PGE2在環(huán)氧合酶-2抑制劑保護(hù)膿毒癥腸屏障功能中的作用

劉志慧 張桂利△ 王燕燕 盧鼎 李淑凡 張存宇 王姣姣 張子怡

(1.包頭市中心醫(yī)院麻醉科,內(nèi)蒙古 包頭 014040;2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014040;3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué),內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100)

前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)是花生四烯酸在磷脂酶A2、環(huán)氧酶(COX)和PGE2合酶(PGES)的順序催化作用下產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,可由多種細(xì)胞合成。PGE2是重要的前列腺素類物質(zhì),是膿毒癥誘導(dǎo)的免疫抑制的調(diào)節(jié)劑,是單核細(xì)胞促炎因子表達(dá)的抑制劑,是IL-10產(chǎn)生的誘導(dǎo)劑[1-2]。分布在小腸的主要是前列腺素E2,正常情況下,產(chǎn)生生理需要量的低水平前列腺素,可調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)、腸分泌、細(xì)胞遷移和血管平滑肌的張力,抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá),維持腸屏障功能和腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[3]。炎癥時(shí),COX-2轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的前列腺素調(diào)節(jié)先天性免疫和適應(yīng)性免疫[4]。COX-2的高表達(dá)是炎癥性腸病[5-6]、壞死性小腸結(jié)腸炎[7]時(shí)導(dǎo)致腸屏障功能障礙的關(guān)鍵因素。有研究表明COX-2抑制劑對(duì)腸黏膜屏障具有保護(hù)作用[8-11]。精確地調(diào)控體內(nèi)PGE2的合成和分解代謝,可明顯改善膿毒癥腸屏障功能,阻止PGE2介導(dǎo)的某些不利的細(xì)胞和生物學(xué)效應(yīng),可以明顯提高生存率。因此,PGE2的調(diào)控可能是今后膿毒癥治療的一個(gè)重要手段。本實(shí)驗(yàn)擬利用CLP膿毒癥大鼠模型探討PGE2在環(huán)氧合酶-2抑制劑保護(hù)膿毒癥腸屏障功能中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組健康雄性Wistar大鼠(清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物),18～20月齡,體重550～650 g,由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK-(軍)2012-0004。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為六組,假手術(shù)組、帕瑞昔布鈉對(duì)照組、膿毒癥組、帕瑞昔布鈉治療組、COX-2抑制劑組和帕瑞昔布鈉-COX-2抑制劑組,每組8只。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn),動(dòng)物處置過程符合倫理學(xué)要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膿毒癥模型制備采用盲腸結(jié)扎穿孔法(cecal ligation and puncture,CLP)建立大鼠膿毒癥模型[12,13]。假手術(shù)組和帕瑞昔布鈉對(duì)照組進(jìn)行相同的操作,不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔。各組大鼠術(shù)后經(jīng)頸部皮下注射0.9%無菌生理鹽水3 mL/100 g(37 ℃)進(jìn)行液體復(fù)蘇治療,模型建立成功后20 min,經(jīng)大鼠腹腔注射帕瑞昔布鈉10 mg/kg,假手術(shù)組和膿毒癥組均給等量的生理鹽水,每隔12 h注射1次。COX-2抑制劑組和帕瑞昔布鈉-COX-2抑制劑組于術(shù)前2 h腹腔注射NS-398 10 mg/kg。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法(1)ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎性因子水平:各組大鼠腸組織勻漿后,于4℃離心15 min取上清液,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukins,IL-6、IL-10)的水平。(2)蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn):(Western Blot)檢測(cè)前列腺素E2(PGE2)、前列腺素合酶-1(mPGES-1)和前列腺素受體EP4的蛋白表達(dá),取腸組織總蛋白和膜蛋白后進(jìn)行定量,經(jīng)凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移蛋白到聚偏二氟乙烯膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h。磷酸鹽緩沖液洗滌后分別加入抗NLRP3、SIRT 一抗,4 ℃搖床過夜;加入二抗室溫避光孵育2 h,化學(xué)發(fā)光法顯影,以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參。采用Image Lab軟件分析各條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為目的蛋白表達(dá)量。(3)實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR):于假手術(shù)或CLP術(shù)后24 h取四組大鼠腸組織,采用RT-PCR法檢測(cè)PGE2、mPGES-1、EP4的mRNA表達(dá)水平。在腸組織中放入1 mL Trizol 液,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。所有反應(yīng)嚴(yán)格按照反應(yīng)的條件進(jìn)行擴(kuò)增,內(nèi)參采用GAPDH。反應(yīng)程序如下:預(yù)變性95 ℃、2 min,變95 ℃、10 s,退火 60 ℃、30 s,延伸72 ℃、45 s。共計(jì)40個(gè)循環(huán)。取循環(huán)閾值(Ct),并采用2-△△CT進(jìn)行分析。見表1。

2 結(jié) 果

2.1 炎癥細(xì)胞因子水平膿毒癥大鼠血清和腸組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6水平和抗炎細(xì)胞因子IL-10水平明顯增加(P<0.05),帕瑞昔布鈉治療后能夠明顯降低TNF-α、IL-6水平(P<0.05),而進(jìn)一步增加IL-10水平(P<0.05)。見表2～4。

表2 各組大鼠血清和腸組織中TNF-α水平比較

表3 各組大鼠血清和腸組織中IL-6水平比較

表4 各組大鼠血清和腸組織中IL-10水平比較

2.2 PGE2、mPGES-1、EP4和EP2的mRNA的表達(dá)術(shù)后24 h時(shí),膿毒癥組大鼠腸組織PGE2、mPGES-1、EP4和EP2 mRNA表達(dá)水平比假手術(shù)組明顯升高(P<0.05);與CLP組相比,帕瑞昔布鈉治療膿毒癥大鼠后,腸組織PGE2、mPGES-1、EP4的mRNA水平明顯降低(P<0.05),而EP2 mRNA的表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)。見表5。

