)。見表2,圖2。

表2 黃芪甲苷對地塞米松誘導的骨質疏松模型C57BL/6小鼠股骨VDR、FGF23蛋白相對表達量的影響

注:正常組:Control;模型組:Model;黃芪甲苷高劑量組:AS-IV-H;黃芪甲苷中劑量組:AS-IV-M;黃芪甲苷低劑量組:AS-IV-L;陽性對照組(維生素D):Vit D。

3 討 論

OP的發生主要與遺傳、營養、激素代謝、生活方式等有關,臨床表現為全身疼痛、呼吸功能下降,嚴重可導致骨折、脊柱變形等癥狀[6-7]。隨著人口老齡化局勢的加劇,骨質疏松患者逐漸增多,給家庭和社會帶來巨大的醫療負擔[8]。維生素D是一種具有多種生理功能的類固醇激素,也是體內骨代謝的重要調節因子,可通過對成骨細胞的作用影響骨形成[9]。維生素D系統包括維生素D、參與維生素D代謝的酶以及維生素D作用的受體(VDR)[10]。其中,1,25(OH)2D通過提高血鈣濃度,為骨礦化提供必需的原料,從而間接作用于骨形成[11]。維生素D能促進骨鈣鹽的沉積及新骨鈣化,促進骨的吸收[12]。同時與成纖維細胞生長因子23 (FGF-23)形成鈣磷代謝內分泌軸與許多骨代謝疾病密切相關[13]。另外,OP的發生發展與腎素-血管緊張素-醛固酮 (RAAS)系統密切相關,RAAS系統可直接參與骨代謝,介導成骨細胞和破骨細胞增殖、分化、凋亡[14]。實驗[15]顯示,骨組織局部RAAS系統過度激活是OP的重要發生機制之一,可調節成骨細胞和破骨細胞分化和成熟和功能,導致骨量減少及骨吸收增加。同時,RAAS系統的激活后產生的AngⅡ可引起FGF23水平代償性的升高抑制維生素D活化,最終導致體內活性維生素D水平降低[16]。而1,25(OH)2D3可減少AngⅡ的產生,抑制骨組織中局部RAAS活性,并下調破骨細胞的表達,降低骨吸收活性,從而改善骨質疏松的發展[17]。

中醫學并無骨質疏松癥的病名記載,根據臨床特征將其歸為“骨痹”“骨痿”“腰痛”等。《素問·長刺節論篇》記載:“病在骨,骨重不可舉,骨髓酸痛,寒氣至,名骨痹。”《素問·痿論篇》曰:“腎主身之骨髓,腎氣熱,則腰脊不舉,骨枯而髓減,發為骨痿”,認為腎主骨,生髓。《醫經精義》中進一步指出:“腎藏精,精生髓,髓養骨,故骨者,腎之合也”。中醫認為腎虛是骨質疏松的主要發病機制,腎藏精且主骨生髓,髓藏于骨腔滋養骨骼,骨的生長發育依賴于腎中精氣的滋養與溫煦,腎為先天之本,腎精充足,骨有滋養而強健有力,腎精虧虛,骨失充養則骨骼脆弱無力[18]。骨質疏松的發生與腎虛、脾虛、血瘀等原因密切相關,因此,治療應以補腎、健脾和活血化瘀為基本法則。研究[19]表明,黃芪及其成分可通過VD/VDR對FGF23-Klotho 軸的調控作用,改善衰老骨髓間充質干細胞活力和骨形成,從而防治骨質疏松癥。本研究結果顯示,AS-IV可顯著改善骨質疏松模型C57BL/6小鼠股骨病理學改變及損傷;升高小鼠血清AKP、25(OH)D3含量;升高小鼠股骨VDR蛋白表達,降低FGF23、ACE、AngⅡ蛋白表達量,表明AS-IV防治地塞米松誘導的C57BL/6J小鼠骨質疏松,可通過對維生素D的調節,從而調控FGF23、ACE、AngⅡ蛋白的表達。

利益沖突說明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通過貴州中醫藥大學實驗動物倫理審查委員會審查(科學倫理委員會)批準。