不同采烤方式上部煙葉外觀質量及抗氧化特性分析

劉峰峰，孟 霖，何結望，周迎輝，石 剛，彭五星，乾 艷，楊秀軍*，孫福山

1.湖北中煙工業有限責任公司，武漢市東西湖區海口二路2 號 430062 2.中國農業科學院煙草研究所，山東省青島市嶗山區科苑經四路11 號 266000 3.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北省恩施州宣恩縣建設路36 號 445500

目前，我國上部煙葉存在色深僵厚、化學成分不協調、工業可用性較低等問題。已有研究發現，帶莖采烤上部煙葉外觀顏色淺橘黃、成熟度高、結構疏松、身份適中、色度鮮亮，常規化學成分協調，感官質量好，可用性高［1-4］。煙葉烘烤過程實質上是采收后的煙葉離開煙株母體處于饑餓代謝狀態［5］，在烤房中通過調控環境溫濕度等手段，促使煙葉外觀變黃失水，煙葉內部發生必要的生理生化變化，進而逐步實現煙葉干制的過程。在此過程中，煙葉代謝活動的能量主要來源于呼吸作用。而帶莖采烤上部煙葉時，莖稈中的水分和無機鹽離子等可向煙葉中移動，使之處于一種半饑餓代謝狀態。帶莖采烤上部煙葉品質形成機理與常規逐葉采烤煙葉存在一定差異。余金恒等［6］研究發現，在定色前期及其后的烘烤階段，帶莖采烤上部煙葉的淀粉酶、轉化酶活性高于常規采烤和一次逐葉采烤的煙葉，有利于煙葉中大分子物質向小分子物質的轉化，以及煙葉化學成分比例的協調。馬留軍等［7］研究認為，帶莖采烤上部煙葉在烘烤過程中失水較難，但色素降解速率高于常規逐葉采烤煙葉；王曉賓等［8］研究表明，帶莖采烤上部煙葉總氮含量變化不大，硝酸鹽和亞硝酸含量呈先升高后下降的趨勢，鉀含量比逐葉采烤煙葉稍有增加；魏碩等［9］、滕永忠等［10］、蔣博文等［11］研究均證實了帶莖采烤上部煙葉莖稈中水分存在經葉脈向葉片中轉移的現象。目前，帶莖采烤對上部煙葉烘烤過程生理生化特性的影響研究多集中在水分遷移、色素含量、主要化學成分含量、烤后煙葉質量及效益等方面，而有關抗氧化生理生化方面的研究卻鮮見報道。為此，分析了帶莖采烤上部煙葉外觀質量特點、圖像特征以及烘烤過程中煙葉組織結構、活性氧、抗氧化關鍵酶活性等的變化，旨在為提高上部煙葉可用性提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年度在湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣椒園煙站進行。供試品種為云煙87，選取標準化生產煙田的烤煙上部5片煙葉（從上至下數），待煙葉充分成熟時采收，采用氣流上升式密集烤房烘烤，以上部煙葉第3葉位為研究材料。

1.2 試驗設計

設置兩個處理，①帶莖采烤：采收時上部5 片煙葉連同莖稈一起砍下，掛在煙竿上，每竿30株；②逐葉采烤：作為對照，依次采收上部5片煙葉，按葉位標記編竿，每竿150片。

每個處理3竿，重復3次，均裝在密集烤房2層，并設置取樣窗。按當地推薦的密集烘烤工藝進行烘烤，在鮮煙葉和烘烤階段干球溫度關鍵穩溫點末（即變黃階段的38 ℃末、40 ℃末、42 ℃末，定色階段的46 ℃末、50 ℃末、54 ℃末，干筋階段的68 ℃末），每個處理取上部煙第3葉位的煙葉9片，在烤房內將葉片去除主脈后置于離心管內，并迅速放入液氮中保存，用于煙葉組織結構觀察和相關酶活性（50 ℃以上煙葉細胞已消融，呼吸代謝停止，未檢測酶活性）測定。烤后每個處理每次重復分別取上部煙第3葉位的煙葉10 片，進行外觀質量評價和顏色亮度值（L*）、紅綠值（a*）、黃藍值（b*）測定。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 外觀質量評價

由中國農業科學院煙草研究所5 名煙葉分級高級技師以上專家，對煙葉外觀質量顏色、成熟度、結構、身份、油分、色度6個因素的評價檔次進行賦分，見表1。

表1 烤后煙葉外觀質量指標的評價賦分Tab.1 Appearance quality scoring criteria of cured tobacco leaves