表5 PGE2 mRNA、mPGES-1 mRNA、EP4和EP2 mRNA 的表達(dá)

2.3 PGE2、mPGES-1和EP4的蛋白表達(dá)術(shù)后24 h時(shí),膿毒癥組大鼠腸組織PGE2、mPGES-1和EP4的蛋白表達(dá)水平比假手術(shù)組明顯升高(P<0.05);帕瑞昔布鈉治療膿毒癥大鼠后,PGE2、mPGES-1和EP4的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)(見圖1)。

注:PGE2為前列腺素E2,mPGES-1為前列腺素合酶-1,EP4為前列腺素受體,β-actin為β-肌動(dòng)蛋白。

2.4 帕瑞昔布鈉對(duì)膿毒癥大鼠腸組織炎癥水平的影響術(shù)后24 h時(shí),與假手術(shù)組相比,膿毒癥組、帕瑞昔布鈉治療組、COX-2抑制劑組及帕瑞昔布鈉-COX-2抑制劑組腸組織TNF-α、IL-10和IL-6的水平均明顯升高(P<0.05);與膿毒癥組相比,帕瑞昔布鈉治療組、COX-2抑制劑組及帕瑞昔布鈉-COX-2抑制劑組腸組織TNF-α、IL-6的水平明顯降低,IL-10的水平均明顯升高(P<0.05);與帕瑞昔布鈉治療組相比,COX-2抑制劑組及帕瑞昔布鈉-COX-2抑制劑組腸組織TNF-α、IL-6的水平降低,IL-10的水平明顯升高(P<0.05)。見表6。

表6 各組大鼠腸組織中TNF-α、IL-6 and IL-10水平比較

3 討 論

膿毒癥早期,炎癥反應(yīng)即出現(xiàn)失控,機(jī)體產(chǎn)生大量的多種促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-2等。炎癥反應(yīng)盡管有利于機(jī)體清除細(xì)菌和利于組織修復(fù),但過度的炎癥反應(yīng)可加重組織的損傷,導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)、甚至多器官功能不全(MODS)和多器官功能衰竭(MOF),甚至死亡[14]。同時(shí),機(jī)體也產(chǎn)生多種抗炎介質(zhì)如IL-10、TGF-β等,以維持機(jī)體免疫反應(yīng)的平衡,誘發(fā)代償性抗炎反應(yīng)綜合征(CARS)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,帕瑞昔布鈉可明顯降低膿毒癥大鼠腸組織促炎因子(TNF-α和IL-6)和提高抗炎因子(IL-10)的水平,給予COX-2抑制劑(NS-398)預(yù)處理后,帕瑞昔布鈉的抗炎作用增強(qiáng),表明帕瑞昔布鈉通過抑制膿毒癥的炎癥反應(yīng)減輕腸組織的損傷。

PGE2通過7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)前列腺素受體作用而參與多種病理生理過程,PGE2受體(E-prostanoid receptor,EPs)可分為四種亞型:EP1、EP2、EP3和EP4,Y.Sugimoto等[22]研究最早提出在體內(nèi)分布最廣的是EP3和EP4,且對(duì)PGE2的親和力比EP1和EP2高。研究表明,NS-398抑制PGE2的合成,使EP4的表達(dá)下降,抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α,但同時(shí)也刺激IL-10的表達(dá)[23]。有研究表明PGE2可通過COX-2的表達(dá)活性的上調(diào)而增加自身的合成,表明機(jī)體在控制PGE2的合成方面存在正反饋的調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究顯示,在膿毒癥大鼠的腸組織中EP4的表達(dá)明顯上調(diào),帕瑞昔布鈉治療后腸組織EP4的表達(dá)明顯降低,可能帕瑞昔布鈉抑制mPGES-1而降低PGE2的合成而使EP4的表達(dá)下降。

本研究發(fā)現(xiàn)帕瑞昔布鈉可降低膿毒癥大鼠TNF-α和IL-6的水平,同時(shí)刺激IL-10的水平升高,而且給予COX-2抑制劑后,帕瑞昔布鈉的抗炎作用明顯增強(qiáng)。帕瑞昔布鈉治療還可以明顯下調(diào)膿毒癥大鼠腸組織的PGE2、mPGES-1及EP4的表達(dá),該結(jié)果表明帕瑞昔布鈉可能通過COX-2-mPGES-1-PGE2-EP4通路發(fā)揮抗炎的作用,減輕由于炎癥因子釋放而引起的腸屏障功能的損傷。因此,精確地調(diào)控體內(nèi)PGE2的合成和分解代謝,可明顯改善膿毒癥腸屏障功能,阻止PGE2介導(dǎo)的某些不利的細(xì)胞和生物學(xué)效應(yīng),可提高生存率。因此,PGE2的調(diào)控可能是今后膿毒癥治療的一個(gè)重要靶點(diǎn),同時(shí),帕瑞昔布鈉可能是改善膿毒癥腸屏障功能的一種可靠、有效的治療措施。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)帕瑞昔布鈉可通過抑制炎癥反應(yīng)來減輕膿毒癥時(shí)腸屏障功能的損傷,明顯提高膿毒癥動(dòng)物的存活率,其機(jī)制可能通過COX-2-mPGES-1-PGE2-EP4通路發(fā)揮抗炎的作用。

利益沖突說明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準(zhǔn)及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通過包頭市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。