秀麗隱桿線蟲在帕金森病研究中的應用*

楊玉潔 綜述,李 頔 審校

(重慶醫科大學附屬第二醫院藥學部,重慶 400010)

帕金森病(PD)是一種以平衡能力受損、運動遲緩、僵硬和存在靜息性震顫為特征的神經運動障礙疾病,是繼阿爾茨海默病之后第二常見的神經退行性疾病。PD主要病理改變為中腦黑質致密部多巴胺神經元進行性變性缺失,殘存的神經元細胞質內路易小體形成,主要成分為α-突觸核蛋白(α-syn)、泛素等[1],但PD是一種由多因素導致的疾病,其確切的病理機制還未闡明。

動物模型是研究疾病機制和藥物篩選的重要載體,穩定的動物模型有利于闡明疾病的病因、分子機制及治療藥物評價。秀麗隱桿線蟲(以下簡稱線蟲)因其神經系統結構簡單、蟲體透明易觀察、生命周期短等優勢在PD研究中得到廣泛應用。現將線蟲用于PD 研究中優勢,以及基于線蟲模型的基礎研究歸納如下,旨在為防治PD提供文獻參考。

1 線蟲模型用于PD研究的生理優勢

SYDNEY BRENNER 最早發現線蟲,并首次將其作為動物模型用于遺傳基礎研究,證明了線蟲是一種非常有價值的模式動物[2]。線蟲與人類的同源物和旁系同源基因包括7 943個基因,相同的蛋白質編碼基因組超過41%。此外線蟲3 357個基因與《在線人類孟德爾遺傳數據庫》注釋的人類基因具有同源性,占線蟲基因組的17%[3],且線蟲的基因組是第一個被完全測序的多細胞生物的基因組。

與其他PD動物模型比較,線蟲具有許多更適于遺傳和發育研究的生物學待性:(1)哺乳動物的神經系統由數十億個神經元組成,而成年線蟲全身只有302個神經元,約1 000個體細胞,大大降低了復雜性,提高了神經元分析的準確性。線蟲的生理功能齊全,包括神經感觸、肌肉運動、消化排泄和生殖等組織系統。(2)線蟲通體透明,通過在活體中表達熒光蛋白,很容易看到神經元,可研究整個發育過程中的神經元變化,這是線蟲優于其他動物模型的關鍵點[3]。(3)易于人工培養。線蟲雌雄同體,自體繁殖,生命周期短,大大縮短了研究周期,研究成本較低。其可在-80 ℃液氮中保存數十年,可像培養細胞那樣無限制地獲得線蟲[4]。(4)最大優勢之一是易于基因操作,通過微注射或微粒子轟擊可在不到1個月的時間內產生轉基因線蟲。(5)線蟲包含多種神經遞質,17個信號傳導通路中有12個通路(包括胰島素信號轉導通路、p38促分裂原活化蛋白激酶信號傳導通路和轉化生長因子-β信號傳導通路等)在線蟲中是保守的[5]。基于以上的特點,線蟲成為神經退行性疾病研究中一種很好的模式生物,對PD藥物靶點的發現與確證,以及新的治療藥物研究均具有重要貢獻。

2 線蟲模型在PD研究中的應用

在PD研究方面,相比含有上萬個多巴胺能神經元的脊椎動物,線蟲僅有8個映射良好的多巴胺能神經元,包括兩對頭側神經元、頭部一對前頸咽神經元和尾部一對后頸咽神經元,這便于觀察神經元的變化[6]。此外其與許多PD相關的基因均具有同源性,如LRRK2/lrk-1、PINK1/pink-1、PRKN/pdr-1、DJ-1/djr-1.1/djr-1.2和ATP13A2/catp-6[7]。因此,線蟲成為研究PD的良好模型。