1.3.2 煙葉顏色特征值測定

采用相機尼康D6500［尼康光學儀器（中國）有限公司］拍照煙葉正面，在暗箱中標準光源下，成像高度100 cm，采用Matlab 2019進行圖像處理，計算提取煙葉的黃色面積百分比，L*、a*和b*值。其中，L*越大亮度越高；a*從負數變為正數，對應顏色從綠色變為紅色，b*從負數變為正數，對應顏色從藍色變為黃色。

1.3.3 組織結構

在各關鍵溫度點分別取兩處理上部煙葉第3 葉位各1 片，取葉片中部主脈兩側5 cm 對稱0.5 cm×0.5 cm 正方形小塊，立即置于FAA 固定液中固定24 h，采用番紅-固綠染色制作常規石蠟切片，具體操作參考文獻［12］進行。

1.3.4 酶活性與相關物質測定

采用微量法用酶活性專用試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）測定酶活性及相關物質含量（質量分數）。從超低溫冰箱（-80 ℃）取出整片煙葉樣品，置于低溫研磨機中磨粉，根據說明書進行測定。采用NBT 法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性［13］；采用愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性［13］；采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）活性和丙二醛（MDA）含量［14］；采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定膜脂過氧化物（LPO）含量［15］；采用鄰苯三酚法測定超氧陰離子（O2-·）產生速率［14］；采用間苯二酚（PAR）比色法測定過氧化氫（H2O2）含量［15］；采用FRAP 法測定總抗氧化能力（T-AOC）［16］。

1.3.5 數據處理

采用SAS 9.4軟件進行單因素方差分析，采用新復極差法（SSR）進行差異顯著性檢驗。采用Excel 2020軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 不同采烤方式烤后上部煙葉外觀質量與圖像特征比較

由表2可知，兩種采烤方式外觀質量總分存在顯著差異，帶莖采烤的烤后煙葉外觀質量總分為8.13分，顯著高于逐葉采烤煙葉，主要表現在煙葉顏色、結構和身份得分較高。其中，結構和身份得分差異達到顯著水平。

表3 表明，與逐葉采烤相比，帶莖采烤煙葉黃色面積百分比、L*值和b*值均較高，說明帶莖采烤煙葉黃色面積較多、均勻，顏色較鮮亮。而a*值較低，說明帶莖采烤煙葉紅色較少。

表3 不同采烤方式上部煙葉的顏色特征值Tab.3 Color characteristic values of upper tobacco leaves harvested and cured by different methods

2.2 不同采烤方式上部煙葉烘烤過程中葉片組織結構的變化

由圖1 可知，隨著烘烤階段的推進，煙葉組織細胞形態由完整逐漸消融、皺縮，破壞程度逐漸增大，帶莖采烤煙葉組織細胞形態消融、皺縮和被破壞程度滯后逐葉采烤的煙葉。

圖1 不同采烤方式上部煙葉烘烤過程中煙葉組織結構Fig.1 Microstructure of upper tobacco leaves harvested and cured by different methods during curing progress

在變黃階段干球溫度關鍵穩溫點38 ℃末，兩處理煙葉組織細胞排列及形態基本無差異；在變黃階段40 ℃末，兩處理煙葉柵欄組織和海綿組織均出現略微的皺縮，開始出現差異。帶莖采烤煙葉細胞液未滲出，而逐葉采烤煙葉則開始出現細胞液外滲，說明變黃階段40 ℃末帶莖采烤煙葉細胞膜結構仍保持完整，而逐葉采烤的細胞膜開始被破壞。在變黃階段42 ℃末，帶莖采烤煙葉組織細胞液開始出現外滲，而逐葉采烤煙葉組織細胞膜明顯破損，細胞液明顯滲外。

在定色階段干球溫度關鍵穩溫點46 ℃末，帶莖采烤煙葉組織細胞膜結構出現破損，但仍具備細胞形態，而逐葉采烤煙葉部分組織細胞形態開始瓦解，出現多個細胞粘連，細胞邊界不清晰；在定色階段50 ℃末，帶莖采烤煙葉組織細胞出現消融，部分不完整，逐葉采烤煙葉組織細胞結構皺縮，無法分辨，此時煙葉組織細胞遭到破壞，說明葉片失去生理活性。定色階段54 ℃末，帶莖采烤煙葉組織明顯皺縮，細胞消融較明顯，仍可觀察到細胞核及部分細胞器，逐葉采烤煙葉組織明顯皺縮，細胞消融明顯，無法觀察到細胞器結構。