2.1常見的線蟲PD模型

2.1.16-羥多巴胺(6-OHDA)誘導的線蟲模型 2020年TSAI等[8]將線蟲暴露于6-OHDA中,6-OHDA誘致線蟲對食物的感知行為變慢,體內氧化應激水平增強,超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶水平降低,丙二醛升高,誘導線蟲線粒體DNA損傷,導致線蟲多巴胺能神經元退化,致其壽命變短。CHALORAK等[9]研究表明,6-OHDA會逐漸損傷線蟲的頭側神經元和前頸咽神經元的細胞體,使多巴胺神經退行性變,導致食物感知和乙醇回避行為缺陷,縮短壽命。此外分子信號分析表明,6-OHDA暴露可增加凋亡通路中egl-1、ced-3基因的表達,也可顯著降低磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白生存通路,抑制壽命相關基因——age-1、let-363、pdk-1、akt-1、akt-2的表達。BRAUNGART等[10]將1-甲基-4-苯基-四氫吡啶(MPTP)用于線蟲模型并模擬出與人相似的PD癥狀,340～1 000 μmol/L的MPTP就可導致線蟲移動缺陷,如緩慢、不均勻的運動伴有抽搐和卷曲。線蟲攝取MPTP的機制與脊椎動物相似,均是通過單胺轉運體主動轉運到多巴胺能神經元中,破壞線粒體呼吸鏈。之后的研究表明,MPTP可進入大腦,并在單胺氧化酶介導下在膠質細胞中迅速轉化為有毒代謝物——1-甲基-4-苯基吡啶,使腺苷三磷酸水平降低、自由基增加,選擇性地破壞多巴胺能神經元[11]。 CHEN 等[12]用6-OHDA處理的HT22細胞和BZ555線蟲為模型,高良姜素處理后可通過激活Nrf2/Keap1信號通路,抑制6-OHDA誘導的線蟲多巴胺神經退行性變,顯著降低線蟲活性氧水平。此外,黃芩苷可有效地增加6-OHDA處理的線蟲Bcl-2的表達,降低caspase-3水平,有效逆轉ced-9(哺乳動物Bcl-2的同源物)表達的下降和ced-3(哺乳動物caspase-3的同源物)表達的增加[13]。有研究表明,額葉苷A和人參皂苷Rg3這2種天然皂苷均可顯著改善6-OHDA誘導線蟲的多巴胺神經退行性變,延長線蟲壽命,下調凋亡介質——egl-1和ced-3,上調sod-3和cat-2的表達,表明二者通過抑制凋亡介質和刺激抗氧化酶恢復PD線蟲模型的多巴胺神經元活力發揮神經保護作用,且只有額葉苷A可通過上調ubh-4、hsf-1、hsp-16.1、hsp-16.2的表達降解轉基因線蟲的α-syn表達,所以,額葉苷A可能是一種很有前途的PD的治療藥物[14]。

2.1.2魚藤酮誘導的線蟲模型 魚藤酮是一種天然的化合物,是一種常見的殺蟲劑,來源于百合、金銀花和杜鵑植物的根和莖,可抑制線粒體復合體Ⅰ的電子傳遞鏈,易透過血腦屏障,不需要任何轉運體進入多巴胺能神經元,還能誘導體內α-Syn聚集。魚藤酮會導致線蟲的線粒體未折疊蛋白反應激活,誘導線蟲線粒體損傷,破壞線粒體穩態,進而導致多巴胺能神經元退化及線蟲死亡,并且呈一定的濃度依賴性[15]。魚藤酮是常用的PD線蟲模型誘導物,會導致線蟲的頭部擺動頻率、身體彎曲頻率和覓食行為發生異常[16],常見于PD研究中。最新研究表明,魚藤酮暴露能誘導線蟲線粒體外膜通道蛋白外膜轉運酶7,以及內膜呼吸鏈酶復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的表達水平顯著降低,還可導致自噬相關絲氨酸/蘇氨酸激酶活性蛋白PINK1的表達明顯增加。表明線粒體相關膜蛋白與PD的神經毒性具有密切聯系,為進一步探索PD的環境病因提供了支持,也為防治PD提供了重要依據[17]。

2.1.3錳誘導的線蟲模型 錳的過量沉積會降低星形膠質細胞中谷氨酸轉運體蛋白的表達和谷氨酸攝取,導致細胞外谷氨酸水平增加,增強谷氨酸受體的敏感性,從而導致線粒體功能障礙、氧化應激和最終的多巴胺能神經元丟失,出現神經系統功能障礙和錐體外系運動障礙[18-19]。已有研究證明,在線蟲的生長培養基中補充適量錳可增加其平均壽命和生育能力,并增強其抗熱應激性[20],但大量錳會誘導線蟲體內活性氧形成、谷胱甘肽水平增加、線粒體膜電位改變等,導致多巴胺神經元死亡[21]。因此,維持良好的錳水平非常重要。SOARES等[21]以線蟲為模型發現了參與金屬誘導的神經元變性的分子靶點及金屬與分子靶點之間的新關系,表明有組基因與金屬誘導的神經退行性變有關,如SKN-1、MTL(亞型1和2)和不同的熱休克蛋白。靶向作用于這些基因可能是一種有效地改變神經元脆弱性的方法,從而減緩神經元的損失和臨床癥狀的惡化。