在干筋階段干球溫度關鍵穩溫點68 ℃末，帶莖采烤煙葉組織細胞多皺縮在一起，但仍能觀察到組織細胞排列狀態，而逐葉采烤煙葉組織細胞則散亂分布。

總體而言，烘烤過程中葉片組織細胞呈現出逐步消融、皺縮、失活、干燥，在定色階段50 ℃末時煙葉組織細胞失去完整性和生理活性，而帶莖采烤煙葉組織細胞完整性較好，消融破壞程度相對滯后。

2.3 不同采烤方式上部煙葉烘烤過程中細胞膜脂質過氧化物和活性氧（ROS）的變化

圖2 顯示，隨著烘烤階段的推進，煙葉細胞膜脂質過氧化物（LPO）、丙二醛（MDA）含量總體均呈現升高趨勢，在關鍵穩溫點定色階段46 ℃末均達到最高。但兩種采烤方式存在一定差異。在烘烤干球溫度關鍵穩溫點，與逐葉采烤相比，在變黃階段38 ℃末時，帶莖采烤煙葉LPO、MDA含量均較高，在變黃階段40 ℃末、變黃階段42 ℃末、定色階段46 ℃末時均顯著較低，且在轉入定色階段關鍵穩溫點46 ℃末時，帶莖采烤的LPO 和MDA 含量分別降低21.02%和32.01%。說明在烘烤中帶莖采烤煙葉細胞膜脂過氧化水平較低，有利于較長時間地維持細胞完整性。

圖2 不同采烤方式上部煙葉烘烤過程中LPO、MDA和ROS的變化Fig.2 Variations of LPO，MDA and ROS of upper tobacco leaves harvested and cured by different methods during curing progress

H2O2和超O2-·是活性氧的重要組成，隨著烘烤進程的推進，煙葉H2O2含量、O2-·產生速率總體均呈逐漸升高趨勢。與逐葉采烤相比，在變黃階段關鍵穩溫點38 ℃末、40 ℃末、42 ℃末時，帶莖采烤煙葉H2O2含量和O2-·產生速率均較低，且除在變黃階段38 ℃末時O2-·產生速率差異不顯著，其他差異均達到顯著水平，這與上述膜脂質過氧化物含量的動態變化一致；而在轉入定色階段關鍵穩溫點46 ℃末時，帶莖采烤煙葉H2O2含量和O2-·產生速率均顯著提高，分別提高28.77%和40.26%。這一發現與MDA和LPO 含量變化趨勢相反，說明轉入定色階段后帶莖采烤煙葉清除活性氧能力減弱或滯后，造成活性氧的積累。

2.4 不同采烤方式上部煙葉烘烤過程中抗氧化酶活性的變化

圖3 所示，隨著烘烤階段的推進，兩處理煙葉SOD 活性變化規律整體表現不同。其中，帶莖采烤的呈先下降再上升又快速下降的趨勢，而逐葉采烤的則一直呈下降趨勢，兩處理在轉入定色階段關鍵穩溫點46 ℃末時降低到同一水平。在變黃階段關鍵穩溫點除38 ℃末時，帶莖采烤煙葉SOD活性顯著低于逐葉采烤的，變黃階段40 ℃末和42 ℃末時，帶莖采烤煙葉SOD 活性均顯著高于逐葉采烤的，分別提高32.54%和46.61%。

圖3 不同采烤方式上部煙葉烘烤過程中抗氧化酶活性的變化Fig.3 Variations of antioxidant enzyme activities of upper tobacco leaves harvested and cured by different methods during curing progress

兩處理煙葉CAT活性總體呈現先升高再降低的變化趨勢。帶莖采烤煙葉在變黃階段關鍵穩溫點40 ℃末時達到高峰，為382.90 U/g，且比逐葉采烤提高27.82%；逐葉采烤的在變黃階段42 ℃末時達到高峰，為373.46 U/g，且顯著高出帶莖采烤17.27%，在定色階段關鍵穩溫點46 ℃末時達到最低，且顯著低于帶莖采烤26.63%。