2.1.4百草枯誘導的線蟲模型 由于百草枯的化學結構類似于1-甲基-4-苯基吡啶[22],也具有氧化還原性質,與分子氧在細胞內反應形成大量超氧自由基,會導致線蟲行動遲緩、多巴胺神經元丟失、線粒體結構損傷、腺苷三磷酸消耗并增加自噬[23]。該模型除用于PD研究外,也常用于抗衰老及抗氧化研究,用百草枯作為自由基引發劑探討線蟲在氧化脅迫后藥物對生物體的抗氧化作用。在線蟲體內胰島素/胰島素樣生長因子-1(IGF-1)信號通路是一條進化上保守的內分泌通路,能調節各種生物的壽命并讓生物在受迫的條件下存活,基因daf-2、daf-16在線蟲胰島素信號途徑具有至關重要地位,對線蟲的抗衰老和延長壽命發揮著關鍵作用。有研究表明,芫荽水提物可顯著影響胰島素/IGF-1信號通路氧化衰老有關基因的表達量,提高線蟲的壽命[24]。劉靜等[25]研究表明,百草枯會導致線蟲衰老相關基因daf-16、sod-3、ctl-1、hsp16.2以及哺乳動物Nrf2同源物(skn-1) m RNA表達水平顯著下調,而金釵石斛總生物堿可改善衰老線蟲模型的移動能力,減少脂褐素沉積,提高蟲體內超氧化物歧化酶活力,上調daf-16、skn-1基因發揮延緩衰老的作用。這些研究結果也許能為深入探究衰老機制找到突破口。

2.1.5轉基因線蟲模型 線蟲的基因組是第一個被完全測序的多細胞生物體,利用相關遺傳學操作[正向遺傳學篩選、反向遺傳學核糖核酸干擾(RNAi)篩選]很容易獲得攜帶PD基因的線蟲模型。α-syn是家族性和特發性PD一個重要的發病因素,現已發現了多個與PD相關的基因,如PARK1、PARK2、PARK5、PARK6、PARK7、PARK8、PARK9、PARK11和PARK13。在線蟲中發現了6個同源基因,但不包括編碼α-syn的PARK1,這個特性允許建立過表達人源α-syn的野生型或突變型線蟲模型,而不用考慮內源性α-syn的影響,簡化了實驗條件[26]。α-syn過表達可導致線蟲運動減少、多巴胺能神經元減少、樹突減少及神經元傳遞中斷增多,在多巴胺能神經元中過表達會誘導線蟲產生漸進性、時間依賴性神經退行性疾病和運動缺陷[27]。TYSON等[28]用BiFC-syn線蟲模型研究α-syn在神經元間的轉移機制發現,自噬/溶酶體途徑是α-syn轉移的主要因素,自噬的破壞會導致α-syn積累的凈增加。相關基因的突變,如catp-6/ATP13A2和lrk-1(lrrk2)會損害自噬,而vps-35的突變則會損害逆轉錄物傳遞必要的溶酶體酶的能力,影響溶酶體功能。而djr-1.2(dj-1)、pink-1、pdr-1(parkin)、ATP13A2是調節活性氧和線粒體健康的重要基因,也是調控PD的重要基因。最近幾年為更加準確地研究單個基因的作用,促使靶向基因編輯技術迅速發展大大推進了線蟲反向遺傳學研究,包括Cre/Lox P和FRT/FLP重組酶技術、Mos1轉座子技術、ZFNs技術、TALENs技術和CRISPR/Cas9技術。這些技術使用靶向特定DNA序列的重組酶、轉座酶和核酸酶,方便了研究特定基因在線蟲細胞功能的行使,以及線蟲個體生長、發育過程中的作用,更好地找到疾病的治療靶點[29]。

2.2線蟲模型在PD運動功能評價方面的應用 PD表現出的運動障礙主要與多巴胺能回路有關,多巴胺能回路損傷直接影響線蟲的以下幾種行為,常用的評價線蟲多巴胺依賴行為的測試如下[30-31]。

2.2.1基礎減慢或食物感知行為 通常情況下線蟲在有細菌食物的情況下爬行比沒有食物時更慢,但當多巴胺信號中斷時阻止了線蟲在有食物時減慢的能力,從而使爬行速度加快。為測量線蟲的基礎減慢行為,先在緩沖液中清洗然后轉移到有或沒有細菌的瓊脂平板上,記錄20～60 s線蟲身體彎曲的頻率。基礎減慢率=(無食物的運動速率-有食物的運動速率)/ 有食物的運動速率[32]或=(有細菌存在時線蟲的運動速率/沒有細菌存在時線蟲的運動速率)×100[33]。