隨著烘烤階段的推進，帶莖采烤煙葉GR 活性呈現逐步升高又降低趨勢，在變黃階段關鍵穩溫點42 ℃末時達到高峰，而逐葉采烤的GR 活性呈慢-快-慢升高趨勢，在定色階段關鍵穩溫點46 ℃末時達到最高。在變黃階段關鍵穩溫點38 ℃末、40 ℃末、42 ℃末時，帶莖采烤煙葉GR 活性均顯著高于逐葉采烤煙葉，在轉入定色階段關鍵穩溫點46 ℃末時，低于逐葉采烤45.49%，此時兩處理差異最大。這一變化趨勢與H2O2含量和O2-·產生速率恰好相反，意味著GR 可能在H2O2和O2-·的清除中發揮關鍵作用。

隨著烘烤階段的推進，兩處理煙葉T-AOC 總體呈逐步上升趨勢。與逐葉采烤相比，帶莖采烤煙葉抗氧化酶活性總體較高，且在烘烤關鍵穩溫點變黃階段40 ℃末、定色階段46 ℃末差異達到顯著水平，說明帶莖采烤煙葉抗氧化能力較強。

3 討論

烤煙上部煙帶莖采烤和逐葉采烤處理烤后煙葉外觀質量特征和圖像特征分析表明，上部煙帶莖采烤煙葉外觀質量好于逐葉采烤，帶莖采烤煙葉圖像特征L*值、b*值均高于逐葉采烤，這與已有研究報道結果一致［4，17-18］。在煙葉烘烤過程中，葉片組織細胞逐步消融、失活和干燥，在定色階段50 ℃末，帶莖采烤煙葉片組織細胞出現消融、部分不完整，這有利于葉片組織細胞完整性保持較長時間，細胞膜結構破壞滯后。這與劉朝營等［19］研究結果基本一致，進一步驗證了上部煙帶莖采烤中煙葉細胞抗氧化能力較強，有利于保持葉片組織細胞生理活性［9-11］。

植物葉片中參與氧化、抗氧化活動的酶類較多，煙草上SOD、CAT 和GR 3 種抗氧化酶研究較多［20-22］。其中，SOD廣泛存在于動物、植物和微生物中，且是體內清除活性氧的第一防線，可催化超氧化物的歧化反應，在逆境脅迫條件下增強植物的耐受能力［23］。本研究中的SOD 活性變化趨勢與Siddiqui等［24］對大豆高溫脅迫下的研究結果一致，在大豆中研究發現輕度高溫脅迫下葉片SOD 活性增強，但不同品種對脅迫的響應不一致。持續高溫下SOD出現持續下降的現象，原因在于高溫破壞了SOD 的構象。在干旱、光照、重金屬及高滲透壓等逆境條件下，植物體內CAT 的表達量及活性都有所提高［25］，說明CAT在植物抗逆方面發揮著重要作用。而煙葉烘烤也是在人為提供較高溫度的脅迫條件下進行的，本研究中帶莖采烤煙葉3種抗氧化酶活性在變黃階段總體高于逐葉采烤且差異達到顯著水平。MDA是一類重要的LPO，其含量常被用來評價細胞的消融破裂程度［26］。本研究中發現帶莖采烤煙葉MDA 和LPO 含量始終低于逐葉采烤，H2O2和O2-·兩種重要的活性氧成分含量和產生速率與膜脂過氧化狀態密切相關，高濃度的活性氧會導致細胞膜過氧化，促進MDA 的積累，過高會導致細胞死亡［27］。本研究中還發現帶莖采烤定色階段46 ℃末H2O2含量和O2-·產生速率均高于逐葉采烤，且GR 活性高低變化趨勢與H2O2含量、O2-·產生速率相反，說明GR 是影響H2O2和O2-·清除的關鍵酶之一，深入研究煙葉烘烤中活性氧和酶活性有利于探明煙葉烘烤中品質形成的代謝生理基礎。

4 結論

上部煙帶莖采烤和逐葉采烤煙葉外觀質量以及烘烤中葉組織細胞結構和抗氧化能力存在差異。與逐葉采烤相比，帶莖采烤煙葉外觀質量較好，顏色黃色面積、L*值和b*值較高；在烘烤過程中煙葉細胞結構完整性維持時間較長。在變黃階段煙葉抗氧化酶活性較高，活性氧清除能力較強，細胞過氧化程度較低，有利于保持煙葉細胞生理活性，促進物質轉化，煙葉顏色變淺，上部煙葉的可用性得到改善。