2.2.2趨化性測試 線蟲可感知環境中引起吸引或排斥趨化性的化學線索。在實驗室條件下線蟲會遠離接觸乙醇,然而當持續暴露于乙醇中時線蟲會對乙醇產生耐受性和偏好,這種反應是由多巴胺系統控制的。乙醇趨化性試驗是將瓊脂平板分為2個象限,在其中一個象限中加入乙醇,將線蟲轉移到測試板上,使其自由探索30 min。為評估目標化學物的效果對目標象限和對照象限中的線蟲進行量化,計算偏好指數=(乙醇象限的線蟲數量-對照象限的線蟲數量)/測試線蟲總數。復方壬醇也有類似的效果,其引起強烈的負趨化反應,這種對壬醇厭惡氣味的反應受多巴胺信號調節[34]。當體內多巴胺含量減少時線蟲需更長的時間對化學刺激做出反應,這個測試可間接測量線蟲體內的多巴胺含量。

2.2.3區域限制搜索行為 其行為是一種覓食行為,線蟲在一定區域內尋找食物時會頻繁地轉換角度,當無法找到食物時其會擴大搜索區域。線蟲的覓食軌跡由寬闊的弧線組成,這種方式提高了覓食效率,這也是一種涉及多巴胺信號傳導的目標定向行為,去除或破壞多巴胺能神經元可導致該行為異常或消失。將喂養良好的線蟲轉移到沒有食物的瓊脂平板上并在轉移后5、30 min后錄像60 s,分析每條線蟲的軌跡,計算每個時間點軌跡角度大于90°的轉彎次數。

2.2.4游泳性癱瘓測試 將健康線蟲置于在液體中,最初蟲體會劇烈拍打,但在拍打約6 min后會表現出“癱瘓”,即一種游泳性癱瘓的現象。多巴胺能功能受損的線蟲,如酪氨酸羥化酶突變體線蟲是不會顯示出這種行為的,表明內源性多巴胺是調控拍打行為所必需的神經信號。該試驗在L4幼蟲期階段的線蟲中很容易觀察到,但隨著年齡的增長這種現象會變得不那么明顯。

2.2.5其他 還有研究對線蟲的頭部擺動頻率、身體彎曲頻率、排便頻率、繁殖力及在固體板上的爬行速度進行了分析,以評價其他多巴胺依賴行為能力。

3 線蟲模型的局限性

線蟲是一種很有價值的模式生物,但也具有一定局限性。線蟲的生理結構與人具有一定差距,無法模擬或不能完全模擬人類疾病的病理過程[35]。如線蟲沒有心臟、血管、呼吸系統、免疫系統等,成蟲的體細胞是有絲分裂后產生的。此外線蟲缺乏同源性α-syn,神經元的連接與人類不同,一些分子途徑不存在。利用線蟲對多巴胺神經元進行分子生物學實驗具有一定挑戰,這也使線蟲在模擬人類疾病方面具有一定局限性。

4 展 望

線蟲是研究PD發病機制及新藥篩選的一種極好的模式生物,神經系統結構簡單,神經行為多樣,基因組完全被測序,可很好地研究單個基因在PD中的作用,結果與哺乳動物具有可比性。除PD外,線蟲也適合研究阿爾茨海默病、亨廷頓病、衰老、癡呆、運動障礙等疾病。

線蟲體積小且研究成本較低,適合進行高通量藥物篩選,這是目前嚙齒類動物所無法實現的。2021年SOHRABI等[36]發現,RNAi-介導的線蟲神經元支鏈氨基酸轉移酶1的敲低會隨著年齡的增長而導致異常的痙攣樣“卷曲”行為,而對導致線蟲PD樣卷曲功能障礙的修飾物進行大規模篩選可能揭示新的疾病機制,并確定潛在的治療方法。所以,該學者創建了一個基于機器學習算法的線蟲快照分析平臺量化線蟲的行為表型,通過該平臺已確定了幾種現有藥物作為潛在治療PD的候選藥物。平臺不僅用于支鏈氨基酸轉移酶1敲低線蟲,還可用于研究其他RNAi處理或其他遺傳株線蟲卷曲、近卷曲和非卷曲的游泳姿勢(如膽堿能突變體cha-1和unc-17)。近年來,還發展了一項新技術——微流控芯片技術[37-38],其具有控制精確、靈活集成和自動化等優勢,適用于采用線蟲模型對高通量、高內涵藥物進行毒性篩選研究,以探究神經元活動與行為學間的聯系,對PD的診治具有重大意義。在我國有大量研究利用線蟲進行抗PD中藥活性成分的評價與篩選,而這些新技術的開發與應用對研究PD具有重大意義,也將促進傳統中藥及天然化合物的發展。